杜 鵬,楊佳佳,向萬江,王藝舟,3,羅天麻 ,鮮思美,3*,王 碧,3*

(1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,貴州貴陽 550025;2.貴州省動物疫病研究室,貴州貴陽 550025;3.貴州省動物生物制品工程技術(shù)研究中心,貴州貴陽 550025)

雞球蟲病對養(yǎng)雞行業(yè)每年造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)35億美元[1]。其中柔嫩艾美耳球蟲(Eimeriatenella)致病力最強(qiáng),主要危害 15～50日齡雛雞,并專性寄生于雞的盲腸上皮細(xì)胞,引起的疾病又稱盲腸球蟲病;臨床主要表現(xiàn)為貧血、盲腸腫大、腹瀉便血、生長遲緩和突然死亡,帶球蟲成年雞一般不發(fā)病,但是其為主要傳染源[2-3]。E.tenella還能誘發(fā)雛雞機(jī)體炎癥損傷,造成白介素6(interleukin 6,IL-6)、白介素17(interleukin 17,IL-17)、γ干擾素(interferon-γ,IFN-γ)和白介素10(interleukin 10,IL-10)等炎性細(xì)胞因子異常變化[4-6]。

近年來治療雞球蟲病以地克珠利、馬杜霉素、妥曲珠利、磺胺類等化學(xué)藥物為主?；瘜W(xué)藥物防治效果明顯,但長期使用會造成嚴(yán)重的耐藥性[7],導(dǎo)致食品安全問題突出[8]。雞球蟲疫苗在一定程度上減少了球蟲病的暴發(fā),但使用不當(dāng)導(dǎo)致毒力恢復(fù)的風(fēng)險增加,并且疫苗具有局限性,對不同地區(qū)及不同毒株難以同時具有良好的保護(hù)效果[9]。

中藥因具有來源廣泛、不產(chǎn)生耐藥性、藥物殘留低及使用安全等優(yōu)勢而成為國內(nèi)外研究的熱點[10],但中藥各類繁多且不同組方之間的療效缺乏系統(tǒng)比較。因此,本研究前期借鑒人醫(yī)循證醫(yī)學(xué)的成功經(jīng)驗[11-12],以存活率為結(jié)局指標(biāo),檢索中國知網(wǎng)(CNKI)和PubMed數(shù)據(jù)庫中有關(guān)中藥組方治療E.tenella的相關(guān)文獻(xiàn),用Stata.15軟件對納入的文獻(xiàn)進(jìn)行網(wǎng)狀Meta分析,經(jīng)Rank療效排序發(fā)現(xiàn)以“常山”作為君藥構(gòu)建組方,對提高雛雞存活率的作用最大;再依據(jù)雞球蟲病的中獸醫(yī)辯證治療理論配制出以常山為君藥的組方“復(fù)方常青”,通過構(gòu)建E.tenella感染模型,使用該組方進(jìn)行治療,從病雞的增重情況、料肉比、盲腸病變、每克盲腸內(nèi)容物卵囊數(shù)、存活率、抗球蟲指數(shù)(anti-coccidial index,ACI)及細(xì)胞因子穩(wěn)態(tài)的變化等多方面來評價該組方的治療效果,以期為篩選安全高效的抗球蟲中藥以及對中藥抗球蟲機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗藥物 復(fù)方常青由常山、青蒿、黃芪、柴胡、地榆、白茅根、陳皮、仙鶴草和炙甘草組成,購自貴州省貴陽市太升中藥市場。地克珠利(100 mL/瓶),購于安徽省合肥市千方動保公司。

1.1.2 主要試劑 雞IL-10、IL-17、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測試劑盒,上海酶免生物科技公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,鄭州生化儀器有限公司產(chǎn)品;全自動酶標(biāo)儀,美國BioTeK Instruments公司產(chǎn)品;改良麥克馬斯特蟲卵計數(shù)板,上海碧歐環(huán)境儀器公司產(chǎn)品。

1.1.4 試驗動物及球蟲孢子化卵囊 220只黃羽肉雞(1日齡)購于貴州大學(xué)動物養(yǎng)殖場,在嚴(yán)格消毒無球蟲的環(huán)境下飼養(yǎng),且飼料飲水中不含任何抗球蟲成分。E.tenella孢子化卵囊由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院劉賢勇老師贈送,置于25 g/L重鉻酸鉀溶液于4℃冰箱避光保存,每3個月經(jīng)雞體復(fù)壯1次。

