查潔 江婷婷 郭俊巧 肖幀 姚根宏 （.南京鼓樓醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，南京 20008；2 安慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，安慶 26052；.南京中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院，南京 20008；.南京大學(xué)金陵學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，南京 20089）

原發(fā)性干燥綜合征（primary Sj?gren's syndrome，pSS）是一種慢性自身免疫性疾病，以唾液腺和淚腺功能障礙和破壞為特征，還可累及其他重要器官，如肝臟、腎臟和肺等，出現(xiàn)復(fù)雜的臨床表現(xiàn)［1-2］。肝臟是pSS常見的非外分泌腺作用靶點(diǎn)，患者可表現(xiàn)為乏力、黃疸、惡心、納差、嘔吐、皮膚瘙癢、肝區(qū)不適、腹脹和肝功能異常等癥狀［3］。不同患者肝損傷程度不一，有些癥狀輕微受重視程度不足而延誤治療，有些則較為嚴(yán)重甚至危及生命［4］。因此，pSS肝臟損傷不容忽視，明確pSS肝損傷發(fā)病機(jī)制、早期診斷、及時(shí)治療對于改善pSS預(yù)后有重要意義。但是，目前對pSS患者肝臟受累的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。

研究表明白細(xì)胞介素等細(xì)胞因子在pSS發(fā)病中發(fā)揮重要作用。白細(xì)胞介素-12（IL-12）主要由活化的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，在T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用［5］。IL-12通過引起淋巴亞群的紊亂、多種細(xì)胞因子表達(dá)失衡，與多數(shù)自身免疫病的發(fā)生密切相關(guān)，在一些常見自身免疫性疾病的發(fā)生中發(fā)揮重要致炎作用，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病、克羅恩病、pSS等［6-7］。既往研究表明，外源性注射重組小鼠IL-12加重小鼠pSS癥狀，注射抗IL-12抗體可以減輕小鼠pSS癥狀［8-9］。但是，IL-12是否參與pSS的肝臟病變及其機(jī)制尚不清楚。有大量研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激發(fā)生在多種自身免疫性疾病中，比如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性硬化癥、pSS等，伴隨著活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生，促進(jìn)了病情進(jìn)展［10-11］。pSS患者唾液腺、淚腺功能損傷的原因，均可能涉及氧化應(yīng)激，而IL-12具有調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的功能。因此，本研究旨在明確IL-12是否通過促進(jìn)氧化應(yīng)激參與pSS肝臟病變的發(fā)生，從而探討pSS肝損害的發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性C57BL/6小鼠、雌性NOD小鼠購自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所。IL-12KO NOD小鼠為南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所繁配。所有小鼠均飼養(yǎng)在南京醫(yī)科大學(xué)鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心SPF級(jí)環(huán)境中。實(shí)驗(yàn)于南京醫(yī)科大學(xué)鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)獲得南京醫(yī)科大學(xué)鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院動(dòng)物保護(hù)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(實(shí)驗(yàn)倫理號(hào):20191021)。

1.1.2 試劑及材料 小鼠肝癌細(xì)胞系Hepa1-6及DMEM培養(yǎng)基（武漢普諾賽生命科技有限公司）；Mouse IL-12 ELISA試劑盒（杭州聯(lián)科生物有限公司）；Recombinant Murine IL-12p70（美國Peprotech公司）；Cell Counting Kit-8（廣州賽庫生物）；JAK2 和TYK2抑制劑（MCE公司）；過氧化氫酶（CAT）、還原型谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPX）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠唾液流率檢測 小鼠麻醉后，腹腔注射100 μl毛果蕓香堿（0.1 mg/kg體質(zhì)量），收集小鼠分泌15 min的唾液，計(jì)算唾液流率。

1.2.2 小鼠頜下腺和肝臟病理 取小鼠頜下腺及肝臟組織，4%多聚甲醛固定，進(jìn)行脫水、石蠟包埋和切片，再經(jīng)過脫蠟、復(fù)水、蘇木精染色和伊紅染色、脫水、封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 小鼠肝功能檢測 分離小鼠血清，按GOT、GPT檢測試劑盒說明書進(jìn)行。具體步驟如下：加入基質(zhì)液、待測樣本，37 ℃反應(yīng)30 min后，加入2-4二硝基苯肼，37 ℃反應(yīng)20 min后，加入終止液。酶標(biāo)儀讀取各樣本510 nm處的吸光度值，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣本數(shù)值。

1.2.4 ELISA測定血清和肝臟中IL-12水平 采用ELISA法檢測小鼠血清和肝臟組織中IL-12水平。檢測方法嚴(yán)格按IL-12試劑盒說明書操作。

1.2.5 小鼠肝癌細(xì)胞培養(yǎng)和處理 小鼠肝癌細(xì)胞（Hepa1-6細(xì)胞）采用含有1 mmol/L丙酮酸鈉、10%FBS和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至90%左右，采用0.25%胰酶-EDTA消化細(xì)胞，接種至24孔板，并加入不同濃度重組小鼠IL-12（終濃度為0、2.5、5、10、20、40 ng/ml）和JAK2、TYK2抑制劑。24 h后留取培養(yǎng)上清，待測各種氧化應(yīng)激指標(biāo)。

