顎璐莎,易華,張艷芳
1 內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科,呼和浩特 010017;2 內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院病理科
急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome,ACS)是世界范圍內(nèi)常見的心血管疾病,主要包括急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)和不穩(wěn)定心絞痛(unstable angina pectoris,UAP),冠狀動脈粥樣硬化是其病理學(xué)基礎(chǔ)[1]。近年來ACS 發(fā)病率呈逐年增加的趨勢,是造成冠心病患者病死率升高的主要病因[2]。目前ACS 患者冠狀動脈粥樣斑塊及不穩(wěn)定性狀態(tài)的形成機制尚未完全明確,血管內(nèi)皮細胞損傷、血管平滑肌細胞增殖、遷移及炎癥反應(yīng)可能是冠狀動脈粥樣斑塊形成及影響斑塊穩(wěn)定性的主要因素[3]。最新研究[4-5]發(fā)現(xiàn),微小RNA(microRNA,miRNA)在ACS 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用,參與調(diào)控動脈粥樣硬化斑塊的形成及穩(wěn)定性。微小RNA-181a-5p(miR-181a-5p)屬于miRNA 家族成員,其在細胞增殖、分化、遷移等多種生理病理過程中起著 極 其 重 要 的 作 用[6]。近 期 動 物 實 驗[7]發(fā) 現(xiàn),miR-181a-5p在動脈粥樣硬化ApoE-/-模型小鼠動脈粥樣硬化斑塊和血漿中表達均明顯降低,上調(diào)miR-181a-5p表達能夠延緩動脈粥樣硬化ApoE-/-模型小鼠粥樣斑塊的形成,增加斑塊的穩(wěn)定性。但目前miR-181a-5p在ACS中的研究甚少,并且其對冠狀動脈血管平滑肌細胞增殖、遷移的作用尚不明確。血小板反應(yīng)蛋白解整合素金屬肽酶1(ADAMTS1)是一種分泌性蛋白酶,已有研究發(fā)現(xiàn)其與動脈粥樣硬化關(guān)系密切,與斑塊的形成及不穩(wěn)定性密切相關(guān)[8]。近期研究[9]發(fā)現(xiàn),ADAMTS1的3'UTR區(qū)上有miR-181a-5p的潛在結(jié)合位點,ADAMTS1基因可能是miR-181a-5p的下游作用靶基因。但至今miR-181a-5p 在ACS 中作用的下游分子機制是否與其對ADAMTS1 基因的靶向作用有關(guān)尚不清楚。為此,我們觀察了miR-181a-5p 在ACS 患者血清中表達及對人冠狀動脈平滑肌細胞增殖、遷移調(diào)控作用,進一步探討其與ADAMTS1的靶向關(guān)系,現(xiàn)將結(jié)果報告如下。
1.1 細胞、試劑及儀器 人冠狀動脈平滑肌細胞系HCASMC 購自美國Lifeline公司,采用DMEM 培養(yǎng)基常規(guī)傳代培養(yǎng),2~3 d 傳代一次,取第4 代細胞進行后續(xù)實驗。TRIzol 試劑購自北京天根公司;LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司;血清miRNA提取試劑盒購自美國Ambion 公司;miR-181a-5p 模擬物(miR-181a-5p mimics)、模擬物陰性對照(mimics-NC)、miR-181a-5p 抑制物(miR-181a-5p inhibitor)、抑 制物 陰 性對 照(inhibitor-NC)及 突變 型ADAMTS1 熒光素酶報告基因質(zhì)(ADAMTS1-MUT)、野生型ADAMTS1 熒光素酶報告基因質(zhì)粒(ADAMTS1-WT)均購自上海吉瑪制藥公司;qRT-PCR 相關(guān)引物購自廣東銳博生物公司;CCK-8檢測試劑盒購自武漢博士德公司;Transwell 小室購自美國Corning 公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR 試劑盒購自日本TaKaRA 公司;雙熒光素酶活性檢測試劑盒購自美國Promega 公司;BCA 蛋白定量檢測試劑盒購自美國Thermo 公司;兔抗人ADAMTS1 單克隆抗體購自美國CST公司。
1.2 ACS患者血清miR-181a-5p表達觀察
1.2.1 臨床資料 選擇2021 年5 月—2023 年5 月在我院心內(nèi)科住院治療并行冠脈造影的100 例ACS患者,其中男62 例、女38 例,年齡(55.6 ± 6.8)歲。納入標準:①符合美國心臟病學(xué)會/美國心臟協(xié)會(ACC/AHA)發(fā)布的心血管診療指南標準;②年齡>18 歲。排除標準:①近期接受過支架置入、冠狀動脈溶栓或搭橋手術(shù)的患者;②合并有肝腎功能不全、自身免疫性疾病及惡性腫瘤等嚴重疾??;③合并有急慢性感染、急性腦卒中等;④患者均對本研究知情同意。100 例ACS 患者中AMI 患者55 例、UAP 患者45例。同期收集40例我院心內(nèi)科行冠脈造影結(jié)果陰性者為對照組,其中男26 例、女14 例,年齡(54.9 ±7.7)歲,兩組患者在年齡、性別等一般資料具有可比性,本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。
