劉靜怡，王 鑫，李 園，方文生，曹坳程，顏冬冬，王秋霞

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，北京 100193）

在全球范圍內(nèi)，熏蒸技術(shù)作為一種重要且高效的快速消除病害及蟲害的手段，廣泛應(yīng)用于土壤消毒[1]、倉儲熏蒸[2-3]、原木上的蛀干害蟲[4-5]及商品保護[6]。近年來，由于高附加值作物的連年種植，大量的病原菌和蟲卵在土壤中積累，嚴重破壞了土壤的微生態(tài)環(huán)境，引發(fā)了土傳病害[7]。土傳病害可使作物減產(chǎn)60%以上甚至造成絕收，給農(nóng)民帶來了巨大的經(jīng)濟損失[8]。目前，在作物種植前進行土壤消毒是控制土傳病害最有效且穩(wěn)定的方法[9]。在倉儲方面，針對糧食收獲后收購、集中存儲、跨區(qū)域調(diào)運等儲糧的各個環(huán)節(jié)中難以避免的蟲害問題，糧倉熏蒸中的化學(xué)藥劑熏蒸是我國當前快速有效殺滅害蟲的主要手段之一[2]。因此，遵從IPM戰(zhàn)略，開發(fā)研制出高效低毒的糧食熏蒸劑尤為重要[10]。

1 熏蒸劑概述

熏蒸劑本身或其活性成分易氣化成氣態(tài)分子分散在空氣中，高效抵達土壤、糧倉、耐用品、易腐蝕品等環(huán)境，實現(xiàn)對害蟲、病原體、植物病原線蟲、鼠害及其他有害生物的有效治理[11]。與其他方法相比，熏蒸劑具有獨特的優(yōu)勢：①穿透能力強且覆蓋范圍廣。能穿透土壤、農(nóng)產(chǎn)品、木材等，殺滅位于深層的有害生物，接觸到隱蔽性病蟲害或其他方法難以接觸的分布區(qū)域[12]。②防治譜廣。許多熏蒸劑屬于多作用位點的農(nóng)藥，具有多靶標性，對多種有害生物均有防治效果。③具有增產(chǎn)效果。研究表明[13-16]，土壤熏蒸劑可以提高對作物生長起著關(guān)鍵作用的土壤中的銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、有效磷、速效鉀等微量元素的含量以及土壤酶的活性，減少土傳病原菌及線蟲的數(shù)量，從而起到對作物增產(chǎn)的效果。④效率高。熏蒸消毒省時且用藥量較少，一次可處理大量樣本，遠比傳統(tǒng)施藥方法（噴霧、噴粉、撒施等）速度快。

傳統(tǒng)廣泛使用的熏蒸劑種類主要有：①熏蒸劑溴甲烷。雖然溴甲烷是最有效的熏蒸劑之一，但在《蒙特利爾議定書》中被列為消耗臭氧層物質(zhì)，2015年起在發(fā)展中國家被逐步淘汰。因此，相關(guān)學(xué)者開展了大量研究，以期找到在生態(tài)上可接受、經(jīng)濟上可行的替代品[17]。目前，已篩選出高效、無殘留的多種高效土壤熏蒸劑，包括氯化苦、棉?。╠azomet，DZ）、威百畝（metam-sodium）、二甲基二硫（DMDS）、異硫氰酸烯丙酯（AITC）等[1]。②倉儲熏蒸劑磷化鋁。磷化鋁極易分解，分解后產(chǎn)生的磷化氫氣體作用于儲糧害蟲，被行業(yè)稱為儲糧熏蒸殺蟲劑[3]。③以硫酰氟為代表的建筑熏蒸處理用熏蒸劑[18]，可廣泛用于家居[19]、庫房[20]、集裝箱[21]、加工車間[22]等場所殺菌及消滅害蟲。硫酰氟的物理特性使其能夠快速擴散并滲透到完整的木材或商品中，且無氣味殘留問題[19]。1961年以來，硫酰氟一直用作防治木材白蟻的熏蒸處理劑[23]。

