覃鳳嫻，羅雪，蔣瑜采，劉小勇

1 廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，廣西柳州 545000；2 柳州市婦幼保健院檢驗科；3 柳州市柳鐵中心醫(yī)院檢驗科

生殖道感染是婦科的常見疾病。生殖道感染與生殖道內(nèi)菌群微生物相互制約、相互協(xié)調(diào)的動態(tài)平衡密切相關(guān)。生殖道內(nèi)菌群微生物動態(tài)平衡的打破將導(dǎo)致生殖道菌群結(jié)構(gòu)和功能改變，繼而引起陰道炎癥[1-2］，可能與生殖系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3-4］。陰道分泌物檢測能夠較全面地分析陰道病原微生物的變化，評估陰道微生物菌群的功能[5-6］，已廣泛應(yīng)用于生殖道感染的診斷中[7-9］。目前，臨床常用高倍顯微鏡人工觀察（人工鏡檢）進行陰道分泌物病原體檢測，能較準(zhǔn)確直觀地反映陰道微生態(tài)的改變，但評價過程較繁瑣，檢測時間長，且易出現(xiàn)人工計算錯誤，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。隨著人工智能技術(shù)在顯微圖像領(lǐng)域的快速發(fā)展[10］，全自動高倍鏡檢分析系統(tǒng)采用機器模擬人工鏡檢操作過程，儀器采用異步并行高速算法，應(yīng)用人工智能AI技術(shù)對圖片進行精準(zhǔn)識別，且自動輸出判定結(jié)果，整個檢測過程不超過2 min，極大地提高了檢測的速度。但全自動高倍鏡檢分析系統(tǒng)在陰道分泌物病原體檢測中的效果與人工顯微鏡檢測結(jié)果的符合度如何，儀器性能是否滿足日常工作的需求，目前相關(guān)研究較少。為此，我們對234 例疑似生殖道感染患者陰道分泌物病原體的檢測結(jié)果進行分析，比較全自動高倍鏡檢分析系統(tǒng)對陰道分泌物涂片病原體檢測結(jié)果與人工鏡檢結(jié)果的一致性，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源 2022年7—8月間廣西柳鐵中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科保存的陰道分泌物革蘭氏染色涂片，剔除涂片過厚或過薄以及染色效果不佳的染色涂片，最終納入234 例份疑似存在生殖道感染患者的陰道分泌物標(biāo)本，患者年齡16～75（32.9 ± 8.7）歲。革蘭氏染液為山東仕達思公司產(chǎn)品。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)同意。

