孫惠霖,劉建兵,許孟軍,張慶娥,應(yīng)菲菲,安 寧,李 敏**

[揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鹽城婦幼保健院(鹽城市婦幼保健院)a.醫(yī)學(xué)遺傳中心;b.產(chǎn)前診斷中心,鹽城 224007]

常染色體三體的胚胎和胎兒流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)較高,其中15三體占所有三體自然流產(chǎn)的7.6%,是自然流產(chǎn)中最常見的細(xì)胞遺傳學(xué)異常之一[1]。完全型15三體無生存能力,出生后會(huì)因嚴(yán)重畸形而過早死亡,關(guān)于15三體表型的報(bào)道多見于15三體嵌合體。減數(shù)分裂不分離導(dǎo)致的三體自救和胚胎有絲分裂不分離是15三體嵌合體形成的可能原因[2]。由于遺傳背景和臨床表現(xiàn)的廣泛異質(zhì)性,15三體嵌合體的臨床表型尚未有明確的描述。對(duì)已報(bào)道的15三體及嵌合體活產(chǎn)兒進(jìn)行總結(jié),其大多存在嚴(yán)重的宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩、多器官畸形、先天性心臟缺陷、顱面畸形和非免疫性水腫等情況[3-4]。胎兒染色體嵌合體的診斷及處理一直是產(chǎn)前遺傳咨詢的難點(diǎn),及時(shí)進(jìn)行產(chǎn)前診斷可減少此類嚴(yán)重出生缺陷的發(fā)生,減輕家庭和社會(huì)的經(jīng)濟(jì)壓力及精神負(fù)擔(dān)。無創(chuàng)胎兒DNA篩查(non-invasive prenatal testing,NIPT)通過檢測(cè)孕婦血液中胎兒游離的DNA評(píng)估胎兒非整倍體的風(fēng)險(xiǎn),但仍存在檢測(cè)結(jié)果與真實(shí)核型不一致的情況。本研究應(yīng)用染色體核型分析、染色體微陣列分析(chromosomal microarray analysis,CMA)對(duì)1例NIPT升級(jí)版提示15號(hào)染色體異常的孕婦進(jìn)行產(chǎn)前診斷,并采用熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization,FISH)對(duì)流產(chǎn)物進(jìn)行鑒定,為15三體嵌合體的產(chǎn)前診斷和遺傳咨詢提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 基本資料 孕婦,34歲,G4P1,平素月經(jīng)規(guī)律,否認(rèn)近親結(jié)婚,否認(rèn)家族遺傳病史,否認(rèn)不良接觸史,本次妊娠無不適。孕16+4周于本中心行產(chǎn)前篩查,經(jīng)知情同意,自愿選擇NIPT升級(jí)版進(jìn)行產(chǎn)前篩查。后因NIPT升級(jí)版報(bào)告提示15號(hào)染色體異常進(jìn)行產(chǎn)前診斷及遺傳咨詢,告知羊膜腔穿刺術(shù)風(fēng)險(xiǎn)及染色體核型分析與CMA的局限性,簽署知情同意書后,孕20周在超聲引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺術(shù)。胎兒羊水染色體核型及CMA檢測(cè)結(jié)果均為15三體嵌合體,建議二次羊膜腔穿刺產(chǎn)前診斷行FISH檢測(cè)進(jìn)一步明確嵌合比例。經(jīng)遺傳咨詢,充分告知且知情同意下,孕婦及其家屬拒絕二次產(chǎn)前診斷,決定孕23周結(jié)束妊娠,拒絕引產(chǎn)胎兒病理檢查,接受取少許羊水及胎盤FISH檢測(cè)驗(yàn)證。本研究經(jīng)本院倫理會(huì)審查批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 經(jīng)充分知情同意,孕婦行超聲下經(jīng)腹羊膜腔穿刺術(shù),抽取羊水。為避免母體細(xì)胞污染棄最初的1～2mL,留30～40mL羊水。其中20mL細(xì)胞培養(yǎng)行染色體核型分析,10mL行染色體微陣列分析。取流產(chǎn)羊水10mL及胎盤組織行FISH檢測(cè)驗(yàn)證。

1.2.2 染色體核型分析 將20mL羊水注入2支無菌離心管,每支10mL,離心后在無菌操作條件下接種于2個(gè)培養(yǎng)瓶,在2個(gè)培養(yǎng)箱中靜置進(jìn)行雙線培養(yǎng)。設(shè)置培養(yǎng)條件溫度為37℃,CO2濃度為5%～6%。經(jīng)培養(yǎng)、換液、收獲、制片及G顯帶進(jìn)行核型分析,計(jì)數(shù)20個(gè)分裂相,分析5個(gè)核型,因嵌合型加大計(jì)數(shù)至60個(gè)。

