仇雪梅,趙明蕊,解曉麗,趙淑芹

(棗莊市婦幼保健院生殖遺傳中心,棗莊 277100)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)為一高度復(fù)雜的內(nèi)分泌和生殖功能障礙性疾病,其發(fā)病率為育齡婦女的5%～10%,是導(dǎo)致無排卵性不育的主要原因。目前PCOS的確切發(fā)病機(jī)制尚不明確,過多的雄激素可能是引發(fā)此病的核心要素之一[1-3]。研究表明,卵巢顆粒細(xì)胞凋亡增加與PCOS患者卵泡發(fā)育異常密切相關(guān)[4-6]。Ding等[7]研究顯示,PCOS患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因程序性細(xì)胞死亡因子4(programmed cell death 4,PDCD4)表達(dá)顯著增加,PDCD4高表達(dá)與顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān),并可作為PCOS發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Lu等[8]認(rèn)為,PDCD4是治療代謝性疾病的新靶點(diǎn)。本課題組前期研究顯示,高濃度睪酮誘導(dǎo)PDCD4表達(dá)上調(diào)和卵巢顆粒細(xì)胞凋亡[9]。提示PDCD4在顆粒細(xì)胞凋亡及PCOS發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)中的重要性。本研究在外周血細(xì)胞和體外研究基礎(chǔ)上,探討控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation,COH)中PCOS患者卵巢顆粒細(xì)胞中PDCD4表達(dá)及其與胚胎質(zhì)量的相關(guān)性,分析血清睪酮(Testosterone,T)水平與胚胎質(zhì)量的相關(guān)性,以期進(jìn)一步探討PDCD4及睪酮的臨床意義,從而為提高PCOS患者的臨床結(jié)局提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2020年10月至2021年11月在棗莊市婦幼保健院生殖中心行體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)助孕的超促排卵周期PCOS患者(28例)和非PCOS患者(40例)。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。依據(jù)2003年鹿特丹標(biāo)準(zhǔn),PCOS的診斷標(biāo)準(zhǔn)為滿足以下3個(gè)條件中的2個(gè):(1)排卵少或不排卵;(2)有高雄激素血癥的臨床和生化特征;(3)超聲檢查見多囊性卵巢。同時(shí)排除其他可能導(dǎo)致高雄激素的疾病,如先天性腎上腺皮質(zhì)增生、分泌雄性激素的腫瘤、Cushing綜合征等。非PCOS患者(對(duì)照組)納入標(biāo)準(zhǔn):月經(jīng)規(guī)律,基礎(chǔ)體溫測(cè)試結(jié)果表明有正常排卵,超聲檢查證實(shí)卵巢形態(tài)正常,輸卵管和(或)男方因素導(dǎo)致的不孕。排除標(biāo)準(zhǔn):合并卵巢功能早衰、內(nèi)異癥、高泌乳素血癥、甲狀腺功能異常等;曾行卵巢手術(shù)或放化療;近3個(gè)月內(nèi)接受過促排卵治療或服用性激素者。

1.2 方法

1.2.1 COH方案 綜合評(píng)估患者情況,選擇適合的常規(guī)促排卵方案,包括患者年齡、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)、竇卵泡數(shù)、基礎(chǔ)性激素水平及血清抗苗勒管激素(anti-Mullerian hormone,AMH)水平。促性腺激素(gonadotropin,Gn)(果納芬,75IU/支,默克雪蘭諾公司)起始劑量150～225IU/d,并同時(shí)監(jiān)測(cè)血清黃體生成素(luteinizing hormone,LH)、雌二醇(Estradiol,E2)和孕酮水平,以調(diào)整Gn劑量。B超監(jiān)測(cè)到至少1個(gè)卵泡直徑≥18mm時(shí),當(dāng)天肌肉注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)(珠海麗珠公司)5000～10000IU,36h后在陰道超聲引導(dǎo)下穿刺取卵。

1.2.2 優(yōu)質(zhì)胚胎判定 取卵后進(jìn)行常規(guī)授精,根據(jù)Veeck胚胎分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)胚胎進(jìn)行分級(jí),第2天細(xì)胞數(shù)為2～4細(xì)胞,第3天細(xì)胞數(shù)為6～8細(xì)胞,Ⅱ級(jí)以上(卵裂球大小均等或基本均等,碎片<20%)的胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎。