表1為常見熏蒸劑的理化性質(zhì)[24-25]。

表1 常見熏蒸劑的理化性質(zhì)

農(nóng)業(yè)方面，熏蒸劑主要用于土壤熏蒸處理及糧倉熏蒸處理。土壤熏蒸處理分為：①化學(xué)熏蒸，如使用氯化苦、棉隆等；②生物熏蒸，如利用新鮮雞糞或新鮮牛糞等動植物廢棄物，與土壤混合后覆膜[26]。目前，國際上已經(jīng)登記使用的土壤熏蒸劑有：氯化苦、棉隆、威百畝、硫酰氟、1,3-二氯丙烯（1,3-D）、二甲基二硫、碘甲烷、異硫氰酸烯丙酯、乙二腈（ethanedinitrile，EDN）。尚未登記的潛在熏蒸劑品種有：甲酸乙酯（ethyl formate）、糖醛（furfural）、丙烯醛（2-propenal）[9]。磷化鋁（aluminium phosphide）及硫酰氟作為儲糧熏蒸劑目前已在國內(nèi)外廣泛登記使用，硫酰氟也作為土壤熏蒸劑在我國登記用于防治根結(jié)線蟲病的發(fā)生。此外，疊氮化物、乙蒜素等熏蒸劑也在陸續(xù)研發(fā)中。

目前，熏蒸劑對靶標生物作用機制方面的研究相對較少，大多圍繞熏蒸劑對土壤微生物、土壤養(yǎng)分、農(nóng)藥殘留、環(huán)境行為等方面進行研究。隨著熏蒸劑的頻繁使用，害蟲和病原菌可能會對其產(chǎn)生抗藥性[27]。深入研究其作用機制有利于為新型熏蒸劑的設(shè)計和合成提供理論依據(jù)，推動農(nóng)藥科技創(chuàng)新，延緩或避免抗藥性的出現(xiàn)。在探究熏蒸劑作用機制方面，對AITC、DMDS等新型熏蒸劑的研究相對其他熏蒸劑較多。

2 熏蒸劑分子結(jié)構(gòu)與毒性效應(yīng)的關(guān)系

熏蒸劑是以氣體分子形式進行作用的藥劑，熏蒸劑的分子結(jié)構(gòu)與其毒性效應(yīng)之間存在直接關(guān)系。不同的熏蒸劑，其分子結(jié)構(gòu)決定了它們的物理化學(xué)性質(zhì)（如揮發(fā)性、溶解度、穩(wěn)定性等），進而影響其在環(huán)境中的分布和作用方式，以及對目標生物體的毒害效果。

2.1 官能團活性

熏蒸劑分子上的特定官能團，如鹵素、二硫鍵、氨基甲酸酯基團等，可能與生物體內(nèi)的酶或蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，干擾正常的生理功能。如異硫氰酸甲酯（MITC）及AITC中的-N=C=S官能團可與某些具有親核位點的蛋白和酶等發(fā)生反應(yīng)，使蛋白質(zhì)失活[28]；磷化鋁同時含有共價鍵、離子鍵、金屬鍵，其化學(xué)性質(zhì)較為活潑，遇水可迅速反應(yīng)生成有毒的磷化氫氣體，從而起到殺蟲的作用[29]。

2.2 相對分子質(zhì)量與揮發(fā)性

相對分子質(zhì)量大小與擴散及滲透能力相關(guān)，而揮發(fā)性則與藥劑的飽和蒸氣壓有關(guān)。較小的相對分子質(zhì)量通常意味著較高的擴散和滲透能力，有助于熏蒸劑快速分散到環(huán)境中，并滲透到靶標生物的細微部位，直接影響藥效。如DMDS是一種以硫化物為基礎(chǔ)的揮發(fā)性化合物[30]，其相對分子質(zhì)量較小，但擴散及滲透能力很強，對土傳病原菌及根結(jié)線蟲防治效果極佳。GóMEZ等[31]在一個有12年根結(jié)線蟲侵染史的溫室大棚中進行DMDS的熏蒸試驗。施藥前根結(jié)線蟲J2每100 cm3土壤364～4 044條，經(jīng)過處理后，土壤中未發(fā)現(xiàn)幼蟲，且消毒區(qū)的尖孢鐮刀菌種群密度顯著低于未處理的對照區(qū)，從第一茬到第二茬，種群減少了66.18%～77.55%。