1.2 234 例份陰道分泌物涂片病原體微生物檢測分別用人工鏡檢、全自動高倍鏡檢分析系統(tǒng)檢測涂片病原體微生物。先由兩名資深實驗室人員按照傳統(tǒng)模式于Leica 超高倍生物顯微鏡下對患者陰道微生態(tài)進行評價，評價指標(biāo)包括陰道分泌物的菌群構(gòu)成（菌群密集度、多樣性和細菌比例等）、細胞情況（線索細胞及白細胞等）、各種病原體（菌絲、孢子、滴蟲、革蘭氏陽性球菌及革蘭氏陰性球菌等）及陰道微生態(tài)Nugent 評分等。所有指標(biāo)評價均根據(jù)《陰道微生態(tài)評價的臨床應(yīng)用專家共識》[5］和《全國臨床檢驗操作規(guī)程》（第四版）[11］，具體如下：各種病原體及線索細胞等指標(biāo)報定性結(jié)果；菌群構(gòu)成及白細胞等指標(biāo)按等級進行報告，其中菌群密集度按高倍視野平均菌量分四級（1～9 個為Ⅰ級、10～99 個為Ⅱ級，＞100 個至滿視野為Ⅲ級、成堆聚集或以上為Ⅳ級）；菌群多樣性根據(jù)顯微鏡下能辨認的菌種數(shù)分4 級（1～3為Ⅰ級、4～6為Ⅱ級、7～10為Ⅲ級、10以上為Ⅳ級）；白細胞根據(jù)高倍鏡視野下的細胞平均數(shù)進行分級（0～5為+-（少許）、5～15為+、15～30為++、＞30為+++、滿視野為++++），其中白細胞+-為Ⅰ級、+為Ⅱ級、++為Ⅲ級、+++及以上為Ⅳ級；乳酸桿菌和其他雜菌按所占總細菌百分率進行報告；根據(jù)乳酸桿菌比例數(shù)進一步將其分四個等級：0～25%為Ⅰ級，26%～50%為Ⅱ級，51%～69%為Ⅲ級，70%～100%為Ⅳ級，其他雜菌判定標(biāo)準(zhǔn)同乳酸桿菌。Nugent 評分主要是根據(jù)《陰道微生態(tài)評價的臨床應(yīng)用專家共識》中乳酸桿菌、加德納菌和普雷沃菌、動彎桿菌的菌群量進行綜合評分，總分值即為Nugent 評分，該分值大小是細菌性陰道炎（bacterial vaginosis，BV）的實驗室診斷依據(jù)，評分≤3 分提示正常、4～6 分提示中介、≥7 分可診斷為BV。以兩人閱片鏡檢一致的結(jié)果為最終結(jié)果，結(jié)果不一致時由第3 人進行鏡檢復(fù)核后，取兩人一致的結(jié)果為最終結(jié)果。234 例陰道分泌物標(biāo)本在人工鏡檢完成后再次使用全自動高倍鏡檢分析系統(tǒng)檢測，閱片內(nèi)容及結(jié)果報告方式同人工鏡檢。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 27.0 統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料用例或率表示，例的比較采用皮爾遜χ2檢驗；率的比較采用麥克尼馬爾χ2檢驗；采用Kappa 檢驗分析兩種閱片方法菌群密集度、多樣性、乳酸桿菌比例、其他雜菌比例及白細胞等級的一致性，當(dāng)Kappa值≥0.75 時說明兩者一致性好，Kappa 值0.4～0.75說明兩者一致性一般，Kappa值＜0.4說明一致性差。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 全自動高倍鏡檢分析系統(tǒng)、人工鏡檢病原體檢出率比較 234 例份標(biāo)本中人工鏡檢結(jié)果為菌絲檢出率13.25%（31/234）、孢子檢出率19.66%（46/234）、線索細胞檢出率17.09%（40/234）、滴蟲檢出率4.27%（10/234）、革蘭氏陽性球菌檢出率3.85%（9/234）、動彎桿菌檢出率1.71（4/234）、革蘭氏陰性球菌檢出率0.43%（1/234），234 例份標(biāo)本中全自動高倍鏡檢分析系統(tǒng)檢測結(jié)果為菌絲檢出率21.79%（51/234）、孢子檢出率20.94%（49/234）、線索細胞檢出率22.64%（53/234）、滴蟲檢出率0、革蘭氏陽性球菌檢出率0、動彎桿菌檢出率0、革蘭氏陰性球菌檢出率0。與人工鏡檢比較，全自動高倍鏡檢分析系統(tǒng)的菌絲檢出率高（P＜0.05）。

2.2 全自動高倍鏡檢分析系統(tǒng)、人工鏡檢檢出病原體符合率比較 234 例份標(biāo)本中人工鏡檢結(jié)果為菌絲陽性31 例、陰性203 例，孢子陽性46 例、陰性188例，線索細胞陽性40 例、陰性194 例，自動化閱片結(jié)果為菌絲陽性51例、陰性183例，孢子陽性49例、陰性185 例，線索細胞陽性53 例、陰性181 例。以人工鏡檢結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，自動高倍鏡檢分析系統(tǒng)檢出菌絲的陽性符合率74.19%、陰性符合率86.21%、假陽性率13.79%，假陰性率25.81%，總符合率84.62%；檢出孢子的陽性符合率76.09%、陰性符合率92.55%、假陽性率7.45%，假陰性率23.91%，總符合率89.32%；檢出線索細胞的陽性符合率80.00%、陰性符合率89.18%、假陽性率10.82%，假陰性率20.00%，總符合率87.61%。與人工鏡檢比較，自動高倍鏡檢分析系統(tǒng)、人工鏡檢的檢出孢子總體符合率較高（P＞0.05），檢出菌絲和線索細胞總體符合率稍差（P均＜0.05）。

