梁 恒,錢 軍,劉志鵬,羅紅波

(遵義醫(yī)科大學(xué)第五附屬(珠海)醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,廣東 珠海 519100)

腦卒中是神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病之一。腦卒中分為缺血性卒中和出血性卒中,針對急性缺血性腦卒中,及時采用藥物或介入手段使腦血流量恢復(fù)是早期治療腦缺血最有效的臨床手段,但隨著血流的再通,會引起缺血區(qū)的腦組織細(xì)胞二次受損,稱為腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia-reperfusion injury, CI-RI)[1-2]。缺血再灌注損傷的機制眾多,如鈣離子超載、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、血腦屏障破壞、線粒體功能障礙等[3]。線粒體是活性氧自由基(ROS)產(chǎn)生的主要場所,當(dāng)線粒體功能障礙時,大量ROS產(chǎn)生會導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙或凋亡。缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1, HIF-1)作為一種核轉(zhuǎn)錄因子,廣泛表達于全身各組織,其中缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)與腦血管疾病密切相關(guān),HIF-1α的表達受到多因素的調(diào)控,如氧濃度、ROS等,是腦卒中后調(diào)節(jié)氧穩(wěn)態(tài)的重要介質(zhì)[4]。正常氧濃度條件下,HIF-1α表達受到抑制,半衰期短,在缺氧狀態(tài)下,HIF-1α的表達增強。ROS對HIF-1α的調(diào)控較為復(fù)雜且不穩(wěn)定,可能與腦缺血缺氧的程度、ROS的水平、內(nèi)源性抗氧化酶的活性等有關(guān)[5]。

在缺血缺氧情況下,一方面,HIF-1α通過激活下游的靶點基因,如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等,使之表達相關(guān)蛋白產(chǎn)物,增加組織對缺氧的耐受性,發(fā)揮抗缺氧作用[6-7]。VEGF可促進血管內(nèi)皮再生、抑制內(nèi)膜增厚,減輕腦缺血灌注損傷,外源性VEGF也可誘導(dǎo)腦組織血管生成,加快神經(jīng)功能恢復(fù)[8]。另一方面, HIF-1α 通過誘導(dǎo)促凋亡因子,如 Nix,BNip3和 IL-20導(dǎo)致線粒體功能障礙導(dǎo)致細(xì)胞死亡,故HIF-1α的作用是雙相模式,新型氮氧自由基4-羥基2-取代苯基硝基氮氧化物(4’-hydroxyl 2-substituted phenylnitronyl nitroxide, HPN)是一種新型的抗氧化劑和自由基清除劑(圖1),與普通的氮氧自由基相比,HPN更容易跨過血腦屏障,有效清除缺氧誘導(dǎo)的活性氧自由基(ROS),更好的發(fā)揮神經(jīng)保護作用[9-11]。在本實驗中,我們構(gòu)建腦缺血再灌注損傷的大鼠模型(MCAO/R),采用分子細(xì)胞生物學(xué)及病理學(xué)等方法,探究HPN對大鼠腦缺血再灌注損傷后缺氧相關(guān)蛋白HIF-1α、VEGF表達的影響。

圖1 HPN化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 本實驗主要試劑包括2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC,貨號：T8170);蘇木素(HE,貨號：H9627,Sigma公司);BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號：PC0020,Solarbio公司);PAGE凝膠快速制備試劑盒(貨號：PG112,中國雅酶公司);HIF-1α抗體(貨號：340462,成都正能生物公司);VEGF抗體(貨號：R26073,成都正能生物公司);β-actin(貨號：380624,成都正能生物公司);Trizol(qpcr,貨號：15596-026,Ambion公司)。

1.1.2 實驗動物 所有實驗動物均購買于珠海百試通生物科技有限公司,許可證號：SCXK(粵)2020-0051,健康成年的SPF級雄性SD大鼠,體重240～300 g。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 根據(jù)前期實驗研究[9],在高原缺氧小鼠模型中,神經(jīng)保護最佳的給藥濃度為100 mg/kg,故本實驗選取100 mg/kg為基礎(chǔ)給藥濃度。將60只SD大鼠采用隨機數(shù)表法分為假手術(shù)組、模型組、HPN低、中、高劑量組(100、150、200 mg/kg),每組12只,模型組于造模前20～30 min經(jīng)腹腔注射0.9%等滲生理鹽水,HPN低、中、高劑量組分別于造模前20～30 min經(jīng)腹腔注射HPN(低：100 mg/kg;中：150 mg/kg;高：200 mg/kg)。假手術(shù)組僅分離右側(cè)頸內(nèi)動脈,其余各組采用改良的 Longa 線栓法構(gòu)建右側(cè)大腦中動脈阻塞再灌注模型[12]。本研究獲得遵義醫(yī)科大學(xué)(珠海校區(qū))倫理委員會審批,審查編號為[2023]2023ZH0039。