1.2.3 染色體微陣列分析 對(duì)未培養(yǎng)的10mL羊水進(jìn)行基因組DNA提取。使用核酸提取磁珠試劑盒(廈門致善),使用高密度SNP芯片Affymetrix CytoScan 750K,對(duì)胎兒進(jìn)行全基因組染色體拷貝數(shù)檢測(cè),應(yīng)用ChAS(Thermo Fisher,Affymetrix,美國(guó))軟件針對(duì)芯片掃描結(jié)果。實(shí)驗(yàn)包括質(zhì)控、酶切、PCR、純化、標(biāo)記、雜交及掃描等步驟,操作過程嚴(yán)格按試劑和儀器操作說明書進(jìn)行。通過DGV(人群多態(tài)性數(shù)據(jù)庫)、ClinGen(人類基因組變異數(shù)據(jù)庫)、ClinVar(人類基因組變異數(shù)據(jù)庫)、Decipher(疾病數(shù)據(jù)庫)及本地?cái)?shù)據(jù)庫對(duì)拷貝數(shù)變異進(jìn)行評(píng)估。

1.2.4 FISH檢測(cè) 采用CEP15探針對(duì)經(jīng)處理、變性、雜交、洗滌等操作的羊水及胎盤組織進(jìn)行熒光原位雜交,在熒光顯微鏡下觀察熒光信號(hào),計(jì)數(shù)100個(gè),分析100個(gè)。

2 結(jié) 果

羊水染色體核型分析結(jié)果47,XN,+15[4]/46,XN[56]即胎兒為15三體嵌合體,嵌合比例約為6.67%,見圖1。羊水CMA檢測(cè)結(jié)果提示未見有臨床意義的雜合性缺失,arr(15)×2～3,15號(hào)染色體嵌合型重復(fù)(拷貝數(shù)=2～3),即胎兒為15三體嵌合體,嵌合比例約為70%,見圖2。孕23周羊水FISH檢測(cè)驗(yàn)證結(jié)果為nuc ish(D15Z1)x3[48]/(D15Z1)x2[52],即為15三體嵌合體,嵌合比例約為48%,見圖3;流產(chǎn)胎盤檢測(cè)結(jié)果為nuc ish(D15Z1)x3[39]/(D15Z1)x2[61],即為15三體嵌合體,嵌合比例約為39%,見圖4。

圖1 羊水細(xì)胞染色體核型A:47,XN,+15;B:46,XN

圖2 羊水CMA檢測(cè)分析

圖3 流產(chǎn)羊水FISH檢測(cè)A:nuc ish(D15Z1)x3;B:nuc ish(D15Z1)x2

圖4 流產(chǎn)胎盤FISH檢測(cè)A:nuc ish(D15Z1)x3;B:nuc ish(D15Z1)x2

3 討 論

目前NIPT已成為我院孕婦產(chǎn)前篩查的常規(guī)項(xiàng)目,全基因組測(cè)序技術(shù)除可檢測(cè)目的染色體的非整倍體(21三體、18三體以及13三體)之外還能發(fā)現(xiàn)其他染色體數(shù)目異常或部分染色體缺失重復(fù),但陽性預(yù)測(cè)值較低。孕婦血漿中游離的胎兒DNA主要來源于滋養(yǎng)層或胎盤細(xì)胞的凋亡,局限性胎盤嵌合(confined placental mosaicism,CPM)、母體染色體嵌合體、母體腫瘤、母體拷貝數(shù)變異和消失的雙胎等因素均會(huì)造成NIPT結(jié)果的假陽性[5]。胎盤存在兩種或多種細(xì)胞系嵌合而胎兒染色體核型正常即為CPM,這會(huì)導(dǎo)致胎兒染色體雖為正常的二倍體而NIPT結(jié)果呈陽性,是NIPT假陽性的主要生物學(xué)原因[6-7]。羊水細(xì)胞包含了來自胚胎三個(gè)胚層從未分化的祖細(xì)胞到成熟分化的細(xì)胞,包括泌尿生殖道、呼吸道和上皮系統(tǒng),含有腎、心、肺、肝和造血細(xì)胞系的細(xì)胞,能更真實(shí)地反應(yīng)胎兒血漿狀況[8-9]。為排除假陽性,且考慮胎兒15三體嵌合體的可能,我院對(duì)該NIPT陽性結(jié)果孕婦進(jìn)一步產(chǎn)前診斷,行侵入性羊水穿刺術(shù)進(jìn)行染色體核型分析和CMA檢測(cè)。

