何 松,湯德元,毛茵茗,周 飄,陳閶崢,羅 柳,陳 旭,廖正波,袁盛林

(貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,貴州貴陽 550025)

豬偽狂犬病(Porcine pseudorabies,PR)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的傳染病,該病毒屬皰疹病毒科、α皰疹病毒亞科、豬皰疹病毒屬,PRV的核酸為雙股線狀DNA,可編碼70～100種蛋白質(zhì),目前發(fā)現(xiàn)和命名的有11種糖蛋白,其中TK、gE為PRV主要的毒力基因[1]。豬作為PRV唯一的自然宿主,可引起母豬產(chǎn)死胎、木乃伊胎和屢配不孕;公豬睪丸萎縮、精液質(zhì)量下降,喪失種用功能;新生仔豬出現(xiàn)高熱、神經(jīng)癥狀且2周齡以內(nèi)的仔豬病死率可達(dá)100%。2011年之前,由于Bartha-K61疫苗在我國得到廣泛使用,使PR在我國得到了較好的控制,但自從PRV出現(xiàn)變異后,其毒力增強(qiáng),Bartha-K61疫苗對養(yǎng)豬業(yè)已經(jīng)不能提供完全保護(hù),PR在養(yǎng)豬業(yè)再度流行起來,給養(yǎng)殖者造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)估計(jì)PR每年給全球養(yǎng)豬業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失僅次于口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)和豬瘟(Classical swine fever,CSF)。因此,對PRV快速、準(zhǔn)確檢測已成為防控和凈化PR的重要措施,本文對PR診斷方法和疫苗的研究做了綜述,旨在為相關(guān)養(yǎng)殖場PRV的檢測和防控提供參考。

1 診斷方法

1.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是運(yùn)用抗體和抗原特異性結(jié)合的原理來對PRV進(jìn)行檢測,該方法具有操作簡單、特異性好、敏感性高、樣品檢測所需時間短,可同時對多個樣品進(jìn)行檢測等優(yōu)點(diǎn)。黃雨晴等[2]以PRV gB重組蛋白作為包被抗原,辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的山羊抗豬為二抗,建立了PRV IgA的間接ELISA檢測方法,利用該方法對PRV黏膜免疫的仔豬進(jìn)行檢測,結(jié)果在仔豬鼻腔黏液中檢測到特異的IgA抗體,為PRV黏膜免疫的初步檢測提供了方法。通過重組PRV gB、gC、gD蛋白,建立以gB/C/D為包被抗原的間接夾心ELISA,用該方法對184份PRV陽性血清進(jìn)行檢測,結(jié)果重組蛋白ELISA與IDEXX試劑盒相比其陽性和陰性符合率分別為98.83%和100%,批內(nèi)和批間變異系數(shù)均低于5%,表明重組蛋白ELISA的特異性高、靈敏度好,具有較好的應(yīng)用前景[3]。以原核表達(dá)的PRV gD和gE蛋白作為檢測抗原,建立gD和gE間接ELISA方法,兩種方法對PRV陽性血清的最低檢測敏感性分別可達(dá)到1∶25 600和1∶1 280,對豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)等6種病毒抗原的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清無交叉反應(yīng),并且gE間接ELISA對PRV免疫血清檢測為陰性,批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)分別低于5%和7%,聯(lián)合應(yīng)用兩種方法對2 156份臨床血清樣品進(jìn)行檢測,結(jié)果PRV抗體陽性率為88.96%,PRV野毒抗體陽性率為4.04%,PRV免疫抗體陽性率為84.93%,表明gD和gE間接ELISA能夠鑒別疫苗免疫抗體和野毒抗體,具有良好的敏感性、特異性和重復(fù)性,這為豬場PR的防控和凈化提供了方法支撐[4]。

1.2 聚合酶鏈反應(yīng)

聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)是目前快速擴(kuò)增特定基因片段最常用的方法。該方法是將擴(kuò)增后獲得的目的片段進(jìn)行電泳,根據(jù)不同核酸的相對分子質(zhì)量在電泳中的遷移率不同,從而將目的核酸與其他病原核酸分離。PCR與其他傳統(tǒng)方法相比具有耗時較少、特異性和靈敏度高等特點(diǎn)。將可視化的橫向流動試紙條(LFD)與PCR技術(shù)結(jié)合,實(shí)現(xiàn)了對PRV野毒株的特異、快速檢測,對PRV Bartha-K61株、多種病毒和細(xì)菌均無交叉反應(yīng),重復(fù)性好,對50份樣品進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn),與PCR相比其敏感性更高,該方法不需要電泳步驟即可讀取結(jié)果,有利于基層技術(shù)人員現(xiàn)場檢測[5]。將納米材料加入到PCR反應(yīng)體系中,優(yōu)化后建立PRV納米PCR,與常規(guī)PCR相比,其退火溫度更加寬泛,不受靶基因GC含量和引物Tm值影響,對高GC含量靶基因的反應(yīng)液更容易擴(kuò)增,該技術(shù)為優(yōu)化PCR檢測PRV提供了新思路[6]。近年來,由于多重PCR能夠?qū)ο嗨频牟±M(jìn)行鑒別診斷而受到重視。根據(jù)Ⅱ型PRV gC基因上與Ⅰ型PRV不同的多位點(diǎn)穩(wěn)定差異基序,建立雙重PRV基因分型PCR,該方法能夠準(zhǔn)確鑒定PRV 基因型,針對Ⅰ、Ⅱ型 PRV 的最低檢測限均為1×104拷貝,對豬流行性腹瀉病毒(Porcien epidemic diarrhea virus,PEDV)等6種病毒無交叉反應(yīng),對44份豬臨床病料進(jìn)行檢測,結(jié)果與常規(guī)PCR相比符合率達(dá)到100%,該方法對PRV流行病學(xué)調(diào)查提供了有效技術(shù)手段[7]。建立PRV等多重PCR[8],可對PRRSV等3種繁殖障礙性疫病進(jìn)行檢測,對PRV最低檢測限度為14.60 pg,對臨床上收集的168份病料進(jìn)行檢測,結(jié)果為陽性的樣品再用商品化的試劑盒進(jìn)行檢測,符合率達(dá)100%。在此基礎(chǔ)上對豬日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)、豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus,PPV)進(jìn)行檢測,建立四重PCR,對51份廣西地區(qū)出現(xiàn)豬繁殖障礙臨床癥狀的樣品進(jìn)行檢測,與特異性檢測方法相比結(jié)果一致,該方法具有良好的特異性、敏感性及重復(fù)性,但該研究中臨床樣本量較少,仍需要應(yīng)用該方法對疑似陽性更大數(shù)量的臨床樣品進(jìn)行檢測,以進(jìn)一步評估其臨床效果[9]。針對PRV等疫病建立7重PCR,對貴州地區(qū)的150份病料進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)病豬中出現(xiàn)混合感染的高達(dá)80%,病豬臨床表現(xiàn)多樣化,表明養(yǎng)豬場混合感染較為普遍,PRV多重PCR的建立可為養(yǎng)豬場防控和逐步凈化各種疫病提供技術(shù)指導(dǎo)[10]。