1.1.5 中藥制備 將青蒿、柴胡、陳皮等中藥浸泡30 min,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀收集揮發(fā)油及活性成分。藥渣與常山、地榆加入3～5倍的水再煮沸并文火維持30 min,過濾,重復(fù)煮制3次,濾液混合濃縮至每1 mL含生藥1 g,調(diào)pH7.0制成中藥原藥,裝瓶滅菌后放置于4℃冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 試驗分組 攻蟲之前,逐羽稱重,剔除過大過小、體弱的雛雞,再隨機(jī)分為6組,進(jìn)行整體稱重調(diào)整,使每組體重基本相等;分別設(shè)為復(fù)方常青高、中、低劑量組(A、B、C),地克珠利組(D),不給藥也不攻蟲的陰性對照組(E),攻蟲不給藥的陽性對照組(F),每組3個重復(fù),每個重復(fù)10只雛雞。

1.2.2 球蟲感染和給藥方法 除E組外,15日齡,各組經(jīng)口感染1×105個E.tenella孢子化卵囊。18日齡起,連續(xù)5 d給藥治療,A、B、C 3組以中藥原藥兌水給藥,給藥濃度分別為5、2.5、1 mL/L,D組以地克珠利溶液1 mL/L兌水給藥。

1.2.3 增重變化及料肉比 分別于15日齡(攻蟲前)、18日齡(攻蟲3 d,連續(xù)給藥前)、21日齡(攻蟲6 d,連續(xù)給藥3 d)、23日齡(攻蟲8 d,連續(xù)給藥5 d)、25日齡(攻蟲10 d,停藥2 d),對各組雛雞進(jìn)行稱重,記錄15～25日齡各組雛雞的平均采食量。計算各組雛雞平均增重、相對增重率及料肉比。

平均增重=停藥2天體重-攻蟲前的體重;

相對增重率=(各試驗組增重率/陰性對照組增重率)×100%;

料肉比=平均采食量/平均增重。

1.2.4 每克盲腸內(nèi)容物卵囊數(shù)及卵囊值 25日齡(攻蟲10 d,停藥2 d),斷頸處死各組雛雞,取出盲腸內(nèi)容物并研磨均勻,按照麥克馬斯特氏法計算各組每克盲腸內(nèi)容物的卵囊數(shù)(oocysts per gramme,OPG)[10],卵囊值(0～40)參照文獻(xiàn)[2]進(jìn)行換算。

1.2.5 盲腸病變記分及病變值 25日齡(攻蟲10 d,停藥2 d),斷頸處死各組雛雞,逐羽觀察盲腸病變,參照文獻(xiàn)[13]對各組進(jìn)行盲腸病變記分。盲腸病變分5個等級(表1);當(dāng)兩側(cè)盲腸病變不一致時,以嚴(yán)重的一側(cè)為準(zhǔn),因球蟲死亡的雛雞盲腸病變記4分。病變值=平均盲腸病變記分×10。

表1 盲腸病變記分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.6 抗球蟲指數(shù)判定標(biāo)準(zhǔn) 抗球蟲指數(shù)(ACI)由存活率、相對增重率、病變值和卵囊值構(gòu)成,當(dāng)評價藥物的療效時,ACI>180時為優(yōu)秀、160～180為良好、120～160為差、120以下為無效。

抗球蟲指數(shù)(ACI)=(存活率+相對增重率)-(病變值+卵囊值)。

1.2.7 血清中細(xì)胞因子測定 分別于15日齡(攻蟲前)、18日齡(攻蟲3 d,給藥前)、21日齡(攻蟲5 d,連續(xù)給藥3 d)、23日齡(攻蟲8 d,連續(xù)給藥5 d)、25日齡(攻蟲10 d,停藥2 d)翅下采血,室溫下斜置20 min,3 500 r/min離心10 min,收集血清保存于-80℃冰箱。并按照雞IL-17和雞IL-10 ELISA試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行檢測。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理與分析 結(jié)果數(shù)據(jù)先采用Excel進(jìn)行整理,再用 SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和多重比較,結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀

攻蟲前,雛雞采食飲水正常,精神狀況良好且生長速度較快。18日齡(攻蟲3 d,給藥前),雛雞食欲下降,精神沉郁,怕冷扎堆,并排出伴有腸道偽膜的血便。部分雛雞離群呆立,縮頸閉眼,肛周羽毛因附著干硬糞便,排便困難。F組部分雛雞因長期不食,導(dǎo)致營養(yǎng)不良、生長緩慢或死亡。剖檢死亡雞可見盲腸腫大,內(nèi)壁出血。治療組在給藥3 d后精神狀態(tài)、食欲有所恢復(fù),但生長速度減緩。整個試驗期間E組雛雞均無疾病表現(xiàn)。