2.3 穩(wěn)定性和持久性

不同熏蒸劑由于其分子結(jié)構(gòu)、官能團及所處環(huán)境的不同，其在土壤中降解機制及半衰期也不盡相同。如土壤中的微生物主要降解MITC中的異硫氰酸酯官能團，而1,3-D具有許多能將其降解并將其作為唯一的碳和能量來源的細菌，且反式異構(gòu)體在土壤中的降解速率大于順式[32]。此外，溫度及濕度對土壤微生物的降解影響較大，GAN等[33]發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高，熏蒸劑的降解速率增加，但當溫度高于30℃時，微生物對1,3-D的降解受到顯著抑制，而對MITC的微生物降解有很大的刺激作用。隨著土壤含水率的增加，1,3-D的降解速度加快，但MITC的降解速度減小。

3 熏蒸劑對生物膜的影響及穿透機理

熏蒸劑對生物膜的影響及穿透機理是其殺蟲、殺菌或殺線蟲活性的重要影響因素。生物膜，如昆蟲的表皮、微生物的細胞膜、細胞壁等，通常是阻止外界物質(zhì)入侵的第一道防線[34]。熏蒸劑必須克服這一障礙才能有效發(fā)揮作用。

3.1 溶解及擴散作用

多數(shù)熏蒸劑都具有較強的極性，難溶于水，易溶于有機溶劑，如1,3-D難溶于水，可溶于丙酮、苯及四氯化碳。碘甲烷具有較低的蒸氣壓及較高的沸點，且其在土壤中的吸附系數(shù)Kd較大，亨利常數(shù)Kh較小，在土壤中較易吸附，擴散性良好[35]；硫酰氟的滲透擴散能力較強，是溴甲烷的5～9倍[36]。由于熏蒸劑的氣體分子優(yōu)勢，某些熏蒸劑還可以通過擴散的方式進入生物體中，如昆蟲對磷化氫的吸收是通過體壁或氣門的氣體擴散作用實現(xiàn)[37]。

3.2 直接破壞生物膜結(jié)構(gòu)

Lin等[38]研究發(fā)現(xiàn)，AITC可以破壞細胞膜，當AITC質(zhì)量濃度為25 mg/mL時，可使活的大腸桿菌數(shù)量降至1/1 000，且AITC對革蘭氏陰性菌比革蘭氏陽性菌更有效。Zhang等[39]施用6 mg/L MITC后12 h，其對尖孢鐮刀菌的抑制率為80%，觀察發(fā)現(xiàn)，尖孢鐮刀菌細胞壁和細胞膜皺縮、液泡增多，且與尖孢鐮刀菌細胞壁相關(guān)的幾丁質(zhì)合成酶的一些關(guān)鍵基因的表達受到影響，膜轉(zhuǎn)運蛋白活性下調(diào)，過氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性降低。小核盤菌是一種寄主范圍較廣的病原菌，Tyagi等[40]采用雙培養(yǎng)皿試驗法，測定了DMDS對其菌絲、菌核形成及萌發(fā)的抑制作用。結(jié)果表明，在濃度為75～100 μmol/L時，DMDS完全抑制了菌絲的生長，染色后用熒光顯微鏡、掃描電鏡和透射電鏡觀察細胞壁和細胞膜的完整性，發(fā)現(xiàn)細胞壁破壞，細胞質(zhì)泄露，細胞器退化，液泡變大，細胞質(zhì)積累。再利用高效液相色譜法研究麥角甾醇含量與去甲基酶基因表達，經(jīng)DMDS處理后，麥角甾醇含量比對照組降低了80%，此外，DMDS處理顯著下調(diào)了CYP51的轉(zhuǎn)錄水平。試驗結(jié)果表明，抑制麥角甾醇的生物合成是DMDS影響小核盤菌生長的主要作用方式。

