宋鈺輝 王 忠 張曉軍 楊蔚然 張之龍

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010000；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)外科，內(nèi)蒙古呼和浩特 010000

膠質(zhì)瘤作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，有著致死率高、早期復(fù)發(fā)率高、死亡率高、臨床治愈效果差的特征，由于其毛細(xì)血管的廣泛增殖使手術(shù)往往無法完全切除，5 年生存率＜10%[1]。膠質(zhì)瘤在以替莫唑胺為主的治療過程中，容易產(chǎn)生耐藥性且不良反應(yīng)突出，并且由于血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）和血腦腫瘤屏障（blood-brain tumor barrier，BBTB）的存在，大多數(shù)抗腫瘤藥物難以到達(dá)特定組織[1-2]。為了克服現(xiàn)有療法的局限性，需要一種可以穿越BBB 和BBTB，選擇性靶向組織給藥并且對非靶向組織毒性作用小的治療策略。目前研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)f 噬菌體在進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的同時(shí)不會產(chǎn)生明顯的毒性作用，在通過鼻內(nèi)給藥時(shí)，它可以作為藥物的載體攜帶藥物跨越BBB和BBTB[3-5]。此外，噬菌體展示庫可以快速篩選腫瘤靶向肽并建立了跨越BBB 篩選膠質(zhì)瘤靶向肽的方法，這些靶向膠質(zhì)瘤細(xì)胞的噬菌體不僅可以減少抗癌的毒副作用，并且可以刺激免疫反應(yīng)達(dá)到免疫治療的效果[3，6]。

1 Ff 噬菌體在膠質(zhì)瘤治療中的優(yōu)勢

Ff 噬菌體是由單鏈環(huán)狀DNA 及蛋白質(zhì)外殼組成，其中主要蛋白質(zhì)外殼PVⅢ位于體側(cè)，次要蛋白質(zhì)外殼（Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅸ）位于兩端，目前廣泛應(yīng)用于免疫治療中藥物、抗體及抗原肽的傳遞[7]。隨著噬菌體展示技術(shù)的發(fā)展構(gòu)建了噬菌體文庫用于選擇靶向噬菌體，如腫瘤靶向肽，顯著提高了Ff 噬菌體研究效率。由于傳統(tǒng)的化學(xué)治療藥物針對癌癥細(xì)胞的特異性不足，且同時(shí)具有不良反應(yīng)和藥物毒性，所以，靶向治療對于膠質(zhì)瘤尤為重要[8-9]。研究表明，靶向治療的關(guān)鍵是細(xì)胞膜對于藥物的滲透差，而載體的性質(zhì)影響了藥物在腫瘤組織及受腫瘤影響的相關(guān)組織的給藥效率[10]。Ff噬菌體相比于目前廣泛應(yīng)用的單克隆抗體可以在穿越BBB 的同時(shí)更加有效地附著在細(xì)胞膜的表面，進(jìn)而穿透細(xì)胞膜提高給藥效率。將Ff 噬菌體與外源肽的DNA 序列結(jié)合形成靶向肽在對物理和化學(xué)環(huán)境具有較強(qiáng)抵抗力的同時(shí)可以表達(dá)外源肽的蛋白質(zhì)活性，同時(shí)Ff 噬菌體展示外源肽可以與藥物相結(jié)合形成載藥噬菌體用于腫瘤的治療并降低藥物的毒性和副作用[11-12]。在Sartorius 等[13]的研究中發(fā)現(xiàn)Ff 噬菌體可以誘導(dǎo)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-2 和γ 干擾素，增加與腫瘤細(xì)胞的親和力，在提高免疫治療效率的同時(shí)降低了外源肽的細(xì)胞毒性及副作用，在目前以替莫唑胺為主的靶向治療藥物在抑制腫瘤細(xì)胞的同時(shí)會出現(xiàn)肝腎功能損傷、骨髓抑制，因此將Ff 噬菌體應(yīng)用于膠質(zhì)瘤治療會顯著降低上述副作用，并取得良好的臨床效果。在胃腸道腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)f 噬菌體可在穿越胃腸道黏膜的同時(shí)起到殺滅細(xì)菌的作用，F(xiàn)f 噬菌體在抗腫瘤增殖的同時(shí)也會起到對抗腫瘤繼發(fā)引起的感染，為膠質(zhì)瘤靶向治療提供一定理論基礎(chǔ)[14]。