2.2 對感染雛雞增重情況及料肉比的影響

18日齡(攻蟲3 d,給藥前),各組雛雞平均體重?zé)o顯著差異(P>0.05)。21日齡(攻蟲5 d,連續(xù)給藥3 d),平均體重F組顯著低于其他各組(P<0.05),治療組中A、B與D組體重?zé)o顯著差異(P>0.05)。23日齡(攻蟲8 d,連續(xù)給藥5 d),平均體重A、B、C組高于D組,且A組與E組差異不顯著(P>0.05)。25日齡(攻蟲10 d,停藥2 d),平均體重A組、D組、E組差異不顯著(P>0.05),且以A組獲得的平均體重最大。試驗結(jié)束后,各治療組的平均增重、相對增重率、料肉比均顯著優(yōu)于F組(P<0.05),且A組、D組與E組的平均增重、相對增重率及料肉比差異不顯著(P>0.05)(表2)。

表2 各試驗組不同日齡體重、增重情況及料肉比

2.3 感染雛雞盲腸病變記分及對OPG的影響

25日齡(攻蟲10 d,停藥2 d),治療組的盲腸病變記分和OPG值均顯著低于F組(P<0.05),且復(fù)方常青治療組(A、B、C)的盲腸病變記分和OPG值均隨著給藥濃度的增加而減少;D組與C組的盲腸病變記分差異不顯著(P>0.05),與A組的OPG值差異不顯著(P>0.05)(表3)。

表3 各試驗組盲腸病變記分及OPG值

2.4 復(fù)方常青抗E.tenella的效果研究

與F組相比,4個治療組均具有抗球蟲效果,B組與D組的治療效果相近,而A組的抗球蟲指數(shù)最高(ACI>180),并且結(jié)合存活率、相對增重率、病變值、卵囊值可見A組的抗球蟲療效最好(表4)。

表4 各試驗組抗球蟲指數(shù)

2.5 對感染雛雞血清中細(xì)胞因子含量的影響

2.5.1 復(fù)方常青對血清中IL-10含量的影響 18日齡(攻蟲3 d,給藥前),與E組相比,攻蟲組血清中IL-10含量出現(xiàn)下降,但差異不顯著(P>0.05)。21日齡(攻蟲6 d,連續(xù)給藥3 d),與E組相比,F組血清中IL-10含量顯著降低(P<0.05),而4個治療組含量與E組接近(P>0.05)。23日齡(攻蟲8 d,連續(xù)給藥5 d),A、B、C 3組血清中IL-10含量高于E組,但差異并不顯著(P>0.05)。25日齡(攻蟲10 d,停藥2 d),4個治療組中,B組血清中IL-10含量最高(圖1)。

同一日齡組間不同字母表示兩組差異顯著(P<0.05)

2.5.2 復(fù)方常青對血清中IL-17含量的影響 18日齡(攻蟲3 d,給藥前),與E組相比,各攻蟲組血清中IL-17含量顯著增高(P<0.05)。21日齡(攻蟲5 d,連續(xù)給藥3 d),與F組相比,各治療組血清中IL-17含量均出現(xiàn)不同程度的下降;且B組血清中IL-17含量與E組相近(P>0.05)。23日齡(攻蟲8 d,連續(xù)給藥5 d),各治療組血清中IL-17含量與E組相比差異不顯著(P>0.05)。25日齡(攻蟲10 d,停藥2 d),血清中IL-17的含量各治療組均顯著低于F組(P<0.05),且C組相對于E組含量顯著升高(P<0.05),而其他治療組含量與E組差異不顯著(P>0.05)(圖2)。

3 討論

中獸醫(yī)學(xué)認(rèn)為,雞球蟲病屬于蟲積范疇,為虛癥,由外感蟲邪引起的濕證所致[3],治療應(yīng)以清熱解毒、涼血止痢、抗菌消炎、利水消腫為主,輔以補(bǔ)虛補(bǔ)氣,健脾養(yǎng)胃、提升中氣,增強(qiáng)機(jī)體免疫力[10]。本文以常山為 “君藥”,具有清熱燥濕、殺蟲驅(qū)蟲、止痢等功效[7];常山因含有常山堿、異常山堿及其衍生物常山酮等成分,可以抑制雞球蟲子孢子、第1和第2代裂殖子的入侵,因此對抵抗多種球蟲感染有良好作用[14-15]。以青蒿、白茅根、地榆為臣藥,具有清熱生津、涼血止血止痢、利尿通淋的功效[16],君臣相輔起著主要的抗球蟲病作用;青蒿中含有青蒿素,具有抑制雞球蟲第2代裂殖子微線基因,促進(jìn)第2代裂殖子凋亡的功效,從而能夠減少卵囊產(chǎn)生,抑制球蟲感染引起的炎癥反應(yīng)[7]。用補(bǔ)足脾陽、涼血止血、清除肝火的藥物柴胡、仙鶴草、苦參、黃芪和厚樸作為“佐藥”,協(xié)助抗球蟲藥物發(fā)揮作用的同時,具有補(bǔ)中益氣、升舉陽氣、助消化、破瘡排膿、利水消腫、抗病原微生物、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功能;柴胡的主要成分是柴胡皂苷,具有抗腫瘤、抗過敏、抗凋亡和免疫調(diào)節(jié)作用[17]。此外,還能抑制促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-17等表達(dá),提高抗炎細(xì)胞因子IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子等的表達(dá)[18]。黃芪含有黃芪多糖,具有抗病毒、調(diào)節(jié)免疫力、抗氧化等生物學(xué)功能,還能促進(jìn)生長性能的提高[8]。以陳皮、炙甘草為使藥,陳皮具有理氣健脾、燥熱去濕的作用,炙甘草能補(bǔ)脾和胃、益氣復(fù)脈及調(diào)和諸藥[19-20]。因此,該方劑在抑制球蟲、提高機(jī)體免疫力的同時,還表現(xiàn)出促進(jìn)生長發(fā)育的作用。