一些植物源或生物基的熏蒸劑如某些精油成分，在一定條件下也可能影響細胞膜上的載體蛋白，造成離子通道受損。于泓鵬等[41]采用肉桂精油水浴加熱的氣相熏蒸方式對白色葡萄球菌進行抗菌試驗，通過測定溶液的電導(dǎo)率來確定細胞膜的通透性。隨著精油濃度的增加，電導(dǎo)率迅速降低，推測細胞膜載體蛋白發(fā)生變性，從而造成細菌體內(nèi)離子外流，降低了細胞膜的通透性。盡管它們通常不是傳統(tǒng)意義上的熏蒸劑，但在低濃度下用于熏蒸或處理時，也表現(xiàn)出對膜結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)節(jié)作用，為熏蒸劑的研發(fā)及作用機制的研究提供了一定的參考。

4 熏蒸劑干擾生物體新陳代謝過程的途徑

4.1 細胞中毒引起的直接損傷

當熏蒸劑作用于病原物時，可能會導(dǎo)致細胞中毒概率的增大。如氯化苦為中等毒性農(nóng)藥，所產(chǎn)生的氣體比空氣重5倍，其蒸氣進入生物體組織后，會生成強酸性物質(zhì)，使細胞腫脹腐爛，還可使細胞脫水，細胞內(nèi)蛋白質(zhì)沉淀，造成生理機能破壞，使細胞中毒死亡[36]。Fang等[42]研究表明：在質(zhì)量濃度為1.2 μg/L時，氯化苦幾乎完全抑制了尖孢鐮刀菌菌絲的生長，且對鐮刀菌的呼吸有輕微的抑制作用。通過監(jiān)測真菌釋放的二氧化碳量，將其作為評估真菌呼吸強度的一個指標，發(fā)現(xiàn)抑制程度隨濃度的增加而增加。且超微結(jié)構(gòu)研究表明，氯化苦質(zhì)量濃度從1.2 μg/L增加到2.4 μg/L時，細胞壁的分離越來越明顯，導(dǎo)致細胞膜破裂和細胞質(zhì)滲漏，細胞器細胞質(zhì)外流。Wang等[43]根據(jù)高通量測序結(jié)果判定，經(jīng)氯化苦熏蒸1個月后，三七田間土壤中鐮刀菌種群量明顯減少，且熏蒸改變了土壤中木霉屬、毛殼屬、變形菌和綠彎菌門的相對豐度，同時抑制了大量的鐮刀菌和疫霉菌。