1.2.6 CCK-8檢測細(xì)胞增殖 將Hepa1-6細(xì)胞按照100 μl/孔接種至96孔培養(yǎng)板，分別加入不同濃度（0、2.5、5、10、20、40 ng/ml）的重組小鼠IL-12，培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μl CCK-8試劑，將培養(yǎng)板繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中孵育4 h，用酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光度。

1.2.7 血清、肝臟勻漿和培養(yǎng)上清中氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 檢測小鼠血清、肝臟組織勻漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中SOD、CAT、GSH、GSH-PX和MDA 5項(xiàng)氧化應(yīng)激指標(biāo)，具體檢測方法按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并作圖，多組數(shù)據(jù)間比較進(jìn)行單因素方差分析，兩組間進(jìn)行t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠IL-12、頜下腺和肝臟病變情況比較 小鼠血清和肝臟勻漿中IL-12檢測結(jié)果顯示，與B6小鼠相比，同周齡pSS小鼠（NOD小鼠）血清和肝臟勻漿中IL-12水平明顯升高［B6vsNOD，血清（29.93±1.81） pg/mlvs（77.31±11.19） pg/ml；肝臟勻漿（181.2±12.67） pg/mlvs（256.90±36.53） pg/ml］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1A、B）。比較小鼠的唾液流率、GPT和GOT，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與B6組小鼠相比，NOD小鼠唾液流率明顯下降；IL-12基因敲除NOD（IL-12KO NOD）小鼠唾液流率較野生型NOD小鼠唾液流率明顯增加（圖1C）。與B6和IL-12KO NOD小鼠相比，NOD小鼠的GPT明顯增加（圖1D）。NOD小鼠的GOT明顯高于B6小鼠（P＜0.05），較IL-12KO NOD小鼠也有增加的趨勢（圖1E）。頜下腺和肝臟病理結(jié)果顯示，B6小鼠頜下腺和肝臟中無淋巴細(xì)胞浸潤，NOD小鼠的頜下腺和肝臟中可見明顯的淋巴細(xì)胞浸潤，而IL-12KO NOD小鼠的頜下腺和肝臟中浸潤的淋巴細(xì)胞很少（圖1F、G）。

圖1 各組小鼠IL-12、肝功能、頜下腺及肝臟病變情況比較Fig.1 Comparison of IL-12， liver function， submandibular glands and liver lesions in mice of each group

2.2 各組小鼠血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 小鼠血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測結(jié)果顯示，與B6小鼠相比，NOD小鼠CAT、GSH-PX、SOD活力明顯降低［CAT（65.19±19.37） U/mlvs（7.99±3.89） U/ml；GSH-PX（283.60±5.42） U/mlvs（215.50±22.42） U/ml；SOD （25.71±1.76） U/mlvs（20.89±0.78） U/ml，P＜0.05］，見圖2；IL-12KO NOD小鼠血清GSH-PX較野生型NOD小鼠明顯增多（圖2A），IL-12KO NOD小鼠血清CAT和SOD較野生型NOD小鼠有增加的趨勢（圖2B、C），但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 各組小鼠血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)比較Fig.2 Comparison of oxidative stress indexes in serum of mice of each group

2.3 IL-12對小鼠肝細(xì)胞增殖及氧化應(yīng)激的影響應(yīng)用不同濃度的重組小鼠IL-12處理小鼠肝癌細(xì)胞系，結(jié)果表明2.5、5和10 ng/ml IL-12明顯促進(jìn)Hepa1-6細(xì)胞增殖，20 ng/ml和40 ng/ml IL-12組的促增殖效應(yīng)較10 ng/ml IL-12組下降（圖3A）。因此，選擇2.5、5和10 ng/ml IL-12處理Hepa1-6細(xì)胞，檢測培養(yǎng)上清中氧化應(yīng)激指標(biāo)。研究結(jié)果顯示，不同濃度IL-12處理后，CAT、GSH、GSH-PX和SOD有下降趨勢。與對照組相比，10 ng/ml IL-12處理組培養(yǎng)上清中CAT、GSH、GSH-PX和SOD下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3B～E）。而5 ng/ml和10 ng/ml IL-12處理組MDA顯著高于對照組（圖3F）。

圖3 IL-12作用下小鼠肝細(xì)胞增殖及氧化應(yīng)激情況Fig.3 Effects of IL-12 on proliferation and oxidative stress in hepatocytes of mice