1.2.2 Longa線栓法構(gòu)建MCAO/R模型 使用1%的戊巴比妥腹腔注射麻醉動物,在手術(shù)過程中,首先暴露右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈并進行分離,然后結(jié)扎頸總和頸外動脈,在頸總動脈結(jié)扎線遠心端開一小口,插入線栓阻塞動脈,并將線栓固定,最后縫合皮膚。在假手術(shù)組中,僅僅進行頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈的暴露與分離,然后縫合皮膚。將造模后的小鼠置于37 ℃加熱墊上保溫復(fù)蘇。線栓阻塞動脈2 h后,拔出線栓,讓缺血側(cè)腦組織血流灌注24 h。造模2 h后采用Zea-Longa法評分篩選2～3分大鼠入組,各組大鼠于斷頭取腦前進行mNSS評分進行神經(jīng)功能缺損評分,對于失敗模型,應(yīng)排除,并按照隨機原則補充大鼠,并重新制作MCAO/R模型,術(shù)后動物置于干凈通風(fēng)的鼠籠單籠飼養(yǎng),自由進食。Zea-Longa評分法為0分：無神經(jīng)損害癥狀;1分：左側(cè)前爪不能完全伸展;2分： 向左側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分：行走時向左側(cè)傾倒;4分：不能自發(fā)行走及意識障礙; 選取2～3分大鼠入組進行后續(xù)實驗[13]。

1.2.3 神經(jīng)功能評分(mNSS評分) 缺血再灌注24 h后嚴(yán)格按照評分標(biāo)準(zhǔn)[14],從運動、感覺、平衡和反射4個方面進行評分。評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 mNSS評分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.4 TTC染色測定腦梗死體積 缺血再灌注24 h后,迅速取腦,放入-20 ℃冷凍20～30 min后,沿腦冠狀面,人字縫處開始向前連續(xù)切5片,每片厚約2 mm,放入現(xiàn)配的1% TTC溶液中浸泡,37 ℃保溫箱中避光孵育20 min后將腦組織翻面再次避光孵育20 min,用固定液(4%多聚甲醛)固定過夜后置于藍色背景下拍照。采用Image-J軟件對梗死體積進行分析。梗死體積百分比[15]=(對側(cè)半球體積-梗死側(cè)正常體積)/對側(cè)半球體積×100%。

1.2.5 HE染色 缺血再灌注24 h后,迅速斷頭取腦,將其放置于多聚甲醛溶液(濃度4%)中浸泡固定48 h,然后脫水、石蠟包埋、切成厚度約為5 μm薄片,經(jīng)過HE染色,再用樹脂進行封片。接著利用顯微鏡觀察腦組織病理學(xué)變化,最后進行拍照后分析。

1.2.6 實時定量PCR檢測HIF-1α、VEGF基因表達 使用Trizol試劑提取總RNA,使用超微量紫外可見分光光度計測得OD260/OD280比值,比值為1.8～2.0時滿足實驗要求,采用兩步法將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,使用SYBR Green進行實時PCR,本實驗所用引物見表2。

表2 qPCR基因的引物序列

1.2.7 Western blot檢測HIF-1α、VEGF蛋白表達 稱取適量腦組織在RIPA緩沖液(含有PMSF和磷酸酶抑制劑)中置于冰上研磨直至無明顯塊狀組織,離心后(12 000 r/min, 20 min)取上清液,通過BCA蛋白檢測試劑盒測定總蛋白濃度。用10% SDS-PAGE凝膠分離不同分子量的蛋白質(zhì),再轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上,用含無蛋白快速封閉液浸泡PVDF膜,在搖床上封閉15～30 min,加入一抗在4 ℃孵育過夜(HIF-1α,1∶1 000;VEGF,1∶200;β-actin,1∶20 000)。第2天用TBST洗去一抗后浸泡在二抗孵育液中(1∶10 000),避光孵育2 h,再將二抗洗去后用ECL顯色劑增強化學(xué)發(fā)光進行觀察。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量HPN對神經(jīng)功能缺損的影響 根據(jù)mNSS評分標(biāo)準(zhǔn)對缺血再灌注24 h進行神經(jīng)功能缺損評分,分?jǐn)?shù)越高,神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。實驗結(jié)果如圖2所示,假手術(shù)組無明顯神經(jīng)功能缺損,與假手術(shù)相比,模型組有明顯神經(jīng)功能缺損癥狀(P<0.01),與模型組相比,HPN給藥組神經(jīng)功能缺損均有改善(P<0.05),隨HPN給藥劑量的增加,神經(jīng)功能缺損癥狀改善越明顯,與HPN低劑量給藥組相比,HPN中、高劑量給藥組有明顯改善(P<0.05),其中HPN高劑量組療效最明顯。