1.2.3 顆粒細(xì)胞收集與處理 穿刺卵泡抽取的卵泡液立即于顯微鏡下觀察,拾取卵母細(xì)胞-卵冠丘復(fù)合物后,將剩余的卵泡液收集于離心管,1500r/min離心10min。棄上清,用PBS清洗1次,用2mL PBS懸起細(xì)胞沉淀,用吸管將其加入具有等體積的淋巴細(xì)胞分離液中,2500r/min離心20min。小心吸取懸浮子兩層淋巴細(xì)胞液間的顆粒細(xì)胞層,收集于新的離心管內(nèi),加5mL PBS溶液清洗,1500r/min離心5min。PBS清洗3次,-80℃冰箱凍存?zhèn)溆?用于相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.4 逆轉(zhuǎn)錄與實(shí)時(shí)定量PCR 顆粒細(xì)胞總RNA使用Trizol(Invitrogen Corporation,美國(guó))進(jìn)行提取。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT-PCR Kit,TakaRa,中國(guó))說明書進(jìn)行cDNA合成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time Quantitative PCR,qPCR)法應(yīng)用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(TakaRa,中國(guó))對(duì)PDCD4 mRNA表達(dá)進(jìn)行定量分析。3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內(nèi)參,各組mRNA相對(duì)表達(dá)量應(yīng)用2-△△Ct方法計(jì)算?；驍U(kuò)增引物序列:PDCD4正向引物5'-TGGATGAAAGGGCATTTGAGA-3',反向引物5'-AGCCTTCCCCTCCAATGCTA-3',目標(biāo)擴(kuò)增片段大小為164bp;GAPDH正向引物5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3,反向引物5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3',目標(biāo)擴(kuò)增片段大小為138bp。所有引物均由南京金思特公司合成。

2 結(jié) 果

2.1 患者一般情況及實(shí)驗(yàn)室結(jié)局 PCOS組和對(duì)照組的年齡、不孕年限、BMI、基礎(chǔ)促卵泡激素(follicle stimulating hormone,FSH)、雌二醇(Estradiol,E2)、泌乳素(Prolactin,PRL)和睪酮比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。PCOS患者的AMH和基礎(chǔ)LH水平均高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。兩組的Gn用量、Gn時(shí)間和HCG注射日子宮內(nèi)膜厚度比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。PCOS組的HCG注射日E2值高于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組的正常受精率、卵裂率、優(yōu)胚率、可用胚率和卵母細(xì)胞利用率比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表1 PCOS組和對(duì)照組基本臨床資料比較

表2 PCOS組和對(duì)照組IVF-ET治療結(jié)局比較

2.2 PCOS患者卵巢顆粒細(xì)胞PDCD4表達(dá) 實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示,PCOS組的PDCD4表達(dá)略高于對(duì)照組,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.804)。見圖1。對(duì)照組與PCOS組的平均獲卵數(shù)分別為(15.3±3.3)和(19.6±2.1)。對(duì)照組以組內(nèi)獲卵數(shù)均值(15.3)為分界,分為獲卵數(shù)≤15組和獲卵數(shù)>15組。PCOS組獲卵數(shù)組內(nèi)差異較小,未進(jìn)行亞組分析。結(jié)果顯示,獲卵數(shù)較多的對(duì)照組(獲卵數(shù)>15組)及PCOS組的PDCD4相對(duì)表達(dá)量高于獲卵數(shù)少的對(duì)照組(獲卵數(shù)≤15組),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

圖1 qPCR檢測(cè)PCOS組和對(duì)照組PDCD4 mRNA表達(dá)水平

圖2 qPCR檢測(cè)不同獲卵數(shù)各組PDCD4 mRNA表達(dá)

2.3 PDCD4表達(dá)與胚胎質(zhì)量相關(guān)性分析 根據(jù)患者可用胚率分為低可用胚組(可用胚率低于30%)和正?？捎门呓M。結(jié)果顯示,低可用胚組的PDCD4表達(dá)高于正常可用胚組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.044)。見圖3。

圖3 qPCR檢測(cè)PDCD4 mRNA表達(dá)

2.4 睪酮水平與胚胎質(zhì)量相關(guān)性分析 PCOS患者根據(jù)血清睪酮水平分為T<0.7ng/mL組(22例)和T≥0.7ng/mL組(6例)。結(jié)果顯示,高睪酮水平組的正常受精率和卵母細(xì)胞利用率低于低睪酮水平組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

3 討 論

PCOS是一種病因復(fù)雜的疾病,一般認(rèn)為其病因與下丘腦-垂體-卵巢軸調(diào)節(jié)紊亂有關(guān)。下丘腦以脈沖的方式分泌促性腺激素釋放激素,脈沖的幅度增大導(dǎo)致患者血液中黃體生成素異常增高,從而促進(jìn)雄激素的合成和分泌[10]。而FSH分泌被抑制,導(dǎo)致雄激素?zé)o法充分轉(zhuǎn)化為雌激素,雄激素的進(jìn)一步升高阻礙卵泡發(fā)育、封閉卵泡,堆積的發(fā)育不全的小卵泡導(dǎo)致卵巢形成多囊樣改變,無法正常排卵。AMH是一種由卵泡顆粒細(xì)胞分泌的激素,其在調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育過程中起著重要作用,與卵巢儲(chǔ)備功能密切相關(guān)。PCOS患者中AMH表達(dá)明顯升高,可用于PCOS的診斷及療效評(píng)估[11-12]。本研究中PCOS組與對(duì)照組的年齡、不孕年限、BMI、基礎(chǔ)FSH、E2、PRL和睪酮比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,PCOS患者的AMH和基礎(chǔ)LH均高于對(duì)照組,這與以往關(guān)于PCOS的研究相符。

