王平，李夢輝，張耀文

1 河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院放療科，河南洛陽 471003；2 河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院；3 安陽市腫瘤醫(yī)院河南科技大學(xué)附屬安陽腫瘤醫(yī)院放療科；4 河南省食管癌精準(zhǔn)防治醫(yī)學(xué)重點實驗室

食管癌是河南常見的惡性腫瘤之一，其中以食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）最常見[1］。ESCC 的病死率極高，發(fā)病機制至今尚未完全明確[2］。因此，尋找ESCC 早診早治的分子標(biāo)志物對改善患者的預(yù)后具有重要意義。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一種內(nèi)源性非編碼RNA，可通過調(diào)控天然小RNA（microRNAs，miRNAs）活性，參與結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件及轉(zhuǎn)錄蛋白互作基因等過程[3］，且具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、種類豐富、特異性強、序列保守等特點。circRNA 具有海綿體機制，可與RNA 分子相互作用，競爭性吸附MicroRNAs（miRNAs），通過調(diào)節(jié)miRNA 的活性來影響細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生理過程。circRNAs 既可以作為癌基因促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，又可以作為抑癌基因抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，同時circRNA 已被證實可作為肝癌、胃癌、肺癌等多種惡性腫瘤的生物標(biāo)志物用于疾病的診斷和預(yù)后判斷[4-5］。最新研究[5］發(fā)現(xiàn)，ESCC 組織中的circRNA 可作為miRNA 海綿，誘導(dǎo)ESCC 細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，調(diào)控靶基因表達(dá)，促進ESCC 細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移。我們前期研究[6-7］發(fā)現(xiàn)，ESCC 組織和細(xì)胞中hsa_circRNA6448-14表達(dá)升高，且hsa_circRNA6448-14表達(dá)與ESCC分化程度、pTNM 分期呈負(fù)相關(guān)，與患者的低位生存期呈正相關(guān)。為進一步研究hsa_circRNA6448-14 與ESCC 的惡性生物學(xué)行為的關(guān)系，2022年8月—2023年10 月，我們觀察了抑制hsa_circRNA6448-14 表達(dá)對人ESCC細(xì)胞系KYSE30及KYSE150侵襲、遷移的影響，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器 ESCC 細(xì)胞系KYSE30 及KYSE150（本實驗室凍存）。1640 培養(yǎng)基及胎牛血清（美國Gibco 公司）；Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染試劑（美國Invitrogen 公司）；hsa_circRNA6448-14-siRNA（干擾hsa_circRNA6448-14 表達(dá)）及siNC（上海吉瑪基因公司）；hsa_circRNA6448-14 上游引物為5'-CCAATGGGGACTGTCATGGA-3'，下 游 引 物 為5'-TCATGCCGTGTTTCAGCTCA-3'，GAPDH 上游引物為5'-GTGGAGTCCACTGGCGTCT-3'，下游引物為5'-GTGCAGGAGGCATTGCTGAT-3'（中 國Sangon Biotech 公司）；TRIzol 試劑盒（美國Thermo 公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及qPCR 試劑盒（中國Vazyme 公司）；PBS緩沖液、4%細(xì)胞固定液及1%結(jié)晶紫染液（中國Solarbio 公司）；Matrigel 膠（美國Sigma-Aldrich 公司）。熒光定量PCR 儀（美國伯樂公司）；成像系統(tǒng)（美國Thermo 公司）；倒置光學(xué)顯微鏡（日本尼康公司）。

1.2 抑制hsa_circRNA6448-14 表達(dá)的KYSE30、KYSE150 細(xì)胞構(gòu)建 常規(guī)培養(yǎng)KYSE30 及KYSE150細(xì)胞，將細(xì)胞各分為2組：對照組（siNC 空白質(zhì)粒組）及敲降組（siRNA 干擾質(zhì)粒組），分組如下：KYSE30對照組、KYSE150 對照組、KYSE30 敲降組和KYSE150 敲降組。待各組細(xì)胞密度為70%時，根據(jù)說明書分別將siNC 及hsa_circRNA6448-14-siRNA與Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染試劑混合，對照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染siNC 轉(zhuǎn)染混懸液進行，敲降組細(xì)胞轉(zhuǎn)染hsa_circRNA6448-14-siRNA 轉(zhuǎn)染混懸液進行。轉(zhuǎn)染48 h時采用qRT-PCR 檢測各組細(xì)胞hsa_circRNA6448-14，具體步驟參考說明書及文獻(xiàn)[7］。KYSE30 敲降組、KYSE30 對照組、KYSE150 敲降組及KYSE150 對照組hsa_circRNA6448-14 相對表達(dá)量分別為0.23 ±0.01、1.00 ± 0.05、0.25 ± 0.01、1.02 ± 0.03，與對照組比較，敲降組細(xì)胞hsa_circRNA6448-14 的相對表達(dá)量低（P均＜0.05），表明成功培養(yǎng)出抑制hsa_circRNA6448-14 表 達(dá) 的KYSE30、KYSE150 細(xì)胞，可用于后續(xù)實驗。