2.4 IL-12通路抑制劑對IL-12處理肝細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 在IL-12處理Hepa1-6細(xì)胞培養(yǎng)液中加入IL-12通路抑制劑（JAK2和TYK2特異性抑制劑），作用24 h后檢測培養(yǎng)上清中氧化應(yīng)激指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，JAK2和TYK2抑制劑能部分逆轉(zhuǎn)IL-12對Hepa1-6細(xì)胞CAT和GSH-PX的降低作用，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4A、B）。IL-12對Hepa1-6細(xì)胞SOD抑制效應(yīng)能被JAK2抑制劑顯著逆轉(zhuǎn)（P＜0.05，圖4C）。IL-12對Hepa1-6細(xì)胞GSH的抑制作用則只能被TYK2抑制劑逆轉(zhuǎn)（P＜0.05，圖4D）。與IL-12處理組相比，JAK2和TYK2抑制劑能顯著降低培養(yǎng)上清中MDA水平（P＜0.05，圖4E）。

圖4 IL-12抑制劑對肝細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響Fig.4 Effects of IL-12 inhibitors on oxidative stress in hepatocytes

3 討論

pSS是一種常見的結(jié)締組織病，以外分泌腺被淋巴細(xì)胞浸潤，導(dǎo)致口干和眼干為主要特征的慢性自身免疫病。pSS可累及多種內(nèi)臟器官，比如肺和肝臟等。研究報(bào)道，約10%pSS患者在病程中出現(xiàn)肝功能異常［12-14］。pSS的肝臟病變機(jī)制不明確，有研究認(rèn)為自身反應(yīng)性免疫先引起肝臟細(xì)胞損傷，然后造成肌成纖維細(xì)胞擴(kuò)增和肝星狀細(xì)胞活化，并最終加速膠原和糖蛋白在肝臟沉積，形成肝纖維化。但是，pSS中引起肝臟細(xì)胞損傷的自身免疫因素尚不清楚。因此，本研究旨在探索引起pSS肝臟病變的具體分子和可能機(jī)制。

NOD小鼠是公認(rèn)的研究pSS的小鼠模型，本結(jié)果顯示NOD小鼠血清肝功能指標(biāo)異常，這與JIANG等［15］的研究結(jié)果一致。另外，本課題組發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟中有淋巴細(xì)胞浸潤，說明肝臟細(xì)胞受到了炎癥損傷。既往研究表明，致炎癥細(xì)胞因子IL-12會(huì)加重NOD小鼠pSS癥狀［8］。但是，IL-12是否與pSS肝臟損傷相關(guān)尚不清楚。本研究檢測了NOD小鼠血清和肝臟中IL-12水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NOD小鼠中IL-12水平明顯升高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與野生型NOD小鼠相比，IL-12基因敲除NOD小鼠的唾液流率明顯增加，頜下腺中炎癥細(xì)胞浸潤數(shù)量和浸潤面積也相應(yīng)減少。以往的研究發(fā)現(xiàn)IL-12轉(zhuǎn)基因小鼠唾液流率降低，唾液腺中淋巴細(xì)胞浸潤灶的數(shù)量、大小均增加，抗SSB/La抗體滴度增加，提示IL-12促進(jìn)了pSS病情的進(jìn)展［16-18］。這與本研究結(jié)論一致。另外，本研究發(fā)現(xiàn)IL-12基因敲除NOD小鼠肝功能指標(biāo)，GPT和GOT也較野生型NOD小鼠改善，肝臟中浸潤的淋巴細(xì)胞也明顯減少。以上結(jié)果提示IL-12可能加重NOD小鼠pSS及其肝臟病變。

研究發(fā)現(xiàn)多種自身免疫性疾病中存在氧化應(yīng)激狀態(tài)，在pSS中，血清或局部ROS和活性氮（reactive nitrogen species，RNS）增加，抗氧化酶表達(dá)降低，唾液腺、頜下腺、淚腺的損傷均與氧化應(yīng)激有關(guān)［19-21］。本研究結(jié)果也驗(yàn)證了以上研究結(jié)果，即pSS小鼠血清中GSH-PX、CAT和SOD降低。為了探索IL-12是否通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激參與pSS肝臟病變，課題組檢測了IL-12基因敲除NOD小鼠血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型NOD小鼠相比，GSHPX、CAT和SOD的水平有所增加。以上結(jié)果提示，IL-12可能通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激參與pSS。為了明確IL-12通過調(diào)節(jié)pSS肝臟病變的直接證據(jù)，本研究應(yīng)用IL-12處理肝臟細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-12使肝臟細(xì)胞的CAT、GSH、GSH-PX和SOD下降，而使肝臟細(xì)胞中MDA增加，以上結(jié)果提示IL-12會(huì)促進(jìn)氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而參與pSS肝臟病變。

綜上所述，IL-12可加重pSS及其肝臟病變，而氧化應(yīng)激指標(biāo)是IL-12發(fā)揮作用的分子。以上結(jié)論有望為臨床pSS肝損傷患者的診斷提供新生物學(xué)標(biāo)志物和治療新策略。