1.3 實(shí)時熒光定量PCR

實(shí)時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qPCR)是由核酸探針技術(shù)、熒光共振傳遞技術(shù)和PCR三者結(jié)合而成,可對樣品起始模板量進(jìn)行絕對定量,其特異性、靈敏度比普通PCR更高,因而在對病原核酸檢測中得到廣泛應(yīng)用。通過單疊氮丙錠(PMA)核酸染料在分解時能產(chǎn)生與PRV核酸共價交聯(lián)的氮烯化合物的特性,用該核酸染料與qPCR結(jié)合建立了PMA-qPCR技術(shù),當(dāng)PMA濃度范圍為50 ～100 μL時,熱滅活就能區(qū)分感染豬的PRV是否具有傳染性,檢出率可達(dá)96%,該方法穩(wěn)定、特異性高,可為PRV消毒效果評價等提供技術(shù)指導(dǎo)[11]。為了能夠更快速、特異對病豬的多種疾病進(jìn)行鑒別診斷,建立了三重qPCR[12],該方法能夠?qū)RV經(jīng)典株、變異株和Bartha-K61疫苗株不同株系進(jìn)行鑒別,對Bartha-K61、TJ 株、SC株的檢測限分別為5、50和50拷貝,通過該方法對234個樣品進(jìn)行檢測,結(jié)果與病毒分離方法相比經(jīng)典株、變異株和Bartha-K61疫苗株的符合率分別為100%、99.2%和100%,表明該方法靈敏度和特異性極好,可用于不同PRV毒株的區(qū)別檢測,同時還建立了一種交叉引物擴(kuò)增試紙條聯(lián)用法(CPA-strip),用于檢測PRV野毒,該檢測方法對PRV變異株的最低檢測限為200個拷貝,對293個臨床樣品進(jìn)行檢測,結(jié)果與三重qPCR的符合率為100%,與病毒分離方法的符合率為97.3%,該方法操作簡單,可用于臨床現(xiàn)場檢測。有研究建立了可同時檢測和區(qū)分8種常見豬病毒和細(xì)菌病原體的多重TaqMan qPCR,能夠?qū)ωi圓環(huán)病毒2型(Porcine circovious 2,PCV2)等4種常見病毒性疫病和豬鏈球菌(S.suis)等4種常見細(xì)菌性疾病病原體進(jìn)行檢測,該方法具有較好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)R2均大于0.997,變異系數(shù)低于5%,其靈敏度與普通PCR相比高出10倍多,比四重qPCR檢測范圍更廣,該方法為豬體內(nèi)多種病原體的流行病學(xué)調(diào)查、診斷和鑒別提供了技術(shù)支持[13]。與常規(guī)PCR方法相比,qPCR方法具有更高的靈敏度且可進(jìn)行準(zhǔn)確定量,但是qPCR方法的應(yīng)用需要昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器以及專業(yè)的操作人員,因此無法大范圍推廣應(yīng)用。

1.4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技術(shù)是在等溫條件下對核酸進(jìn)行擴(kuò)增的新技術(shù)?；赑RV gB蛋白的保守性設(shè)計(jì)引物,建立PRV的LAMP檢測技術(shù),并把羥基萘酚藍(lán)(hydroxy naphthol blue,HNB)應(yīng)用于LAMP反應(yīng)體系中作為結(jié)果判定的指示劑,對PRV檢測限為10拷貝,與PCR特異性一致,敏感性比PCR高出103倍,當(dāng)HNB濃度為150 μmol/L時,陰、陽對照組的顏色有明顯差異,含有HNB的LAMP體系可定性的用于擴(kuò)增產(chǎn)物的判斷[14]。根據(jù)PRV DBP基因序列設(shè)計(jì)6對引物,建立PRV-LAMP檢測方法[15],在40 min內(nèi)就可以得到最佳結(jié)果,對JEV等4種病毒無交叉反應(yīng),特異性好,與丹明B衍生物熒光染料相結(jié)合后,陽性樣品顏色呈現(xiàn)為藍(lán)色,陰性樣品為紫色,可直接讀取結(jié)果,該方法縮短了PRV檢測時間,提高了檢測效率。用LAMP與pH指示劑結(jié)合構(gòu)建了對PRV野毒株快速檢測方法[16],與qPCR敏感性一致,檢測極限為100.5TCID50,對52份臨床樣品檢測,結(jié)果與qPCR檢測相比,兩者符合率為94.2%,該方法結(jié)果易判斷,檢測成本低,可預(yù)期應(yīng)用于PRV隱性感染豬的快速篩查。在應(yīng)用離心微流體盤(centrifugal microfluidic disk,CMFD)的基礎(chǔ)上,建立可同時檢測6種疫病病原進(jìn)行的LAMP[17],通過與微流控芯片技術(shù)結(jié)合,可以在60 min內(nèi)得到結(jié)果,對多種病毒無交叉反應(yīng),檢測極限為320拷貝,該方法能更靈敏地檢測病毒混合感染。