4.2 呼吸鏈抑制

許多熏蒸劑能夠直接或間接地作用于細胞內(nèi)的氧化磷酸化過程，特別是線粒體的電子傳遞鏈。Calmes等[44]研究了AITC對油菜鏈格孢菌的作用機制，發(fā)現(xiàn)真菌的耗氧率降低。使用JC-1染料的綠色/紅色熒光比率作為線粒體膜電位的指示器，也是線粒體功能的指標，觀察結(jié)果表明，AITC可以迅速誘導(dǎo)線粒體功能和細胞能量代謝的改變。用水溶性熒光探針測定AITC作用60 min后菌絲的耗氧量，發(fā)現(xiàn)AITC明顯抑制了蕓苔菌野生型（WT）菌株Abra43細胞的呼吸，在10 mmol/L時抑制率達40%。此外，Zhang等[45]提出了細胞骨架坍塌和線粒體功能障礙是AITC對玉米象的致死機制。張超[46]研究表明，用辣根素處理玉米象后中毒試蟲線粒體結(jié)構(gòu)受到顯著破損，辣根素熏蒸對線粒體呼吸鏈的抑制效果會引起試蟲體內(nèi)活性氧（ROS）的產(chǎn)生和累積，并對ROS相關(guān)酶系有不同的影響。硫酰氟是一種良好的土壤及倉儲熏蒸劑，早期對于殺滅害蟲白蟻的作用機制被解釋為阻斷了糖酵解和脂肪酸循環(huán)，氧化磷酸化過程受到了一定的影響[47]。即通過抑制昆蟲對氧的吸收，破壞昆蟲正常的磷酸鹽平衡，阻止昆蟲體內(nèi)的脂肪酸水解，從而導(dǎo)致昆蟲的死亡[48]。磷化氫殺蟲機理是通過呼吸或表皮進入蟲體后，與細胞色素氧化酶結(jié)合使該酶失去活性，造成生物氧化過程中斷，害蟲因窒息而死亡[49]。Wang等[50]采用DMDS對南方根結(jié)線蟲進行觸殺及熏蒸試驗。結(jié)果表明，藥劑干擾了鈣離子通道，影響了呼吸作用氧化磷酸化的不同復(fù)合體。熏蒸和觸殺模式的作用機制不同：在觸殺方式下DMDS破壞了線蟲的體表結(jié)構(gòu)，作為解偶聯(lián)劑干擾了ATP合酶，刺激了線蟲的呼吸；在熏蒸方式下DMDS通過嗅覺感知-氧交換過程進入線蟲體內(nèi)，最終作用于呼吸作用電子傳遞鏈復(fù)合體Ⅳ或復(fù)合體Ⅰ，與氧化損傷疊加，使線蟲死亡。

4.3 抑制酶活性

熏蒸劑可通過與細胞內(nèi)各種酶的活性部位結(jié)合，改變其構(gòu)象或直接抑制其功能，進而影響一系列生化反應(yīng)的進行；還可以作為競爭性抑制劑與底物競爭酶的活性位點，阻止正常的代謝中間產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。

1,3-D在生物體內(nèi)發(fā)生烷基化反應(yīng)使酶失去活性，從而導(dǎo)致害蟲死亡[51]。溴甲烷能夠與硫氫基（—SH）結(jié)合，對害蟲和病原微生物體內(nèi)的多種酶產(chǎn)生不可逆的抑制作用，從而破壞其正常的生理功能[6]。Isshiki等[52]采用AITC作用于酵母菌進行的研究表明，通過裂解二硫鍵和干擾電子傳遞鏈中的特定酶而使非特異性酶失活是其抑制酵母菌生長的可能機制。DZ可通過MITC的羰基化反應(yīng)來破壞生物體內(nèi)酶結(jié)構(gòu)，達到殺蟲滅菌的效果[26]。作為一種有潛力的防治土壤線蟲的綠色熏蒸農(nóng)藥，經(jīng)乙蒜素處理后，半胱氨酸、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶被激活，通過其氧化特性觸發(fā)酵母細胞的凋亡，可以引起關(guān)鍵酶的特異性氧化失活[53-54]。磷化氫還可抑制蟲體的過氧化氫酶，使其失去催化分解過氧化氫的能力，導(dǎo)致蟲體內(nèi)過氧化氫的積累，引起害蟲生理中毒，致使害蟲病變或死亡[49]。

4.4 核酸損傷與蛋白質(zhì)合成干擾

化學(xué)熏蒸劑對有害生物體內(nèi)蛋白質(zhì)具有不可逆的化學(xué)作用，可與蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性和失活，從而破壞依賴這些蛋白質(zhì)的生理代謝途徑。棉隆和威百畝能在土壤中水解，分解成有毒的MITC，可以通過氨基甲?；磻?yīng)使蛋白失活[51]。有研究表明，AITC可以在抑制微生物生長的濃度下改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，氧化的谷胱甘肽被AITC在二硫鍵上切割，并在這些蛋白質(zhì)的賴氨酸和精氨酸殘基上形成硫代類似物[38]。AITC在水溶液中不穩(wěn)定且容易分解。Kawakishi[55-56]等發(fā)現(xiàn)，AITC還攻擊蛋白質(zhì)中賴氨酸和精氨酸殘基的游離氨基，通過氨基酸分析和游離氨基的測定檢測到該游離氨基形成了類似硫脲的衍生物。此外，異硫氰酸酯對硫原子的親電攻擊還可將胱氨酸殘基中的二硫鍵氧化斷裂為二硫代氨基甲酸酯和硫酸鹽[57]。AITC具有引起位點特異性DNA損傷的能力，具有較短亞甲基鏈的ITC可以產(chǎn)生更大量的—SH基團，導(dǎo)致更強的DNA損傷，而DNA的氧化損傷可能在異硫氰酸烯丙酯致癌過程中起重要作用[58]。

