劉洋 孟玲 范思佳 任春光 張歡

（重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞與遺傳教研室發(fā)育生物學(xué)研究室，重慶 400016）

中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）是一種絲氨酸蛋白酶，儲(chǔ)存在中性粒細(xì)胞嗜天青顆粒中［1］。NE最初被認(rèn)為其主要功能是與髓過(guò)氧化物酶和NADPH氧化酶復(fù)合物產(chǎn)生的活性氧協(xié)作，參與吞噬溶酶體中入侵病原體的殺傷［1］。近年來(lái)，NE參與炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)的其他作用逐漸被報(bào)道，中性粒細(xì)胞由外界激活，脫粒時(shí)釋放大量NE，釋放的一部分NE以活性形式結(jié)合在質(zhì)膜的外表面，可溶性和膜結(jié)合的NE通過(guò)蛋白水解切割多種趨化因子、細(xì)胞因子、黏附分子和細(xì)胞表面的活性受體，進(jìn)而參與細(xì)胞的趨化、黏附等生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)［2］。除此之外，NE還作為中性粒細(xì)胞外捕獲網(wǎng)的組成，在清除入侵病原體和造成組織損傷的過(guò)程中扮演重要角色。

中性粒細(xì)胞的迅速募集是先天免疫反應(yīng)的關(guān)鍵，也是急性炎癥的標(biāo)志性事件［3］。盡管目前對(duì)于中性粒細(xì)胞遷移到炎癥部位的級(jí)聯(lián)反應(yīng)已經(jīng)有了大量的研究，建立起了包括滾動(dòng)、黏附、爬行、跨內(nèi)皮遷移、跨基底膜遷移以及間質(zhì)遷移在內(nèi)的中性粒細(xì)胞炎癥募集級(jí)聯(lián)學(xué)說(shuō)［4］。NE一度被認(rèn)為通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)與基底膜促進(jìn)中性粒細(xì)胞的炎性募集［5］，但ROSENGREN等［6］及ISHII等［7］指出NE的敲除并不影響中性粒細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，可見(jiàn)NE在中性粒細(xì)胞炎性募集中的功能還存在爭(zhēng)議。

因此，理清NE在中性粒細(xì)胞炎性募集級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中的具體作用，對(duì)明確中性粒細(xì)胞遷移動(dòng)力學(xué)以及探索中性粒細(xì)胞主導(dǎo)炎癥的靶向藥物篩選至關(guān)重要。本研究旨在系統(tǒng)性探索NE對(duì)中性粒細(xì)胞炎性募集級(jí)聯(lián)反應(yīng)各關(guān)鍵步驟的調(diào)控，及其對(duì)中性粒細(xì)胞病原體殺傷功能的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 小鼠胰島內(nèi)皮細(xì)胞系（MS-1）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)； N-甲酰-蛋氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸（N-formyl-Met-Leu-Phe， f-MLF）、西維來(lái)司鈉鹽水合物購(gòu)自Sigma公司；重組小鼠TNF-α、重組小鼠GMCSF購(gòu)自Peprotech公司；D-hanks平衡鹽溶液、牛纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)N）、D-PBS緩沖液、牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）、辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）、異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）、Hanks平衡鹽溶液（HBSS）、羥乙基呱嗪乙硫磺酸溶液（Hepes）、二甲基亞砜（DMSO）、RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Solarbio公司；胎牛血清購(gòu)自BI Bioscience公司；Percoll購(gòu)自Cytiva公司；魯米諾（Luminol）、異魯米諾（Isoluminol）購(gòu)自CTI公司；磷酸肌球蛋白輕鏈2-Ser19（pMLC）小鼠單克隆抗體購(gòu)自CST公司；山羊抗小鼠IgG（H+L）耦聯(lián)647紅色熒光二抗、細(xì)胞遠(yuǎn)紅外標(biāo)記（Far Red）購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；微絲綠色熒光探針（Actin-Tracker Green-488）、抗熒光淬滅封片劑（含DAPI）、細(xì)胞膜紅色熒光探針（Dil）、羧基熒光素二乙酸琥珀酰亞胺酯（carboxyfluorescein diacetate，CFSE）、臺(tái)盼藍(lán)購(gòu)自Beyotime Biotechnology公司；4%多聚甲醛購(gòu)自Sangon Biotech公司；流動(dòng)池裝置購(gòu)自GlycoTech公司；細(xì)胞體外遷移小室（Dunn chamber 16802）購(gòu)自HAWKSLEY公司；DMi8倒置熒光顯微鏡、SP8 激光共聚焦顯微鏡（Leica）；Infinite Pro 200酶標(biāo)儀（Tecan）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡SPF級(jí)C57BL/6N小鼠，17～23 g，購(gòu)自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司［SCXK（浙）2019-0001］。本研究所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（IACUCCQMU-2024-0111），小鼠飼養(yǎng)在25 ℃、12 h光/暗循環(huán)的SPF環(huán)境中，自由飲食，所有小鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)，所有小鼠斷頸處理后分離骨髓。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組 小鼠骨髓來(lái)源的中性粒細(xì)胞隨機(jī)分為兩組，添加終濃度為10 μmol/L的西維來(lái)司鈉鹽（標(biāo)記為SIVE組）或1‰DMSO（標(biāo)記為DMSO組），兩組細(xì)胞均在37 ℃、5%CO2條件下，于含有10%熱滅活胎牛血清和25 ng/ml重組小鼠GM-CSF的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h。