1.5 其他方法

基于Fe3O4和SiO2-NH2磁性聚合物微球和多壁碳納米管(magnetic polymer microspheres and multi walled carbon nanotubes,MWCNTs)的新型紙質(zhì)生物傳感器,可對PRV進(jìn)行快速檢測,檢測限為10 ng/ mL[18]?？焖贆z測PRV野生型分離株和gE基因缺失病毒疫苗的雙重液滴數(shù)字PCR(duplex droplet digital PCR,ddPCR)技術(shù)[19],與TaqMan qPCR相比,ddPCR的檢測限為4.75拷貝,比qPCR敏感性高16倍,且在極低濃度下ddPCR仍然能保持線性關(guān)系,該方法可為PRV的早期檢測提供技術(shù)支持。基于聚二甲基硅氧烷的固相蛋白芯片平臺,可對PRV gD和gE抗體進(jìn)行雙重檢測,用純化的gD和gE蛋白通過自動點(diǎn)樣器包被到高度疏水的納米膜上,測定其灰度值來對結(jié)果進(jìn)行判斷,該方法與中和試驗(yàn)相比,在免疫豬血清樣品的gD抗體測試中顯示出相同的靈敏度,但擁有比商業(yè)gE抗體檢測試劑盒更高的靈敏性,具有較好的應(yīng)用前景[20]。

2 疫苗研究

2.1 滅活疫苗

PRV滅活疫苗是將分離得到的PRV野毒株經(jīng)滅活劑滅活后,加入一定量的佐劑乳化而成。陳煥春在2001年基于PRV鄂A株病料成功研制了我國第1個PR全病毒油乳滅活疫苗,該疫苗具有較高的免疫保護(hù)效力,但自從PRV出現(xiàn)變異毒力增強(qiáng)后,該疫苗無法對養(yǎng)豬場提供完全保護(hù)。有研究分離出高毒性PRV株 FJ-2012,制備了FJ-2012ΔgE/gI-GEL02和FJ-2012ΔgE/gI-206VG 兩種缺失gE/gI基因的PRV滅活疫苗,通過免疫仔豬來評估兩種疫苗的免疫效果,發(fā)現(xiàn)兩種疫苗對PRV FJ-2012攻擊均有效,仔豬均存活,并產(chǎn)生了高水平的gB特異性抗體和中和抗體,表明該疫苗能夠在一定程度上保護(hù)仔豬[21]。環(huán)二聚鳥苷一磷酸(cyclic dimeric guanosine monophosphate,c-di-GMP)對小鼠具有免疫調(diào)節(jié)活性,將c-di-GMP 作為PRV滅活疫苗的免疫增強(qiáng)劑,發(fā)現(xiàn)PRV滅活疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)得到提高,免疫效果達(dá)到了與減毒活疫苗相當(dāng)?shù)乃?這為改善PRV滅活疫苗免疫效力研究開辟了新的道路[22]。PRV自然感染豬的途徑是鼻腔和口腔,因此PRV的鼻內(nèi)免疫接種顯得尤為重要,但目前我國豬鼻內(nèi)PRV疫苗免疫效果不甚理想。為了彌補(bǔ)這方面的不足,開發(fā)了一種由MONTANIDETMGel 01和CVCVA5組成的聯(lián)合佐劑[23],應(yīng)用于PRV鼻內(nèi)滅活疫苗接種小鼠后,用PRV強(qiáng)毒攻擊小鼠發(fā)現(xiàn)與其他單一佐劑疫苗相比,聯(lián)合佐劑誘導(dǎo)了更大的黏膜IgA免疫和血清抗體反應(yīng),明顯提高了PRV鼻內(nèi)滅活疫苗的免疫效力,可誘導(dǎo)長期T淋巴細(xì)胞記憶,提供長期保護(hù)。傳統(tǒng)滅活疫苗具有安全性高,在豬體內(nèi)不會發(fā)生隱性感染等特點(diǎn),但與弱毒疫苗相比,傳統(tǒng)滅活疫苗具有抗原含量不足、接種量大、需多次接種且免疫效果不佳等多種缺陷。