1.2.2 兩組血清miR-181a-5p 檢測 兩組均于入院24 h 內(nèi)采集空腹外周靜脈血5 mL,離心分離血清,-80 ℃低溫冰箱保存。采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測兩組血清miR-181a-5p,應(yīng)用miRNA 提取試劑盒提取患者血清中的總RNA, 應(yīng)用TRIzol 試劑提取HCASMC 細胞總RNA,應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑合成cDNA。以cDNA 為模板,進行qRT-PCR反應(yīng),以U6 作為內(nèi)參基因。使用的引物序列如下:miR-181a-5p 引物序列:上游:5'-GCCGAACATTCAACGCTGTCG-3',下游:5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。PCR 反應(yīng)條件:95 ℃ 20 s,95 ℃ 10 s,60 ℃ 20 s,70 ℃ 10 s,共40 個循環(huán)。以2-ΔΔCt代表miR-181a-5p的相對表達量,重復(fù)測算3次,取平均值。
1.3 miR-181a-5p 對HCASMC 細胞增殖、遷移的調(diào)控作用觀察
1.3.1 HCASMC 細胞分組及miR-181a-5p 模擬物、miR-181a-5p 抑制物轉(zhuǎn)染方法 取對數(shù)生長期HCASMC 細胞分為一、二、三、四組,采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法應(yīng)用轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000 分別轉(zhuǎn)染miR-181a-5p mimics、mimics-NC、miR-181a-5p inhibitor、inhibitor-NC,培養(yǎng)24 h 時采用qRT-PCR 法檢測各組細胞miR-181a-5p。一、二、三、四組細胞miR-181a-5p相對表達量分別為6.30 ± 0.17、1.02 ± 0.04、0.46 ±0.12,與二組相比,一組細胞miR-181a-5p相對表達量高(P<0.05),與三組相比,四組細胞miR-181a-5p相對表達量低(P<0.05),說明轉(zhuǎn)染成功。
1.3.2 各組細胞增殖情況觀察 培養(yǎng)48 h 收集各組細胞,采用CCK-8 實驗觀察細胞增殖情況。取各組細胞,接種于96 孔細胞板,細胞密度為5 000/孔,每組6個平行孔,所有操作均嚴格參照CCK-8試劑盒說明書進行,避光條件下各孔分別加入10 μL 的CCK-8溶液,置入細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h,在酶標儀上測定各孔波長450 nm 處的吸光度(OD)值。以O(shè)D值代表細胞的增殖能力,實驗重復(fù)3次,取平均值。
1.3.3 各組細胞遷移情況觀察 培養(yǎng)48 h 收集各組細胞,采用Transwell 遷移實驗觀察細胞遷移情況。取各組細胞,取Transwell小室置于無菌24孔板中,在Transwell 小室的上室加入0.1 mL 細胞懸液(含1×103個細胞),下室加入0.6 mL 含10 % 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基,孵育24 h 后取出,棉簽擦去基質(zhì)和上室未遷移的細胞,多聚甲醛固定后染色,倒置顯微鏡下拍照,測管各組穿膜細胞數(shù),以穿膜細胞數(shù)代表細胞的遷移能力,實驗重復(fù)3次,取平均值。
1.3.4 各組細胞ADAMTS1 蛋白檢測 培養(yǎng)24 h時取各組細胞,采用Western Blotting 法檢測細胞ADAMTS1 蛋白。應(yīng)用RIPA 細胞裂解液裂解細胞,BCA 法蛋白定量。取40 μg蛋白上樣進行10% SDSPAGE,濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜上,5 %脫脂奶粉室溫封閉1 h,而后加入一抗ADAMTS1(工作濃度1∶2 000)抗體和GAPDH(工作濃度1∶5 000)抗體,4 ℃反應(yīng)過夜,次日再加入二抗(工作濃度1∶10 000),室溫孵育2 h,發(fā)光劑曝光、顯影。GAPDH 蛋白作為內(nèi)參,以蛋白條帶灰度值代表目的蛋白的相對表達量。實驗重復(fù)測算3次,取平均值。