Eini等[13]研究表明,高雄激素血癥可能通過影響芳烴受體途徑損害卵母細(xì)胞的發(fā)育能力。PCOS患者通過輔助生殖技術(shù)可產(chǎn)生形態(tài)正常的MⅡ卵母細(xì)胞,但卵母細(xì)胞發(fā)育能力和胚胎發(fā)育潛力受到損害[14]。輔助生殖技術(shù)中PCOS患者能否獲得與健康人相當(dāng)?shù)娜焉锝Y(jié)局,目前研究結(jié)果并不一致,有不少研究報(bào)道了COH中PCOS與非PCOS患者臨床結(jié)局的差異。吳曉燕等[15]研究表明,PCOS組的胚胎種植率、臨床妊娠率低于對(duì)照組;趙考考等[16]研究顯示,PCOS患者的獲卵數(shù)、正常受精數(shù)高于對(duì)照組,組間優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、著床率、臨床妊振率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;黃劍磊等[17]研究表明,PCOS組的卵母細(xì)胞成熟率、正常受精率、可用胚胎數(shù)、可用胚胎率、囊胚形成率均低于對(duì)照組。本研究結(jié)果顯示,PCOS組與對(duì)照組的正常受精率、卵裂率、優(yōu)胚率、可用胚率和卵母細(xì)胞利用率均未見明顯差異;根據(jù)睪酮水平進(jìn)行亞組分析發(fā)現(xiàn),高睪酮水平組的正常受精率和卵母細(xì)胞利用率低于低睪酮水平組,表明睪酮水平對(duì)卵子及胚胎質(zhì)量影響的重要性。以往研究結(jié)果不一致可能與睪酮水平不同有關(guān)。

顆粒細(xì)胞環(huán)繞于卵母細(xì)胞周圍,向卵母細(xì)胞供應(yīng)必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子,對(duì)于卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要,與PCOS卵泡發(fā)育異常及該疾病的多種表征有著緊密聯(lián)系。雖然結(jié)論尚未得到證實(shí),但多項(xiàng)研究顯示,PCOS患者卵泡發(fā)育障礙可能與卵巢顆粒細(xì)胞凋亡增加有關(guān)。PDCD4基因是在細(xì)胞凋亡中因一種表達(dá)特異的蛋白質(zhì)而鑒別出來的凋亡促進(jìn)基因。PDCD4在其確切的細(xì)胞作用方面存在一些差異,但其通常被表征為一種抑制細(xì)胞周期進(jìn)展和增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡的蛋白質(zhì)。最近研究表明,PDCD4是PCOS發(fā)病機(jī)制的新參與者[18],其作為miR-16[19]、miR-155[20]及miR-323-3p[21]的靶基因可抑制卵巢顆粒細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。推測(cè)PDCD4可能通過影響卵巢顆粒細(xì)胞的增殖及凋亡在PCOS的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用。但是,卵巢顆粒細(xì)胞中PDCD4的表達(dá)情況尚不清楚。通過對(duì)PCOS患者和健康人的外周血單核細(xì)胞進(jìn)行研究,Ding等[7]發(fā)現(xiàn)PCOS患者中凋亡相關(guān)基因PDCD4表達(dá)顯著上升。廉紅梅等[22]研究顯示,PCOS患者血清PDCD4表達(dá)高于對(duì)照組。本課題組前期研究結(jié)果表明,高濃度睪酮導(dǎo)致PDCD4表達(dá)增加[23]。本研究結(jié)果顯示,PCOS組與對(duì)照組的PDCD4表達(dá)無明顯差異,可能與兩組睪酮水平相當(dāng)及樣本量太小有關(guān)。PCOS患者顆粒細(xì)胞中PDCD4表達(dá)情況尚需進(jìn)一步增加樣本量進(jìn)行研究證實(shí)。本研究結(jié)果顯示,低可用胚組的PDCD4表達(dá)高于正?？捎门呓M,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明顆粒細(xì)胞PDCD4表達(dá)對(duì)胚胎質(zhì)量有一定的影響。

綜上所述,COH中卵巢顆粒細(xì)胞PDCD4高表達(dá)與低可用胚率相關(guān),睪酮水平與受精率和卵母細(xì)胞利用率密切相關(guān),睪酮水平升高,受精率和卵母細(xì)胞利用率降低。這一結(jié)論對(duì)于如何改善PCOS患者助孕結(jié)局提供了線索。