1.2.2 小鼠骨髓來(lái)源中性粒細(xì)胞的分離 骨髓用于分離小鼠中性粒細(xì)胞。在Hanks-1緩沖液［Hanks平衡鹽溶液（HBSS）+0.5%牛血清白蛋白+10 mmol/L HEPES］中收獲小鼠骨髓細(xì)胞，紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，進(jìn)行Percoll不連續(xù)密度梯度離心。從分布在Percoll的81%和60%層間收集中性粒細(xì)胞。

1.2.3 體內(nèi)腹膜炎模型檢測(cè)細(xì)胞過(guò)繼性遷移 提前1.5 h，向小鼠腹腔注射1 ml濃度為1 mg/ml的酵母多糖懸液，誘導(dǎo)無(wú)菌腹膜炎；將DMSO組和SIVE組中性粒細(xì)胞分別以0.8 μmol/L CFSE和0.2 μmol/L Far Red標(biāo)記，將兩種細(xì)胞1∶1混合后冰上靜置1 h，向每只腹膜炎小鼠單側(cè)眼眶后靜脈竇注射5×107個(gè)混合標(biāo)記細(xì)胞；6 h后從對(duì)側(cè)眼眶后靜脈竇收集外周血，并以預(yù)冷的D-PBS灌洗小鼠腹腔，收集腹膜灌洗液。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)遷移到外周血及腹膜灌洗液中DMSO預(yù)處理 （CSFE標(biāo)記）或SIVE預(yù)處理（Far Red標(biāo)記）的中性粒細(xì)胞比例。

1.2.4 細(xì)胞體外趨化 以FITC監(jiān)測(cè)催化劑f-MLF濃度梯度，使用5 μmol/L Dil標(biāo)記SIVE預(yù)處理的中性粒細(xì)胞，并將其1∶1混合接種在100 μg/ml FN預(yù)包被的玻片上，等待細(xì)胞黏附30 min。組裝好細(xì)胞體外遷移小室Dunn chamber，中性粒細(xì)胞會(huì)沿f-MLF濃度梯度在遷移小室中發(fā)生趨化性遷移，以30 s間隔采集30 min所有的延時(shí)圖像序列，并使用Image J和Chemotaxis And Migration Tools對(duì)單個(gè)細(xì)胞趨化路徑進(jìn)行分析。

1.2.5 細(xì)胞黏附流動(dòng)室實(shí)驗(yàn) 將小鼠胰島內(nèi)皮細(xì)胞 MS-1接種在100 μg/ml FN預(yù)包被的3.5 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿上并生長(zhǎng)至匯合，在37 ℃下采用濃度為50 ng/ml的TNF-α預(yù)處理4 h。D-PBS洗滌MS-1的培養(yǎng)皿，并將其置于流動(dòng)室裝置中。分別用1 μmol/L CFSE和5 μmol/L Dil標(biāo)記DMSO或SIVE組細(xì)胞，按1∶1的比例混合后，以0.4 dyn/cm2的剪切流速流入。然后在熒光顯微鏡下觀察黏附細(xì)胞并計(jì)數(shù)，每組計(jì)數(shù)10個(gè)視野。