1.4 HCASMC 細胞中miR-181a-5p、ADAMTS1 的靶向關(guān)系觀察 取對數(shù)生長期HCASMC 細胞接種于24 孔板,分為A、B、C、D 四組,每組6 個復(fù)孔,A 組應(yīng)用LipofectamineTM2000 先后轉(zhuǎn)染ADAMTS1-MUT、miR-181a-5p mimics ;B 組 先 后 轉(zhuǎn) 染ADAMTS1-MUT、mimics-NC;C 組 先 后 轉(zhuǎn) 染ADAMTS1-WT、miR-181a-5p mimics; D 組先后轉(zhuǎn)染ADAMTS1-WT、mimics-NC,培養(yǎng)24 h 時取各組細胞,采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測各組細胞的相對熒光素酶活性。所有操作均嚴格按照試劑盒說明書進行,實驗重復(fù)測算3次,取平均值。
1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。正態(tài)性分析采用Shapiro-Wilk 檢驗,符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗;多組間比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗;計數(shù)資料以%表示,組間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 各組患者血清miR-181a-5p 相對表達量比較 ACS組、對照組患者血清miR-181a-5p相對表達量分別為0.48 ± 0.04、1.01 ± 0.03,二者相比,P<0.05。UAP患者、AMI患者血清miR-181a-5p相對表達量分別為0.76 ± 0.05、0.25 ± 0.03,二者相比,P<0.05。
2.2 各組細胞增殖能力、遷移能力及ADAMTS1 蛋白相對表達量比較 培養(yǎng)48 h 時一、二、三、四組細胞 增 殖 能 力 分 別 為1.45 ± 0.12、2.15 ± 0.13、2.95 ± 0.20、2.10 ± 0.11,遷移能力分別為(18 ±5)、(45 ± 9)、(59 ± 8)、(38 ± 6)個。與二組相比,培養(yǎng)48 h時一組細胞增殖能力和遷移能力降低(P均<0.01);與四組相比,培養(yǎng)48 h 時三組細胞增殖能力和遷移能力高(P均<0.01)。培養(yǎng)24 h時一、二、三、四組細胞ADAMTS1 蛋白相對表達量分別為0.19 ±0.08、0.62 ± 0.13、0.92 ± 0.14、0.52 ± 0.12,與二組相比,一組細胞ADAMTS1 蛋白相對表達量低(P均<0.01);與四組相比,三組細胞ADAMTS1 蛋白相對表達量高(P均<0.01)。
2.3 各組細胞熒光素酶活性比較 A、B、C、D 組細胞熒光素酶活性分別為1.03 ± 0.03、1.01 ± 0.04、0.45 ± 0.06、1.02 ± 0.05。與B 組相比,A 組細胞熒光素酶活性明顯低(P<0.05)。
動脈粥樣硬化是冠心病、腦梗死和外周血管疾病的主要原因。動脈粥樣硬化性心血管疾病仍然是全球人類死亡的主要原因,并且發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。冠狀動脈粥樣硬化是ACS 的病理學(xué)基礎(chǔ),冠狀動脈粥樣硬化是一種慢性疾病,其特征是對系統(tǒng)風(fēng)險因素和局部促動脈粥樣硬化刺激反應(yīng)的不斷進展。HCASMC 在動脈粥樣硬化斑塊的形成中起著至關(guān)重要的作用。內(nèi)膜內(nèi)血管平滑肌細胞的異常增殖和遷移促進了冠狀動脈粥樣硬化斑塊的形成,并且與晚期的脆弱斑塊的穩(wěn)定性有關(guān)。隨著生物遺傳學(xué)的發(fā)生發(fā)展,人們逐漸發(fā)現(xiàn)HCASMC 異常增殖和遷移與某些基因的異常表達有關(guān)。
miRNAs 是近年來新發(fā)現(xiàn)的小的非編碼RNA 分子,約20~25 個核苷酸,通過靶向mRNA 的降解或阻斷蛋白質(zhì)翻譯作為蛋白質(zhì)表達的調(diào)節(jié)因子,參與機體細胞增殖、分化、凋亡、遷移等功能的調(diào)控。近年來研究[10-11]顯示, miRNAs廣泛參與動脈粥樣硬化相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展機制的多個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。李韶南等[12]發(fā)現(xiàn)血清中miR-21 水平與冠狀動脈內(nèi)斑塊的不穩(wěn)定狀態(tài)密切相關(guān)。LAI 等[13]在研究中發(fā)現(xiàn)冠心病患者血清及冠狀動脈平滑肌細胞中異常增高的miR-574 促進了冠狀動脈平滑肌細胞的增殖并抑制其凋亡,促進動脈粥樣硬化斑塊的增長。