A：與假手術(shù)組比較,P<0.01;b、c：與模型組比較,P<0.05、P<0.01;d、e：與HPN低劑量組比較,

2.2 不同劑量HPN對腦梗死面積的影響 采用TTC染色測定腦梗死面積,如圖3所示,與假手術(shù)組相比,模型組檢測大面積的白色腦梗死區(qū)域(P<0.01)。與模型組相比,HPN給藥組腦梗死面積均有明顯改善(P<0.01)。與HPN低劑量給藥組相比,HPN中、高劑量給藥組有明顯改善(P<0.01),隨HPN給藥劑量的增加,腦梗死面積改善越明顯,以HPN高劑量組改善效果最明顯。

A：TTC染色;B：腦梗死面積統(tǒng)計分析;a：與假手術(shù)組比較,P<0.01;b：與模型組比較,P<0.01;c：與HPN低劑量組比較,

2.3 不同劑量 HPN對梗死側(cè)皮層組織形態(tài)的影響 如圖4所示,在假手術(shù)組中,皮層細(xì)胞數(shù)量豐富,排列有序,細(xì)胞輪廓清晰,沒有核固縮或壞死現(xiàn)象。相比之下,MCAO/R模型組中細(xì)胞核固縮形成明顯的空洞狀,具有明顯壞死現(xiàn)象,細(xì)胞數(shù)量減少,并且排列紊亂。與MCAO/R模型組相比,各劑量組中的細(xì)胞狀態(tài)得到改善,細(xì)胞死亡減少,其中以HPN高劑量給藥組中表現(xiàn)出最明顯的改善效果。

A：假手術(shù)組;B：模型組;C：HPN低劑量組;D：HPN中劑量組;E：HPN高劑量組;標(biāo)尺為50 μm,放大倍數(shù)×200。

2.4 不同劑量HPN對缺氧相關(guān)蛋白HIF-1α、VEGF基因表達的影響 結(jié)果如圖5所示,與假手術(shù)組相比,MCAO/R模型組中HIF-1α和VEGF基因表達明顯增加(P<0.01)。與MCAO/R模型組相比,HPN各給藥組中HIF-1α和VEGF基因表達明顯降低(P<0.05,P<0.01)。與HPN低劑量給藥組相比,HPN中、高劑量給藥組HIF-1α和VEGF基因表達降低(P<0.01),以HPN高劑量組降低最顯著。

A：HIF-1α基因表達情況;B：VEGF基因表達情況;a：與假手術(shù)組比較,P<0.01;b：與模型組比較,P<0.05;c：與模型組比較,P<0.01;d：與HPN低劑量組比較,

2.5 不同劑量HPN對缺氧相關(guān)蛋白HIF-1α、VEGF蛋白表達的影響 結(jié)果如圖6所示,假手術(shù)組與MCAO/R模型組相比,HIF-1α和VEGF表達在模型組中明顯增加(P<0.01)。MCAO/R模型組與HPN給藥組相比,HIF-1α和VEGF表達在HPN給藥組中明顯下降(P<0.05,P<0.01)。與HPN低劑量給藥組相比,HIF-1α和VEGF表達在HPN中、高劑量給藥組中有明顯下降(P<0.05,P<0.01),以HPN高劑量組降低最顯著。

A、B：Western blot檢測蛋白表達;C、D：蛋白相對表達量;a：與假手術(shù)組比較,P<0.01;b：與模型組比較,P<0.05;c：與模型組比較,P<0.01;d：與HPN低劑量組比較,P<0.05;e：與HPN低劑量組比較,