1.2.6 細(xì)胞伸展 100 μg/ml終濃度的FN包被玻片過(guò)夜，Hanks洗滌玻片2次，封閉緩沖液（Hanks+0.25%BSA）封閉30 min，Hanks洗滌玻片2次，無(wú)塵紙蘸干水分，玻片放入6孔板中備用。細(xì)胞懸液在接種玻片上等待貼附15 min，終濃度為10 μmol/L f-MLF嚴(yán)格刺激2 min后用4%多聚甲醛固定后用含DAPI的封片劑封片，每組采用Image J計(jì)數(shù)不少于100顆伸展之后的細(xì)胞面積。

1.2.7 中性粒細(xì)胞極化 100 μg/ml終濃度FN包被玻片3 h，D-PBS洗滌玻片3次。細(xì)胞懸液接種在玻片上等待貼附15 min，終濃度為10 μmol/L的f-MLF嚴(yán)格刺激2 min后4%PFA固定。1∶200稀釋兔抗小鼠p-MLC一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，1∶200稀釋山羊抗鼠耦連647紅色熒光二抗避光孵育1 h，D-PBS清洗之后，綠色微絲熒光探針避光孵育45 min，D-PBS洗滌后用含DAPI抗熒光淬滅劑封片。

1.2.8 活性氧（ROS）釋放 100 μg/ml FN預(yù)包被96孔板5 h，D-PBS清洗后備用；加入細(xì)胞懸液和HRP及Isoluminol、Luminol配制的反應(yīng)工作液；室溫放置5 min后讀板檢測(cè)本底值；隨后加入f-MLF刺激劑，立刻讀取化學(xué)發(fā)光值，計(jì)算ROS釋放動(dòng)力學(xué)曲線。

1.2.9 細(xì)胞吞噬作用 終濃度為0.5 mg/ml的FITC和熱滅活的銅綠假單胞菌室溫下孵育20 min以標(biāo)記細(xì)胞，D-PBS洗滌3次去除多余染料；在含20%小鼠血清的D-PBS中37 ℃孵育30 min以調(diào)理細(xì)菌，細(xì)胞與細(xì)菌按1∶50比例，在37 ℃下共孵育30 min，用0.4%臺(tái)盼藍(lán)淬滅黏附在細(xì)胞表面的FITC熒光，流式細(xì)胞儀檢測(cè)中性粒細(xì)胞吞噬熒光標(biāo)記的銅綠假單胞菌比例。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均使用GraphPad Prism軟件版本9.0繪制和分析，數(shù)據(jù)均采用3個(gè)及以上獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的±s，兩組數(shù)據(jù)用t檢驗(yàn)法分析，多組采用One-way ANOVA分析，組間采用Two-way ANOVA分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NE調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞炎性募集 如圖1A所示，在小鼠外周血中回收到了相近數(shù)目的DMSO或SIVE預(yù)處理的中性粒細(xì)胞，但腹膜灌洗液中回收到的SIVE預(yù)處理后的中性粒細(xì)胞數(shù)目與DMSO組相比顯著降低（P＜0.001，圖1B），提示NE的抑制顯著減少中性粒細(xì)胞在體內(nèi)的炎性募集。

圖1 NE在腹膜炎模型中對(duì)中性粒細(xì)胞過(guò)繼性遷移的影響Fig.1 Effect of elastase on adoptive migration of NE in peritonitis model

2.2 NE對(duì)中性粒細(xì)胞趨化的影響 采用Dunn Chamber評(píng)估NE是否影響中性粒細(xì)胞對(duì)催化劑濃度梯度的感知能力及體外定向趨化能力（圖2A、B）。Dunn Chamber時(shí)間序列圖像顯示，NE的抑制不僅降低了中性粒細(xì)胞順從催化劑f-MLF濃度梯度的遷移速度（P＜0.05，圖2C）、干擾了中性粒細(xì)胞遷移方向性（P＜0.05，圖2D），同時(shí)縮短了遷移距離（P＜0.05，圖2E、F），表明抑制NE減弱了f-MLF誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞趨化能力。