染色體核型分析一直被視為產(chǎn)前診斷中判斷胎兒染色體異常與否的“金標(biāo)準(zhǔn)”,但該方法仍存在培養(yǎng)周期長(zhǎng)、分辨率較低等不足[10]。此外,細(xì)胞培養(yǎng)傾向于促進(jìn)嵌合體中整倍體細(xì)胞的生長(zhǎng),這導(dǎo)致染色體核型分析對(duì)低比率的嵌合漏檢,核型分析對(duì)嵌合比例的檢測(cè)下限約為5%[11]。對(duì)未經(jīng)培養(yǎng)的胎兒絨毛膜或羊水細(xì)胞進(jìn)行CMA檢測(cè)周轉(zhuǎn)時(shí)間更短、分辨率更高且能避免細(xì)胞培養(yǎng)帶來的影響,但仍存在無法檢測(cè)平衡易位,倒位及低比例嵌合等缺點(diǎn)。本研究中使用的750K SNP微陣列對(duì)嵌合體的檢測(cè)下限達(dá)10%[12]。產(chǎn)前染色體嵌合體診斷的原則要求至少兩種檢測(cè)技術(shù)均檢出嵌合才能確立真性嵌合體[13],細(xì)胞遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)技術(shù)聯(lián)合使用可有效避免假性嵌合導(dǎo)致的不必要的產(chǎn)前干預(yù)。

經(jīng)檢測(cè),該胎兒為真性嵌合體,但檢出的三體嵌合比例存在較大差異。嵌合比例會(huì)影響患者表型,一般認(rèn)為非整倍體染色體的嵌合程度與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān),嵌合比例低表型相對(duì)溫和,嵌合比例高表型更為嚴(yán)重[11,14]。對(duì)16例15三體嵌合體胎兒表型的回顧性分析證實(shí)上述觀點(diǎn)[15]。準(zhǔn)確檢測(cè)妊娠期染色體的嵌合比例可有效評(píng)估疾病的嚴(yán)重程度,便于產(chǎn)前診斷遺傳咨詢中患者及家屬對(duì)生育做出更好的知情決定?；仡檶?shí)驗(yàn)流程和各項(xiàng)記錄排除人為差錯(cuò),對(duì)此差異展開分析。優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)和細(xì)胞株變異會(huì)導(dǎo)致不同核型的細(xì)胞在培養(yǎng)和未培養(yǎng)樣本之間結(jié)果不一致[16]。Chen等[17]發(fā)現(xiàn)未培養(yǎng)的羊水經(jīng)細(xì)胞遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)檢測(cè)均顯示為15三體嵌合體,而培養(yǎng)后的羊水經(jīng)兩種方法均未檢測(cè)到15三體,認(rèn)為羊水細(xì)胞中15三體細(xì)胞系可能在細(xì)胞培養(yǎng)后消失。Wan等[12]對(duì)NIPT檢出的8號(hào)染色體三體胎兒進(jìn)行羊水穿刺產(chǎn)前診斷,CMA檢測(cè)結(jié)果顯示8號(hào)染色體三體嵌合比例為40%,而羊水培養(yǎng)分析50個(gè)細(xì)胞均為正常核型。綜合分析,本研究中46,XN細(xì)胞系在羊水細(xì)胞培養(yǎng)過程中可能存在優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng),而凋亡的15號(hào)染色體三體細(xì)胞仍可被分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)出,從而出現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)的染色體核型分析檢出15三體嵌合比例僅為約6.67%,而未培養(yǎng)的CMA檢測(cè)出嵌合比例約70%。

FISH技術(shù)是染色體嵌合體驗(yàn)證的常用方法。染色體核型分析或CMA結(jié)果可協(xié)助FISH技術(shù)選擇相應(yīng)分子生物檢測(cè)探針。該技術(shù)無須細(xì)胞培養(yǎng),將探針與細(xì)胞核內(nèi)的DNA靶序列進(jìn)行雜交,能更真實(shí)地反映細(xì)胞嵌合的狀況[18]。流產(chǎn)羊水及胎盤FISH的檢測(cè)結(jié)果均為15三體嵌合體,羊水中15三體嵌合比例約為48%,胎盤中15三體嵌合比例約為39%,嵌合比例均位于此前染色體核型分析和CMA的比例中間,與我們的推測(cè)相符。同為未培養(yǎng)的羊水樣本,孕20周CMA檢測(cè)與孕23周FISH檢測(cè)出的嵌合比例不同,除考慮檢測(cè)技術(shù)不同帶來的結(jié)果差異,還需考慮孕周增加羊水中脫落細(xì)胞的胚層組成變化及三體拯救引起三體嵌合比例逐漸降低。

綜上所述,對(duì)產(chǎn)檢過程中NIPT篩查出的15號(hào)染色體異常孕婦進(jìn)行產(chǎn)前診斷時(shí)需考慮15三體嵌合體的可能。羊水穿刺聯(lián)合細(xì)胞遺傳學(xué)染色體核型分析及分子遺傳學(xué)CMA進(jìn)行遺傳檢測(cè)可為15三體嵌合體的產(chǎn)前診斷遺傳咨詢提供有效參考。對(duì)于終止妊娠的病例,對(duì)妊娠產(chǎn)物(如胎盤等)進(jìn)行FISH檢驗(yàn)復(fù)核可驗(yàn)證產(chǎn)前診斷的準(zhǔn)確性。