3 討論

急性缺血性腦卒中是一種嚴(yán)重的神經(jīng)科疾病,具有高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率的特點,是中老年人致死、致殘的主要病因,及時使腦血流量恢復(fù),拯救缺血半暗帶是治療急性缺血性腦卒中的首要原則,但隨著血流的再通,會引起腦缺血再灌注損傷(CI-RI)[1-2]。目前尚無明確治療CI-RI的藥物。HPN是課題組前期合成的一種新型的抗氧化劑和自由基清除劑,能有效清除缺氧誘導(dǎo)的活性氧自由基(ROS),從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用[9-11],但HPN在腦缺血再灌注損傷中的機制及作用靶點尚未完全清楚。

缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)是一種核轉(zhuǎn)錄因子,在神經(jīng)疾病中扮演十分重要的角色,大量研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α與缺血再灌注損傷密切相關(guān)[16-17]。在缺血再灌注損傷后,機體自身也啟動一系列抗損傷機制,該過程與HIF-1α的表達上調(diào)密切相關(guān),HIF-1α通過增加下游基因表達相應(yīng)蛋白,如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF),促紅細(xì)胞生成素(EPO)等,參與血管生成、紅細(xì)胞生成增加,糖酵解、葡萄糖轉(zhuǎn)運等生物過程促進細(xì)胞存活。研究發(fā)現(xiàn),通過低氧預(yù)處理或提前使HIF-1α積累,對腦缺血缺氧均表現(xiàn)出明顯的保護作用[18-19]。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一種可以促進血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子,可促進血管通透性增加、血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和新生血管形成等作用[20]。腦缺血缺氧后的VEGF的表達調(diào)控是多因素的,其中以缺血缺氧為主要的調(diào)節(jié)因素,缺血缺氧后,HIF-1α通過結(jié)合到VEGF基因的啟動子區(qū)域上相關(guān)靶點結(jié)合,促進VEGF基因的轉(zhuǎn)錄和表達,從而促進血管生成和組織修復(fù)[21]。在本實驗中,HIF-1α和VEGF的基因及蛋白表達在MCAO/R模型鼠腦中表達增加,如前所述,模型組中HIF-1α和VEGF的表達增加是機體自身的防御反應(yīng),增加機體對缺血缺氧的耐受,減輕腦缺血再灌注損傷。

本實驗針對新型氮氧自由基HPN對缺血再灌注損傷后HIF-1α和VEGF表達的影響進行研究,結(jié)果表明,給予HPN處理后,腦皮層組織中HIF-1α和VEGF的表達減少,且隨著HPN劑量的增加,HIF-1α和VEGF表達逐漸減少。此外,HPN處理后的模型大鼠腦梗死面積范圍減少,腦皮層細(xì)胞死亡減少、組織間質(zhì)水腫得到改善,減輕了腦缺血再灌注后的組織損傷。目前的一些研究發(fā)現(xiàn),HIF-1α也參與細(xì)胞凋亡的發(fā)生,Helton等[22]發(fā)現(xiàn)HIF-1α在缺氧缺氧中的主要作用是促進細(xì)胞凋亡。Miao等[23]發(fā)現(xiàn),缺氧誘導(dǎo)因子的抑制劑可抑制炎癥反應(yīng)保護缺血再灌注誘導(dǎo)的組織損傷。HIF-1α的表達受到多因素的調(diào)控,除了氧濃度為主要調(diào)節(jié)因素外,活性氧自由基(ROS)也參與HIF-1α的穩(wěn)定性調(diào)節(jié),但ROS對HIF-1α的調(diào)節(jié)是促進還是抑制均有報道,Guzy等[24]發(fā)現(xiàn),ROS通過抑制HIF-1α的降解,在缺血缺氧條件下促進HIF-1α和下游靶基因的表達,但Guo等[25]發(fā)現(xiàn),ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸可誘導(dǎo)HIF-1α的表達。He等[26]發(fā)現(xiàn),HIF-1α的作用是相互的,在早期表達促進細(xì)胞凋亡,晚期表達促進細(xì)胞存活。VEGF使得血管通透性增加的同時,會引起血腦屏障破壞,與腦水腫形成密切相關(guān)[27]。因此結(jié)合相關(guān)研究及實驗結(jié)果,HPN調(diào)控腦皮層組織中HIF-1α和VEGF的表達減少,可能與氧化應(yīng)激減輕、炎癥反應(yīng)的抑制、細(xì)胞凋亡的減少等途徑有關(guān)。

綜上所述,本研究探討了新型氮氧自由基HPN對腦缺血再灌注損傷后HIF-1α和VEGF表達的影響,初步證實了HPN降低了腦缺血再灌注損傷后HIF-1α和VEGF的表達,并改善了大鼠腦缺血再灌注損傷。