圖2 NE對(duì)中性粒細(xì)胞體外趨化的影響Fig.2 Effect of elastase on chemotaxis of NE in vitro

2.3 NE對(duì)中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附的影響 與DMSO預(yù)處理組相比，SIVE預(yù)處理后的中性粒細(xì)胞在存在持續(xù)性的流動(dòng)剪切應(yīng)力的情況下，黏附在TNF-α預(yù)處理的小鼠內(nèi)皮細(xì)胞上的數(shù)目顯著降低（P＜0.000 1，圖3A、B），即抑制NE顯著減弱中性粒細(xì)胞對(duì)發(fā)炎內(nèi)皮細(xì)胞的黏附能力。

圖3 NE對(duì)中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附的影響Fig.3 Effect of NE on adhesion of neutrophils to endothelial cells

2.4 NE對(duì)中性粒細(xì)胞伸展的影響 評(píng)估兩組細(xì)胞伸展能力的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在伸展過(guò)程中，兩組細(xì)胞具有相似的形態(tài)和相似的面積，即使外源性添加了刺激劑f-MLF，兩組細(xì)胞仍然具有類似的伸展形變模式（P＞0.05，圖4A、B），即抑制NE對(duì)中性粒細(xì)胞的伸展能力無(wú)顯著影響。

圖4 NE對(duì)中性粒細(xì)胞伸展的影響Fig.4 Effect of NE on neutrophil extension

2.5 NE對(duì)中性粒細(xì)胞極化的影響 結(jié)果顯示，無(wú)論是靜息或f-MLF刺激后，DMSO或SIVE預(yù)處理后的中性粒細(xì)胞具有相似的極化現(xiàn)象與極化比例，即抑制NE對(duì)中性粒細(xì)胞的極化無(wú)顯著影響（P＞0.05，圖5A～C）。

圖5 NE對(duì)中性粒細(xì)胞極化的影響Fig.5 Effect of NE on the polarization of neutrophils

2.6 NE對(duì)中性粒細(xì)胞ROS釋放的影響 結(jié)果顯示，NE的抑制對(duì)中性粒細(xì)胞外（圖6A、B）及總ROS（圖6C、D）的釋放無(wú)顯著影響（P＞0.05）。

圖6 NE對(duì)中性粒細(xì)胞ROS釋放的影響Fig.6 Effect of NE on ROS release in neutrophils

2.7 NE對(duì)中性粒細(xì)胞體外吞噬細(xì)菌的影響 結(jié)果顯示，抑制NE可顯著降低中性粒細(xì)胞吞噬細(xì)菌的能力（P＜0.05，圖7）。

圖7 NE對(duì)中性粒細(xì)胞體外吞噬細(xì)菌的影響Fig.7 Effect of elastase on phagocytosis of NE in vitro

3 討論

本研究系統(tǒng)性探索了NE在中性粒細(xì)胞炎癥募集級(jí)聯(lián)反應(yīng)各個(gè)環(huán)節(jié)的獨(dú)立作用。研究結(jié)果顯示，抑制NE顯著減少了中性粒細(xì)胞黏附在發(fā)炎內(nèi)皮上的數(shù)目，影響了中性粒細(xì)胞對(duì)催化劑濃度梯度的感知，降低了趨化速率及距離并最終導(dǎo)致中性粒細(xì)胞體內(nèi)炎性募集及吞噬能力的損害；進(jìn)一步，本研究發(fā)現(xiàn)F-actin及p-MLC的極化不受NE的影響，排除了F-actin聚合減少及細(xì)胞極性建立異常在此過(guò)程中的貢獻(xiàn)，且NE的抑制對(duì)中性粒細(xì)胞的ROS釋放也無(wú)顯著影響。

中性粒細(xì)胞作為急性炎癥反應(yīng)期率先被招募到損傷部位的先鋒細(xì)胞，對(duì)機(jī)體免疫反應(yīng)具有重要調(diào)節(jié)作用［3］。為了快速到達(dá)損傷部位，中性粒細(xì)胞具有獨(dú)特且迅速的細(xì)胞遷移機(jī)制，到達(dá)損傷部位后中性粒細(xì)胞通過(guò)吞噬、ROS釋放及蛋白酶庫(kù)的釋放等手段消滅入侵的病原體，維持體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)［8］。因此，明確中性粒細(xì)胞的遷移動(dòng)力學(xué)過(guò)程尤為重要。關(guān)于中性粒細(xì)胞遷移，最新鑒定出了多種新的分子相互作用機(jī)制，他們可能參與介導(dǎo)或調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞遷移，對(duì)先天免疫和適應(yīng)性免疫至關(guān)重要［9］。盡管對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)領(lǐng)域的探索在一直深入，但迄今為止，中性粒細(xì)胞遷移過(guò)程中涉及許多特定分子功能作用的報(bào)道仍然存在一些爭(zhēng)議，ROS則是其中的代表分子［10］。