4.5 神經(jīng)元膜電位干擾

DMDS的作用機制可以理解為引起線粒體功能障礙及激活K-ATP通道[59]。Dugravot等[60]發(fā)現(xiàn)，二甲基二硫殺蟲效果良好，其通過對線粒體呼吸鏈復(fù)合體IV（細胞色素氧化酶）的抑制，降低細胞內(nèi)的ATP濃度，從而激活神經(jīng)元K-ATP通道，引起膜超極化并導(dǎo)致神經(jīng)元活動的降低。Gautier等[61]采用全細胞膜片鉗技術(shù)、鈣離子成像和反義寡核苷酸設(shè)計策略，研究了DMDS對蟑螂神經(jīng)分泌細胞DUM神經(jīng)元的影響，證實了鈣激活的鉀電流K-Ca是DMDS的作用靶點。

總之，熏蒸劑通過以上方式或其他方式干擾生物體內(nèi)的新陳代謝途徑，導(dǎo)致生物體生理機能受損甚至死亡。不同種類的熏蒸劑因其獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)和毒性機制，對生物體新陳代謝的具體影響也有所不同，可以看出，熏蒸劑的作用位點較多[62]。多數(shù)熏蒸劑可以通過破壞生物體內(nèi)酶的合成以及干擾呼吸鏈而對靶標生物起作用。異硫氰酸烯丙酯對靶標生物的作用方式較為多樣，且其為來源于十字花科植物的次生代謝物，對環(huán)境影響較小，是一種很有潛力的熏蒸劑。

常見熏蒸劑作用機制分類見表2。

表2 熏蒸劑作用機制分類

5 結(jié)語

5.1 針對特定靶標生物優(yōu)化熏蒸劑配方設(shè)計

熏蒸劑具有廣譜性，可一次殺滅土壤中多數(shù)有害微生物，但也會同時影響土壤中其他微生物的種群數(shù)量[63-64]。因此，應(yīng)提高熏蒸劑的選擇性，降低影響非靶標生物的風(fēng)險。針對靶標生物的特性研發(fā)其適用的藥劑，探索熏蒸劑對靶標生物的作用機制，在降低有害生物的同時減少對其他菌落的影響。

5.2 環(huán)境友好型熏蒸劑的研發(fā)趨勢與挑戰(zhàn)

目前，國家推進化肥、農(nóng)藥減量化，生物熏蒸、化學(xué)熏蒸與生物熏蒸相結(jié)合可能會成為新的研究方向[65]。生物源制劑在維持環(huán)境友好方面起著重要的作用，但由于其結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性，目前難以大規(guī)模進行土壤熏蒸使用。如植物根結(jié)線蟲病較難防治，是一種在世界范圍內(nèi)具有重要經(jīng)濟意義的專性內(nèi)寄生植物線蟲[66]；淡紫擬青霉是一種線蟲寄生菌，將熏蒸劑與生防制劑結(jié)合進行熏蒸則對環(huán)境友好[67]。

5.3 展望

熏蒸劑的重復(fù)使用，可能會導(dǎo)致土壤中熏蒸劑消耗速率加快，有效時間縮短[68]。目前，對熏蒸劑機制的研究還有待加強，生物熏蒸劑的大面積推廣也需要時間去實現(xiàn)。對于熏蒸劑作用機制的研發(fā)可以為新型土壤熏蒸劑的安全、高效應(yīng)用提供理論依據(jù)。