1.3 各組細(xì)胞侵襲情況觀察 采用Transwell 實驗。取“1.2”中各組細(xì)胞，于無胎牛血清的1640 培養(yǎng)基中饑餓培養(yǎng)24 h。采用Matrigel膠（50 mg/L）包被Transwell 小室基底膜，并于Transwell 下室加入含10%胎牛血清的1640。取各組饑餓培養(yǎng)后的細(xì)胞100 μL（含1 × 105個細(xì)胞），分別加入Transwell 小室。培養(yǎng)24 h 后，取出Transwell 小室，并擦去內(nèi)層細(xì)胞。將小室外層細(xì)胞于PBS緩沖液清洗、4%細(xì)胞固定液固定、1%結(jié)晶紫染液染色后，對外層細(xì)胞進行拍照并計數(shù)[8］。均選10個視野，采用Image J 軟件測算各組穿膜細(xì)胞數(shù)（代表侵襲能力），實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.4 各組細(xì)胞遷移情況觀察 采用劃痕實驗。取“1.2”中各組細(xì)胞，于6 孔板中常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度為70%后，采用無菌槍頭（200 μL）進行劃痕。PBS 緩沖液清洗后更換為新鮮培養(yǎng)基（含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基），常規(guī)培養(yǎng)。每隔 6 h 拍照并記錄一次細(xì)胞遷移面積。細(xì)胞遷移面積測量軟件及計算方法參照文獻(xiàn)[8］。應(yīng)用Image J 軟件測量不同時間點劃痕內(nèi)空白面積的大小，計算遷移面積，比較兩組細(xì)胞不同時間點遷移面積的大小，實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad 8.0 統(tǒng)計軟件。采用K-S 檢驗進行正態(tài)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組穿膜細(xì)胞數(shù)比較 培養(yǎng)24 h 時 KYSE30敲降組、KYSE30 對照組、KYSE150 敲降組及KYSE150 對照組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為58.00 ± 3.61、161.33 ± 4.06、69.00 ± 2.08、191.33 ± 6.39。與對照組比較，培養(yǎng)24 h 時敲降組細(xì)胞穿模細(xì)胞數(shù)?。╰分別為19.04、18.21，P均＜0.05）。

2.2 各組細(xì)胞遷移面積比較 培養(yǎng)24 h 時KYSE30 敲降組、KYSE30 對照組、KYSE150 敲降組及KYSE150 對照組細(xì)胞遷移面積分別為（11.67 ±0.88）、（26.00 ± 1.73）、（14.33 ± 0.88）、（28.00 ±1.53）mm2。與對照組比較，培養(yǎng)24 h 時敲降組細(xì)胞遷移面積小（t分別為7.37、7.75，P均＜0.05）。

3 討論

中國占食管癌全球病例的50%以上，ESCC 是主要的組織學(xué)類型。ESCC 的高危因素有吸煙、飲酒、飲食習(xí)慣、遺傳易感性、免疫功能紊亂等，目前，ESCC 的主要治療策略包括手術(shù)切除、放療、化療和靶向療法。其中，手術(shù)切除是早期ESCC 的首選治療方法。然而，由于多數(shù)ESCC 在診斷時已經(jīng)進展到晚期，因此，手術(shù)切除的效果受限。ESCC 的發(fā)生是一個多步驟、多階段的過程，涉及到基因突變、表觀遺傳改變、微環(huán)境改變和免疫逃逸等多個層面，但具體病因尚未明確。隨著對ESCC 分子機制的深入了解，一些新的靶向療法也正在開發(fā)中，如針對EGFR、VEGF 和PD-L1 的抗體藥物[9］。但由于ESCC起病隱匿，5 年生存率仍極低，因此，繼續(xù)尋找ESCC的診斷標(biāo)記物和治療靶點至關(guān)重要。