2.2 弱毒疫苗

弱毒疫苗通常是將PRV毒株在非易感細(xì)胞或雞胚上經(jīng)多次傳代使其毒力減弱而制備的疫苗,與傳統(tǒng)的滅活疫苗相比,弱毒疫苗具有良好的免疫原性,更能激發(fā)機(jī)體全面的免疫應(yīng)答。有研究以PRV變異株HeB12為基礎(chǔ),制備缺失gE、gI和TK基因的gE/gI/TK PRV凍干活疫苗[24],該新型三基因缺失變異活疫苗對經(jīng)典RA株和變異體TJ12株具有完全的交叉保護(hù)作用,在一定程度上彌補(bǔ)了Bartha疫苗的不足。用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除了PRV gI、gE、US9和US2基因,研制了P-RV GDFS-delgI/gE/US9/US2減毒活疫苗,該疫苗對仔豬不產(chǎn)生gE特異性抗體,但可以產(chǎn)生gB特異性抗體和針對PRV GDFS株或PRV Ea株的高中和效價,免疫效果好,可以對仔豬中新出現(xiàn)的部分PRV變異毒株提供全面保護(hù)[25]。增加PRV TK基因的敲除,開發(fā)一種PRV GX-ΔTK/IES弱毒疫苗,用PRV GX-ΔTK/IES疫苗和商業(yè)疫苗分別對小鼠接種,發(fā)現(xiàn) GX-ΔTK/IES疫苗誘導(dǎo)的免疫力和保護(hù)水平均優(yōu)于商業(yè)活疫苗,對非目標(biāo)和目標(biāo)動物均安全,該疫苗有望成為新型的PRV基因缺失活疫苗的候選疫苗[26]。

2.3 基因缺失疫苗

PR基因缺失疫苗保留了PRV的免疫原性,敲除了PRV單個或多個毒力基因而構(gòu)建的,具有對敏感動物致病極弱,不易出現(xiàn)返毒現(xiàn)象等特點(diǎn)。以PRV變異毒株HNXY為基礎(chǔ),構(gòu)建gE和TK雙基因缺失的毒株rPRV-HNXY-ΔgE/ΔTK[27],該毒株對小鼠無致病力,對新生仔豬安全且能產(chǎn)生免疫抗體,散毒可能性極低。構(gòu)建gE/TK/US3多基因缺失的PRV ΔgE/TK/US3株[28],接種PRV ΔgE/TK/US3的小鼠可誘導(dǎo)更高水平的 PRV 特異性中和抗體和IFN-γ等細(xì)胞因子,比PRV ΔgE/TK免疫原性更高,為養(yǎng)殖戶提供了更多疫苗選擇。用PRV HN1201毒株構(gòu)建多重基因缺失的rHN1201 TKΔ / gEΔ / gI Δ/ 11kΔ / 28kΔ株[29],將其免疫豬后其體溫明顯低于用經(jīng)典偽狂犬病疫苗免疫的豬,產(chǎn)生的特異性中和抗體對PRV經(jīng)典毒株和變異毒株均有效,可引發(fā)更早、更高水平的gB抗體,能夠?qū)γ庖哓i起到快速保護(hù)作用。PRV基因缺失疫苗是目前應(yīng)用最為廣泛的疫苗,此類疫苗免疫動物后,可以結(jié)合血清學(xué)方法鑒別野毒感染和疫苗免疫,在PRV的根除計(jì)劃中發(fā)揮了重要作用。