2 Ff 噬菌體在膠質(zhì)瘤中的應(yīng)用

2.1 靶向肽和抗體的識別

2.1.1 體外平移 體外平移被用于識別特異性結(jié)合膠質(zhì)瘤細(xì)胞或蛋白質(zhì)。1981 年膠質(zhì)瘤干細(xì)胞特異性結(jié)合肽首次被發(fā)現(xiàn)，解剖后發(fā)現(xiàn)此多肽在注入小鼠體內(nèi)后可在其顱內(nèi)聚集，且在腫瘤組織中濃度較高，在正常腦組織中含量較低，表明此多肽可在穿越BBB 后與膠質(zhì)瘤組織特異性結(jié)合，后將目的基因編碼的多肽以融合蛋白的形式插入噬菌體表面表達(dá)特定蛋白質(zhì)的生物學(xué)特性，且該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因存在于噬菌體核心DNA 中[15]。通過噬菌體文庫分離出攜帶GL1 多肽的Ff 噬菌體，將其與人離體膠質(zhì)瘤組織結(jié)合后發(fā)現(xiàn)二者可產(chǎn)生特異性相互作用，這間接性提示該Ff 噬菌體可在顱內(nèi)與腫瘤組織結(jié)合。有學(xué)者將攜帶GL1的Ff 噬菌體注入小鼠體內(nèi)后發(fā)現(xiàn)該噬菌體與小鼠腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合，這在理論上顯示攜帶GL1 多肽的Ff 噬菌體可從噬菌體文庫中分離并用于治療膠質(zhì)瘤[16]。CD133 是一種可以識別膠質(zhì)瘤的細(xì)胞表面抗原。將靶向CD133 的肽與納米金相結(jié)合發(fā)現(xiàn)靶向肽可有效地進(jìn)入腦細(xì)胞外空間，同時(shí)蛋白激酶家族可以影響CD133 的表達(dá)。學(xué)者認(rèn)為靶向肽在與CD133 結(jié)合后可在穿過BBB 后發(fā)揮CD133 識別膠質(zhì)瘤組織的能力，與膠質(zhì)瘤表面抗原特異性結(jié)合后發(fā)揮靶向治療的作用，同時(shí)在蛋白激酶的影響下調(diào)控CD133 的識別能力進(jìn)而改善靶向治療效果[17]。Patil 等[18]發(fā)現(xiàn)，胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白2（insulin-like growth factor binding protein-2，IGFBP2）在膠質(zhì)瘤組織中水平高度上調(diào)并參與了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲，相反IGFBP2 濃度降低對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增生起到一定抑制作用，因此IGFBP2 抗體的分離對于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療極為重要，通過二者結(jié)合可降低IGFBP2 濃度。學(xué)者從Ff 噬菌體文庫中篩選出可以與IGFBP2 特異性結(jié)合的肽scFvB7J，在注入小鼠體內(nèi)后發(fā)現(xiàn)二者結(jié)合后可以顯著降低IGFBP2 濃度，這提示scFv B7J 可作為IGFBP2 的特異性抗體并抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤的遷移和侵襲[19]。以上研究結(jié)果表明Ff 噬菌體文庫可以在體外識別出與神經(jīng)膠質(zhì)瘤靶向結(jié)合肽，此結(jié)合肽在與腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合的基礎(chǔ)上可發(fā)揮其識別能力或降低生長因子濃度的特點(diǎn)，在該條件下影響腫瘤細(xì)胞的增生，達(dá)到靶向治療的作用，這也為神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療提供一種新療法。