中性粒細(xì)胞NE由于其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞造成損害、切割關(guān)鍵的內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)黏附分子（例如，ICAM-1和VCAM-1）及其水解基底膜和血管外組織成分的能力，被視為導(dǎo)致血管和組織損傷的介質(zhì)［2，11-12］。事實(shí)上，NE的不適當(dāng)釋放與許多炎癥性疾病的病理相關(guān)，例如局部缺血/再灌注損傷和慢性阻塞性肺?。?3-14］。

西維來(lái)司鈉鹽作為現(xiàn)階段唯一投入臨床使用的中性粒細(xì)胞NE特異性抑制劑，在臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中均顯示出良好的NE活性抑制能力［15-16］。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，在許多炎癥模型中西維來(lái)司鈉鹽表現(xiàn)出對(duì)中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的組織損傷具有保護(hù)作用［17］，體外研究也有相似結(jié)果的報(bào)道，即NE抑制劑損害白細(xì)胞的體外遷移［18］，但也有研究給出了相悖的結(jié)論［6］，目前藥理學(xué)抑制劑對(duì)白細(xì)胞特別是中性粒細(xì)胞遷移能力影響的報(bào)道仍具有矛盾性。

考慮到既往研究通常僅關(guān)注中性粒細(xì)胞炎性募集的單個(gè)環(huán)節(jié)，且體外實(shí)驗(yàn)難以完全模擬體內(nèi)細(xì)胞遷移的整體炎癥微環(huán)境。為了排除潛在因素的影響，本研究首先通過(guò)向腹膜炎小鼠眼眶后靜脈竇注射等量不同標(biāo)記的野生型或NE抑制的中性粒細(xì)胞，使兩種細(xì)胞處在完全一致的體內(nèi)炎癥微環(huán)境中，證實(shí)了NE的抑制顯著降低了中性粒細(xì)胞體內(nèi)炎癥募集［19］。在明確了抑制NE對(duì)體內(nèi)募集的影響后，本研究將炎癥募集過(guò)程中的關(guān)鍵步驟進(jìn)行拆分，逐一驗(yàn)證NE對(duì)其是否具有調(diào)控作用?；瘜W(xué)趨化，即細(xì)胞定向遷移，發(fā)生在跨內(nèi)皮和間質(zhì)遷移過(guò)程中［3］。與CAI等［20］報(bào)道拮抗NE阻斷中性粒細(xì)胞的趨化性類似，本研究同樣證實(shí)了NE的抑制損害了中性粒細(xì)胞定向趨化的能力，包括偏移角度的增加、趨化速度的降低，趨化距離的縮短。這將NE對(duì)遷移作用的影響節(jié)點(diǎn)從DELCLAUX等［21］報(bào)道的對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)與基底膜的降解提前到了定向趨化。本研究進(jìn)一步探索了定向趨化的前置步驟——牢固黏附，有效的免疫反應(yīng)取決于白細(xì)胞迅速?gòu)纳眢w的一個(gè)位置移動(dòng)到另一個(gè)位置的能力；中性粒細(xì)胞在血管中面臨血液流動(dòng)帶來(lái)的剪切應(yīng)力，在遇到激活分子（如受到炎癥因子刺激后的內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的趨化因子）時(shí)通過(guò)整合素黏附，以駐留在內(nèi)皮細(xì)胞表面，流動(dòng)室實(shí)驗(yàn)在最大程度上模擬了這個(gè)過(guò)程，等量差異標(biāo)記的DMSO或SIVE預(yù)處理后的中性粒細(xì)胞，通過(guò)流動(dòng)室流經(jīng)炎癥因子預(yù)處理的內(nèi)皮細(xì)胞，在持續(xù)性剪切應(yīng)力的條件下，NE抑制的中性粒細(xì)胞黏附在內(nèi)皮細(xì)胞上的數(shù)目顯著變少［22］。以上結(jié)果可能歸因于中性粒細(xì)胞受到炎癥因子刺激后，分泌到細(xì)胞外環(huán)境中或結(jié)合在質(zhì)膜外表面的NE活性被抑制，進(jìn)而無(wú)法對(duì)趨化因子、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞表面的活性受體進(jìn)行正確加工，最終導(dǎo)致中性粒細(xì)胞黏附及趨化異常［23-24］。