2.3 全自動高倍鏡檢分析系統(tǒng)、人工鏡檢檢出菌群密集度、菌群多樣性、乳酸桿菌比例、其他雜菌比例及白細胞等級劃分一致性結(jié)果 234 例份標(biāo)本中人工鏡檢結(jié)果為菌群密集度Ⅰ級11 例份、Ⅱ級182 例份、Ⅲ級41 例份，菌群多樣性Ⅰ級12 例份、Ⅱ級216例份、Ⅲ級6例份，乳酸桿菌比例Ⅰ級122例份、Ⅱ級14 例份、Ⅲ級16 例份、Ⅳ級82 例份，其他雜菌比例Ⅰ級56例份、Ⅱ級42例份、Ⅲ級10例份、Ⅳ級126例份，白細胞Ⅰ級109 例份、Ⅱ級51 例份、Ⅲ級54 例份、Ⅳ級20例份。自動高倍鏡檢分析系統(tǒng)結(jié)果為菌群密集度Ⅰ級29 例份、Ⅱ級104 例份、Ⅲ級101 例份，菌群多樣性Ⅰ級29 例份、Ⅱ級180 例份、Ⅲ級25例份，乳酸桿菌比例Ⅰ級58例份、Ⅱ級24例份、Ⅲ級27 例份、Ⅳ級125 例份，其他雜菌比例Ⅰ級114 例份、Ⅱ級43例份、Ⅲ級19例份、Ⅳ級58例份，白細胞Ⅰ級74例份、Ⅱ級103例份、Ⅲ級43例份、Ⅳ級14例份。與人工鏡檢比較，自動高倍鏡檢分析系統(tǒng)、人工鏡檢的檢出菌群密集度、菌群多樣性、乳酸桿菌比例、其他雜菌比例及白細胞等級劃分的Kappa 值分別為0.157、0.254、0.375、0293 及0.319，兩種方法的一致性較差（P＜0.05）。

2.4 全自動高倍鏡檢分析系統(tǒng)、人工鏡檢Nugent評分一致性結(jié)果 人工鏡檢檢測結(jié)果Nugent 評分為0～3 分126 例份、4～6 分68 例份、7～10 分40 例份，全自動高倍鏡檢分析系統(tǒng)檢測結(jié)果Nugent 評分為0～3 分176 例份、4～6 分19 例份、7～10 分39 例份。人工鏡檢方法、自動高倍鏡檢分析系統(tǒng)Nugent評分的Kappa值為0.441，兩種檢測方法結(jié)果的一致性一般（P＜0.05）。

3 討論

陰道微生態(tài)評價能夠充分反映陰道微環(huán)境的改變，在陰道炎的診斷治療中有較為顯著的價值，因此被廣泛應(yīng)用于臨床[12-13］。目前該項目的檢測手段仍是靠人工鏡檢，這很容易引起檢驗工作者的視覺疲勞，從而降低檢測速度。全自動高倍鏡檢分析系統(tǒng)由于其自動化、智能化，可實現(xiàn)對革蘭氏染色涂片的快速掃描閱片及結(jié)果分析，顯著提高檢測效率。然而，由于生殖道微環(huán)境本身的復(fù)雜性，全自動高倍鏡檢分析系統(tǒng)分析結(jié)果的準(zhǔn)確性還有待進一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)，全自動高倍鏡檢分析系統(tǒng)在陰道分泌物革蘭氏染色片的陰道微生態(tài)形態(tài)學(xué)評價中尚存在一些局限性，還不能完全代替?zhèn)鹘y(tǒng)的人工鏡檢。

本研究中，我們首先通過傳統(tǒng)的人工鏡檢方式對陰道分泌物革蘭氏染色片進行微生態(tài)形態(tài)學(xué)閱片，結(jié)束后將同一張片子放置于全自動高倍鏡檢分析系統(tǒng)中進行再次自動化閱片，比較兩者閱片結(jié)果的一致性。剔除由于細胞過少，片子過薄等原因?qū)е伦詣踊喥〉钠雍?，?34 例份革蘭氏染色片被納入本研究中進行比較分析。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在病原體檢出率方面，全自動高倍鏡檢分析系統(tǒng)對菌絲及線索細胞的檢測率均高于人工鏡檢，對孢子的檢測率較人工鏡檢無明顯差異。而在病原體檢出符合率上，全自動高倍鏡檢分析系統(tǒng)菌絲檢出的符合率為84.62%，線索細胞檢出的符合率為87.61%，與人工鏡檢存在明顯差異；孢子檢出的符合率為89.32%，與人工鏡檢一致性較好。因此我們認為，雖然全自動高倍鏡檢分析系統(tǒng)對菌絲和線索細胞等病原體有較高的檢出率，但存在較多的假陽性及假陰性，總體符合率較差。這主要與儀器在形態(tài)學(xué)的識別上仍有部分欠缺有關(guān)。如在菌絲的識別方面，儀器容易將形態(tài)學(xué)相似、長條狀的有形成分，如纖維絲，較長的長桿菌等誤認為是菌絲；而當(dāng)菌絲較粗短時，儀器又誤認為是桿菌而漏診；此外，為保證閱片的效率，全自動高倍鏡檢分析系統(tǒng)未能對染色片進行全片閱片，這容易引起病原體的漏檢，尤其是當(dāng)臨床標(biāo)本病原體量較少時，需要人工仔細閱覽全片方可審發(fā)結(jié)果。在線索細胞的識別方面，全自動高倍鏡檢分析系統(tǒng)也存在一定的誤診和漏診，主要是儀器誤將背景的一些形似細菌的細小雜質(zhì)誤認為革蘭陰性小桿菌；另外，陰道加德納菌及動彎桿菌等細菌的復(fù)雜性多樣性，也給儀器的識別增加難度，尤其是細菌形態(tài)不夠典型且菌量較少時，儀器無法準(zhǔn)確識別出革蘭陰性小桿菌，導(dǎo)致漏檢。在孢子的檢出率及符合率方面，全自動高倍鏡檢分析系統(tǒng)與人工鏡檢的一致性較好，這可能歸結(jié)于孢子的形態(tài)較單一且典型。