雛雞攻蟲后,表現(xiàn)出食欲下降、精神萎靡、抱團(tuán)取暖、排血便等典型癥狀,死亡雛雞盲腸腫大、內(nèi)壁出現(xiàn)大量血斑,這與之前的研究結(jié)果一致[8]。四個治療組均能減輕E.tenella所引起的臨床癥狀,且以A組癥狀最輕微。與F組相比,各治療組的料肉比較低、相對增重率高,其中A組的料肉比最低、相對增重率最高,說明A組具有良好的促生長作用,這可能與黃芪、陳皮等中藥的促生長和促消化作用相關(guān)[8,19]。A、B組的存活率及抗球蟲指數(shù)(ACI)均高于D組,說明本研究中A、B兩組的療效較好,且以A組的抗球蟲療效(ACI>180)最佳。

血清中細(xì)胞因子會受腸道炎癥的影響[21],IL-10是由多種細(xì)胞釋放的抗炎及免疫抑制效用細(xì)胞因子,在原生動物和蠕蟲感染時控制著炎癥反應(yīng)的性質(zhì)和程度,并且能夠抑制TNF-α、IL-6、IL-17等的分泌,起到穩(wěn)定腸道黏膜環(huán)境的作用[22]。而IL-17是由CD4+T細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞所釋放的促炎細(xì)胞因子,不僅參與黏膜上皮免疫屏障對抗病原微生物,還使中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞在炎癥部位積累,引起組織病理學(xué)變化[23]。本研究中,與E組相比,18日齡,給藥前,攻蟲組血清中IL-10含量下降,IL-17顯著上升(P<0.05),說明攻蟲后,腸道環(huán)境遭到病原微生物入侵,黏膜上皮免疫屏障被破壞,機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)失去平衡,誘發(fā)了腸道炎癥,這與之前的研究相符。21日齡,連續(xù)給藥3 d,治療組血清中IL-10含量顯著高于F組(P<0.05),IL-17出現(xiàn)不同程度下降,說明此時在藥物的作用下機(jī)體炎癥得到緩解;其中B組血清中IL-10、IL-17含量均恢復(fù)到E組的水平(P>0.05),說明該藥物在此濃度下見效快,這可能與組方中青蒿、黃芪、柴胡等藥物增強(qiáng)免疫和緩解炎癥功能有關(guān)[10,17]。23日齡,連續(xù)給藥5天,四個治療組血清中IL-10與IL-17均恢復(fù)到正常水平,與E組無顯著差異(P>0.05),說明藥物刺激了機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng),促進(jìn)了抗炎因子的釋放,減少了促炎因子的釋放,維持機(jī)體免疫的穩(wěn)態(tài),且B組表現(xiàn)出的抗炎效果最佳。25日齡,停藥2 d,C組血清中IL-17含量相對于E組顯著上升(P<0.05);而A、B兩組仍表現(xiàn)為高水平的免疫穩(wěn)態(tài),且與E組無顯著差異(P>0.05),說明復(fù)方常青在低濃度下用藥時間應(yīng)該延長,以維持機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)。

本文綜合評價了復(fù)方常青的治療效果,該方劑可增加平均體重,降低料肉比,提高存活率,減輕盲腸病變,減少OPG,提高ACI,刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答,增強(qiáng)自身免疫力;復(fù)方常青高劑量組(A)的抗球蟲效果最佳,中劑量組(B)的抗炎效果最佳。為抗球蟲中藥的篩選、組方及應(yīng)用提供了參考,也為后期進(jìn)行中藥抗球蟲病機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。