此外，細(xì)胞的伸展形變是中性粒細(xì)胞黏附和沿血管遷移以及間質(zhì)組織遷移的初始步驟，由此本研究檢測(cè)了中性粒細(xì)胞伸展形變的形態(tài)與面積［4］。但無(wú)論是否存在f-MLF刺激，DMSO或SIVE預(yù)處理的中性粒細(xì)胞都具有類似的伸展能力。肌動(dòng)蛋白是中性粒細(xì)胞伸展形變的關(guān)鍵參與者，肌動(dòng)蛋白多聚化可直接促進(jìn)細(xì)胞伸展形變，與前一部分研究結(jié)果相一致，NE的抑制并沒(méi)有影響F-actin的聚合，兩種細(xì)胞具有相似的F-actin極化比例［25］?？紤]到細(xì)胞極化是細(xì)胞發(fā)生遷移性行為的前提條件，極化的方向性也決定了細(xì)胞遷移的方向［26-27］。但REN等［26］報(bào)道化學(xué)信號(hào)的刺激并不是引起中性粒細(xì)胞骨架極化的充要條件，而是細(xì)胞貼附引起的形變即誘導(dǎo)了細(xì)胞最初極性的建立。由此，本研究探索了外源性化學(xué)信號(hào)刺激時(shí)DMSO或SIVE預(yù)處理對(duì)中性粒細(xì)胞極化的影響，結(jié)果顯示無(wú)論是否添加f-MLF，NE抑制均影響中性蛋白酶的極化?？傊?，NE抑制中性粒細(xì)胞體內(nèi)炎癥募集可能依賴于阻止了膜結(jié)合NE對(duì)細(xì)胞表面趨化因子受體的切割這種獨(dú)立于F-actin的途徑發(fā)生。隨后，本研究回歸到了NE與中性粒細(xì)胞免疫學(xué)功能的串?dāng)_，既往研究報(bào)道中性粒細(xì)胞ROS的釋放可能是細(xì)胞伸展形變的下游表型［28］，與之一致的是，本研究并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)NE的抑制對(duì)中性粒細(xì)胞ROS的釋放有顯著影響。與YOUNG等［29］報(bào)道NE的敲除影響中性粒細(xì)胞吞噬功能一致，本研究同樣觀察到NE的抑制損害了中性粒細(xì)胞的吞噬功能，對(duì)吞噬的影響可能是由于NE抑制后對(duì)中性粒細(xì)胞感知病原體的表面分子無(wú)法進(jìn)行正確的切割導(dǎo)致參與吞噬作用的受體（如CD14、CD206）異常，最終引發(fā)吞噬能力減弱［30］。

綜上所述，本研究探索了NE在中性粒細(xì)胞體內(nèi)炎性募集各個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)的作用，通過(guò)體內(nèi)腹膜炎過(guò)繼性遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)合體外Dunn Chamber與流動(dòng)室實(shí)驗(yàn)對(duì)體內(nèi)遷移過(guò)程的模擬，將NE影響中性粒細(xì)胞募集可能環(huán)節(jié)從既往報(bào)道的跨基底膜遷移前移到了牢固黏附。但本研究仍然缺乏對(duì)炎性募集過(guò)程中中性粒細(xì)胞表面受體的定量分析，同時(shí)也需要遺傳NE缺陷模型和更詳細(xì)的機(jī)制研究來(lái)進(jìn)一步鞏固以上發(fā)現(xiàn)。本研究系統(tǒng)性地報(bào)道了中性粒細(xì)胞經(jīng)由藥理學(xué)抑制劑處理后對(duì)中性粒細(xì)胞炎癥募集各個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)的影響，為闡明中性粒細(xì)胞遷移動(dòng)力學(xué)，尋找干預(yù)中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥疾病靶向藥物的篩選提供了分子基礎(chǔ)。