在本研究中，全自動高倍鏡檢分析系統(tǒng)未檢出革蘭陽性球菌、動彎桿菌和革蘭陰性球菌等，這可能與本研究中上述陽性標(biāo)本數(shù)量過少有關(guān)，需要進一步擴大樣本量才具有比較意義。滴蟲在全自動高倍鏡檢分析系統(tǒng)中亦未被檢出。滴蟲在濕片中較容易被識別，其經(jīng)過干燥固定后，形態(tài)發(fā)生了改變，革蘭氏染色鏡下形態(tài)跟白細胞相似。在儀器的掃描過程中，全自動高倍鏡檢分析系統(tǒng)有可能將比白細胞稍大點的滴蟲誤認為白細胞，造成漏診。

在菌群密集度、菌群多樣性、乳酸桿菌比例和其他雜菌比例等指標(biāo)等級判定方面，全自動高倍鏡檢分析系統(tǒng)與人工鏡檢結(jié)果一致性較差，這主要是由于生殖道微環(huán)境的復(fù)雜性及細菌的多形性、異質(zhì)性等，導(dǎo)致儀器對細菌菌種、形態(tài)的識別與人工相比存在一定的差距。另外，在白細胞的等級判定上，全自動高倍鏡檢分析系統(tǒng)總體上所判斷的等級要比人工鏡檢弱一個等級，這可能是跟儀器本身的參數(shù)設(shè)置相關(guān)。此外，我們在統(tǒng)計過程中發(fā)現(xiàn)，在革蘭陰性小桿菌的等級評定中，全自動高倍鏡檢分析系統(tǒng)將32例陽性標(biāo)本幾乎均評定為Ⅳ級，而人工鏡檢僅將4例標(biāo)本等級判定為Ⅳ級。全自動高倍鏡檢分析系統(tǒng)對革蘭陰性小桿菌的等級判定要比人工鏡檢強一到兩個等級，儀器本身的參數(shù)設(shè)置可能是導(dǎo)致兩者差異的主要原因，儀器誤將染色片中的雜質(zhì)，或者其他細小細菌誤認為革蘭陰性小桿菌，也可能是等級差距的原因之一。

Nugent 評分由生殖道內(nèi)菌群構(gòu)成比，如乳桿比例、其他雜菌比例、革蘭陰性小桿菌等指標(biāo)綜合評分后的分值總和，是診斷BV 的重要依據(jù)[14］。BV 可引發(fā)不孕、早產(chǎn)、尿路感染等多種疾病，嚴(yán)重危害患者的身心健康[15］。因此，及時準(zhǔn)確地診斷對BV 患者意義重大。本研究中，由于全自動高倍鏡檢分析系統(tǒng)對乳桿比例、其他雜菌比例、革蘭陰性小桿菌等指標(biāo)的識別及等級劃分與人工鏡檢評價尚存在一些差異，使得其對BV 診斷的靈敏度和準(zhǔn)確度較低，導(dǎo)致在Nugent 評分上全自動高倍鏡檢分析系統(tǒng)與人工鏡檢一致性一般。今后可參考人工鏡檢的結(jié)果，對全自動高倍鏡分析系統(tǒng)進行相關(guān)參數(shù)的微調(diào)，可明顯提高自動化與人工鏡檢的符合率，如在菌絲的識別方面，根據(jù)菌絲特點進一步完善其識別相關(guān)參數(shù)；重新調(diào)整白細胞、革蘭陰性小桿菌等級別參數(shù)的設(shè)定，以及對其他指標(biāo)識別功能的進一步完善。

綜上所述，與人工鏡檢比較，全自動高倍鏡檢分析系統(tǒng)陰道分泌物涂片孢子的檢測結(jié)果基本一致，菌絲及線索細胞的檢出準(zhǔn)確率稍差，對菌群結(jié)構(gòu)等指標(biāo)的檢測結(jié)果一致性較差。后續(xù)需提高全自動高倍鏡檢分析系統(tǒng)與人工鏡檢閱片方法結(jié)果的一致性。