circRNA 是一組內(nèi)源性非編碼RNA，具有穩(wěn)定的共價閉環(huán)結(jié)構(gòu)，與線性RNA 相比，這一特性使得它們對RNA 核酸外切酶具有抗性。它們在細(xì)胞中的表達(dá)具有組織特異性、發(fā)育階段依賴性和疾病相關(guān)性，circRNA 可以通過調(diào)控基因表達(dá)來影響腫瘤的發(fā)展。circRNA 可以作為miRNA 的“海綿”，與miRNA 結(jié)合形成circRNA-miRNA 復(fù)合物，從而釋放出miRNA 的靶基因，影響靶基因的表達(dá)水平。這種調(diào)控機制可以影響腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)以及細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力，從而影響腫瘤的發(fā)展[15］。甲狀腺癌中，has_circRNA0058124可通過miR-218-5p/NUMB 調(diào)控NOTCH3/GATAD2A 軸促進癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移，且顯著縮短患者生存期[16］；前列腺癌中，circCSNK1G3 可通過調(diào)控miR-181 促進癌細(xì)胞惡性增殖，降低其治療敏感性[17］；肝癌中，circASAP1 可通過調(diào)控miR-326/miR-532-5P-MAPK1 信號通路促進癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，引起患者耐藥及復(fù)發(fā)[18］；非小細(xì)胞肺癌中，circFGFR1 可通過miR-381-3P 誘導(dǎo)CXCR4高表達(dá)，引起癌細(xì)胞抵抗凋亡，導(dǎo)致其免疫逃逸[19］；胃癌中，hsa_circ_0001725可通過miR-150-5P/c-Myc 軸參與胃癌的發(fā)生發(fā)展，hsa_circ_001852通過海綿樣吸附miR-139-5p 增加CCT5 基因表達(dá)促 進 胃癌惡性進展[20］，hsa circ 0014606 亦可通過miRNA-194- 5p 上調(diào)YAP1 基因的表達(dá)，發(fā)揮促進腫瘤增殖、遷移以及侵襲功能。骨肉瘤中，circMYO10可通過miR-370-3P/RUVBL1 軸引起染色質(zhì)重塑，增強β-catenin/LEF1 轉(zhuǎn)錄活性，促進癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致其惡性轉(zhuǎn)移[21］。肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌中，hsa_ circ_002174 充當(dāng)海綿來調(diào)節(jié)miR-149 的表達(dá)，進而調(diào)節(jié)Oct-2/IL-16信號通路促進肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌的惡性進展[22］。腎細(xì)胞癌中，Circ 0008717作為ceRNA海綿作用于miR-217，減少其對FBX017 表達(dá)的抑制作用，從而促進腎細(xì)胞癌的進展[23］。綜上，circRNA的表達(dá)水平可以作為人類各種腫瘤的診斷和預(yù)后指標(biāo)，為腫瘤的治療提供重要依據(jù)。

circRNA 在ESCC 發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。其中充當(dāng)miRNA-7（miR-7）海綿的環(huán)狀RNA-7（ciRS-7），也稱CDR1as，在食管癌中研究中最為多見。既往報道稱miRNA-7 具有腫瘤抑制因子作用，可通過多種作用機制抑制不同腫瘤類型的進展，包括遷移、侵襲以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等[19］。ciRS-7含有超過70 個miR-7 的結(jié)合位點，能夠有效地吸附miR-7，抑制miR-7 功能并上調(diào)相關(guān)基因的表達(dá)，如RS2 和EGFR[20］，解除miR-7 對其靶基因的抑制作用，從而促進腫瘤的發(fā)展。在ESCC 中，ciRS-7 不僅可通過miR-7 激活NFκB/p65 通路促進ESCC 細(xì)胞生長，還可通過miR-7 激活KLF4 促進ESCC 細(xì)胞遷移[21-22］。circ_0000654 可通過miR-149-5P 激活I(lǐng)L-6/STAT3通路誘發(fā)炎癥反應(yīng)，降低ESCC 細(xì)胞的放療敏感性[23］。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)hsa_circRNA6448-14高表達(dá)的ESCC 患者生存期縮短[6-7］，包括總生存期（OS）與無進展生存期（PFS），提示預(yù)后不良，表明hsa_circRNA6448-14 參與了ESCC 的發(fā)生發(fā)展。為了進一步探討hsa_circRNA6448-14 表達(dá)情況對ESCC 細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，本研究建立hsa_circRNA6448-14 敲 降 的ESCC 細(xì) 胞 系（KYSE30 及KYSE150 細(xì)胞系），采用Transwell 細(xì)胞侵襲實驗及劃痕實驗檢測親本與敲降細(xì)胞系的體外侵襲及遷移能力。結(jié)果表明，與親本細(xì)胞系相比，hsa_circRNA6448-14 敲降的ESCC 細(xì)胞系的體外侵襲及遷移能力均顯著減弱，提示靶向hsa_circRNA6448-14可有效抑制ESCC 細(xì)胞的惡性侵襲及遠(yuǎn)處遷移，表明hsa_circRNA6448-14 為ESCC 細(xì)胞侵襲及遷移過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子。以往的研究表明，circRNA的功能主要是作為海綿吸附miRNA，從而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。因此，筆者推測hsa circRNA6448-14 也可能作為海綿調(diào)節(jié)miRNA，參與ESCC 的發(fā)生發(fā)展。后續(xù)實驗計劃通過研究circRNA/miRNA 軸，初步探索hsa circRNA6448-14在ESCC中的作用機制。

綜上所述，抑制hsa_circRNA6448-14 表達(dá)后KYSE30 及KYSE150 細(xì)胞的侵襲遷移能力均降低，hsa_circRNA6448-14 可能在ESCC 細(xì)胞的侵襲及遷移過程中發(fā)揮重要作用，靶向hsa_circRNA6448-14可能是ESCC治療的新方法。