近年來miR-135b、miR-499a 及miR-181b 等 多 個miRNA 被相繼證實參與了冠狀動脈粥樣硬化的發(fā)生進展,并且與其對動脈平滑肌細胞的增殖、凋亡及遷移的調(diào)控有關(guān)[14-15]。miR-181a-5p 屬于miR-181 家族重要成員,廣泛參與造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、干細胞分化等調(diào)節(jié),在腫瘤、炎癥反應(yīng)等方面起著重要的調(diào)節(jié)作用[6,16]。已有研究[17]顯示冠心病和肥胖代謝綜合癥患者外周血中miR-181a-5p 表達顯著降低,但其作用機制尚不清楚。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),ACS 組患者血清中miR-181a-5p 相對表達量較對照組明顯降低,并且AMI 組患者血清中miR-181a-5p 相對表達量明顯低于UAP 患者,提示miR-181a-5p 在ACS 發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮著重要的作用,并且可能與粥樣斑塊穩(wěn)定性有關(guān)。
血管平滑肌細胞的異常增殖和遷移是動脈粥樣硬化發(fā)生進展中的重要環(huán)節(jié)[18]。如何有效阻斷血管平滑肌細胞的異常增殖和遷移是目前動脈粥樣硬化的研究熱點問題。血管平滑肌細胞的增殖及遷移能夠受到miRNAs的調(diào)控。CHEN等[19]發(fā)現(xiàn)miR-155-5p在ACS 患者血清中表達下降,miR-155-5p 能夠抗動脈粥樣硬化,其機制與其對血管平滑肌細胞的增殖、遷移和侵襲的抑制作用有關(guān)。相關(guān)研究[20]顯示,miR-599 也能夠參與對血管平滑肌細胞的增殖和遷移能力的抑制,起到阻止動脈粥樣硬化進展的作用。動物實驗顯示miR-181a-5p 與動脈粥樣硬化斑塊形成和穩(wěn)定性密切相關(guān),但具體作用機制尚不明確[7]。本研究通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法成功轉(zhuǎn)染miR-181a-5p 模擬物、miR-181a-5p 抑制物至HCASMC 細胞,成功上調(diào)或下調(diào)細胞中miR-181a-5p 表達水平。進一步通過采用CCK-8 實驗、Transwell 遷移實驗發(fā)現(xiàn),上調(diào)miR-181a-5p表達水平,能夠明顯抑制冠狀動脈平滑肌細胞的增殖和遷移能力,而下調(diào)miR-181a-5p 表達水平能夠明顯促進冠狀動脈平滑肌細胞的增殖和遷移能力,證實miR-181a-5p 表達與冠狀動脈斑塊的形成和穩(wěn)定性有關(guān),上調(diào)miR-181a-5p 表達能夠起到抗動脈粥樣硬化、穩(wěn)定斑塊的作用,可能成為ACS治療的靶基因。
對下游靶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控,是miRNA 調(diào)控細胞功能的重要機制。miRNA 能夠通過對下游一個或者多個靶基因的調(diào)控,通過不同的分子通路參與機體細胞功能的調(diào)控。既往研究顯示ADAMTS1 基因可能是miR-181a-5p 的下游作用靶基因[9]。ADAMTS1是一種分泌性蛋白酶,屬于ADAMTS 家族成員,能夠通過參與細胞外基質(zhì)的降解和重組,并且能夠激活不同的細胞表面分子,在腫瘤、炎癥和血管形成中起著發(fā)揮著重要的作用[21]。近年來越來越多的研究表明ADAMTS1與動脈粥樣硬化關(guān)系密切,與斑塊的形成及不穩(wěn)定性密切相關(guān)[8]。研究[22]發(fā)現(xiàn)ACS 患者血清中ADAMTS1的表達水平顯著升高,并且AMI患者隨著心肌梗死面積的增加,患者血漿中ADAMTS1水平越高,并且發(fā)生心血管事件比例越高[23]。研究[24]已證實,動脈粥樣硬化斑塊中ADAMTS1 的表達明顯增高,抑制血管平滑肌細胞中ADAMTS1 的表達能夠明顯抑制細胞的增殖及遷移能力[25]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-181a-5p 能夠結(jié)合ADAMTS1 基因的3'UTR 從而使相對熒光素酶活性降低,上調(diào)miR-181a-5p 表達的HCASMC 細胞ADAMTS1 蛋白表達下降,而下調(diào)miR-181a-5p表達的HCASMC細胞ADAMTS1 蛋白表達升高,說明ADAMTS1 是miR-181a-5p的直接作用靶基因。
綜述所述,ACS患者血清中miR-181a-5p在表達低,miR-181a-5p可抑制HCASMC細胞的增殖和遷移。miR-181a-5p 可通過靶向抑制HCASMC 細胞ADAMTS1蛋白表達,抑制HCASMC細胞的增殖和遷移。