2.4 重組偽狂犬病毒載體疫苗

PRV基因組約為150 kb,含有73個基因,編碼的蛋白中有一半為PRV復(fù)制的非必需蛋白,這為PRV作為外源基因的理想載體提供了條件。用CRISPR/Cas gE基因編輯技術(shù)和同源重組技術(shù)構(gòu)建豬δ冠狀病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)刺突 (S) 蛋白的重組偽狂犬病病毒(rPRVXJ-delgE/gI/TK-S)[30],重組株rPRVXJ-delgE/gI/TK-S免疫小鼠后,其外周血中IFN-γ、IL-4表達(dá)上調(diào)和脾臟淋巴細(xì)胞增多,加強(qiáng)免疫后,在小鼠體內(nèi)檢測到PRV gB和PDCoV S特異性抗體,該疫苗具有良好的免疫源性,對強(qiáng)毒株P(guān)RV XJ的感染可以提供100%保護(hù),有望成為抗PRV和PDCoV的候選疫苗。以PRV變異株XJ和NADC30樣PRRSV株CHSCDJY-2019為親本,構(gòu)建了gE/gI/TK基因缺失共表達(dá)PRRSV GP5和M 蛋白的重組偽狂犬病病毒(rPRV)-NC56[31],用 rPRV-NC56 接種小鼠可誘導(dǎo) PRV和NADC30樣 PRRSV特異性體液和細(xì)胞免疫反應(yīng),為同時預(yù)防PRV和PRRSV感染帶來了曙光。以缺失了gG、gE和TK三重基因的PRV為疫苗載體,構(gòu)建含有PCV2b衣殼、CSFV-E2和Erns-牛粒細(xì)胞融合單核細(xì)胞集落刺激因子(Erns-GM-CSF)的三價疫苗(PRVtmv+)[32],該疫苗對豬安全且高度減毒, 用PCV2b感染豬后,PRVtmv+對免疫豬產(chǎn)生了比商業(yè)疫苗更好的保護(hù)作用,并對PRV和CSFV 產(chǎn)生了特異性中和抗體,可預(yù)期應(yīng)用于防控PRV、PRRSV和PCV的感染。由于重組偽狂犬病毒載體疫苗能夠起到一針多防的目的,因此研制基因工程活載體多價疫苗用于預(yù)防疫病成為了當(dāng)前熱點(diǎn)。

3 展望

PR尚無特效防治藥物,PRV易與其他疾病發(fā)生混合感染,我國擁有世界上最大生豬養(yǎng)殖量,不同地方對養(yǎng)殖場的管理制度有差異,這為防控PR增加了難度。近年來,發(fā)現(xiàn)有些天然產(chǎn)物如(S)-10-羥基喜樹堿(10-hydroxycamptothecin,10-HCPT)等對偽狂犬病毒復(fù)制具有抑制作用,能夠作為控制PRV感染的治療劑,也有用反密碼子工程轉(zhuǎn)移RNA(anticodon-engineered transfer RNAs,ACE-tRNA)等技術(shù)來控制含有過早終止密碼子(PTC)的PRV復(fù)制,使PRV在小鼠體內(nèi)完全失去毒力,進(jìn)而引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。雖然這些新藥和技術(shù)能夠在不同方面對PRV起作用,但尚處于研發(fā)的起始階段,無法在短時間內(nèi)投入應(yīng)用。因此,對PRV的快速、高效、準(zhǔn)確檢測,對豬群接種疫苗仍是防控和凈化PRV重要的手段。美國、日本等發(fā)達(dá)國家已經(jīng)成功根除和凈化了PRV,這為我國防控和凈化PRV提供了經(jīng)驗(yàn)。相信隨著對PRV結(jié)構(gòu)和功能研究的不斷深入以及技術(shù)的不斷發(fā)展,會研發(fā)新的檢測方法和安全有效的新型疫苗,使PRV在我國得到徹底凈化或根除。