2.1.2 體內(nèi)平移 體內(nèi)平移是指在動物模型中獲得特異性靶向肽，可以分離肽和抗體，通過神經(jīng)膠質(zhì)瘤異種移植物中Ff 噬菌體文庫的體內(nèi)生物淘洗來識別膠質(zhì)瘤的亞群。一方面，神經(jīng)膠質(zhì)瘤具有細(xì)胞層次結(jié)構(gòu)，是在頂點(diǎn)具有自我更新能力的膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞（glioma initiating cell，GIC）。將Ff 噬菌體文庫注入到神經(jīng)膠質(zhì)瘤的異種移植物中可獲得GIC，該GIC 的生物學(xué)特性與神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞相同，同時(shí)Ff 噬菌體文庫中存在可識別并與VAV3 和CD97 的特異性結(jié)合得到多肽，此多肽可在穿過BBB 后識別并與GIC 特異性結(jié)合，為膠質(zhì)瘤靶向治療提供基礎(chǔ)[20]。另一方面，對膠質(zhì)瘤脈管系統(tǒng)的破壞可有效減少腫瘤的血液供應(yīng)。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤小鼠模型中通過對Ff 噬菌體文庫進(jìn)行體內(nèi)生物淘洗后提取出納米抗體C-C7，將該抗體注入小鼠體內(nèi)后發(fā)現(xiàn)其在腫瘤組織中濃度增高且腫瘤組織旁血管血液供應(yīng)降低，C-C7 可以識別膠質(zhì)瘤異種移植物和膠質(zhì)瘤樣本中的腫瘤血管亞群，降低腫瘤血液滋養(yǎng)程度，提高靶向治療效率[21]。因此在動物模型中進(jìn)行體內(nèi)生物淘洗是一種非常實(shí)用的手段，在低成本條件下提高了篩選效率，是可以用于識別靶向膠質(zhì)瘤的分子工具。

2.2 靶向給藥載體的選擇

由于BBB 和BBTB 的存在使得膠質(zhì)瘤藥物進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到限制，其中98%以上的低分子藥物不能穿過BBB[22]。因此，有效的膠質(zhì)瘤治療藥物需要其跨越BBB 和BBTB。目前作用機(jī)制較明確的膠質(zhì)瘤治療載體以病毒為主，其中主要包括慢病毒、單純皰疹病毒、腺病毒及腺相關(guān)病毒，盡管病毒載體在轉(zhuǎn)載效率和安全性等方面得到極大提升，但以慢病毒為主的治療載體會引起免疫應(yīng)答，如導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動物產(chǎn)生慢性炎癥反應(yīng)和脫髓鞘病變，并且由于其穿透能力差及患者預(yù)后改善不佳等原因未應(yīng)用于臨床；在以腺病毒為治療載體研究中，因其生物學(xué)特征較為明確使得該載體在臨床應(yīng)用中產(chǎn)生較好效果，但Ⅰ期臨床試驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞后在5 mm 范圍內(nèi)可檢測出病毒，這表明其組織穿透能力有限[23-24]。在以聚乙烯亞胺、樹突狀大分子、聚β 子氨基酯為主的聚合物載體系統(tǒng)可穿越BBB 作用于腫瘤細(xì)胞，并且此載體更易與配體活性中心結(jié)合，通過調(diào)整分子量，電荷分布改變膠質(zhì)瘤治療效果[25]。然而此載體具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，在殺滅膠質(zhì)瘤細(xì)胞的同時(shí)對正常神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。以蛋白質(zhì)、多肽、干細(xì)胞為主的非病毒基因載體相比于病毒基因載體具有細(xì)胞毒性低的特點(diǎn)，然而其穩(wěn)定性差、轉(zhuǎn)染效率低等特點(diǎn)未應(yīng)用于臨床[26]。由于以上載體在研究過程中出現(xiàn)副作用及細(xì)胞毒性較大等問題，現(xiàn)迫切需要一種新載體完成靶向給藥過程。

1985 年噬菌體展示技術(shù)首先被發(fā)現(xiàn)，這項(xiàng)技術(shù)的關(guān)鍵是噬菌體上顯示的蛋白質(zhì)與其封裝的編碼序列之間的物理連接，通過在Ff 噬菌體表面展示多種蛋白質(zhì)、多肽以及抗體，并且將Ff 噬菌體展示文庫注入動物體內(nèi)以達(dá)到篩選靶向肽目的[27]。近幾年的研究主要集中在使用載體來改變藥物動力學(xué)。Porosk 等[28]在使用Ff 噬菌體展示技術(shù)的過程中結(jié)合細(xì)胞穿透肽pVEC 和膠質(zhì)瘤靶向肽序列g(shù)Ho 的兩種能力開發(fā)出靶向藥物遞送載體gHoPe2。將gHoPe2 注入小鼠模型中發(fā)現(xiàn)由于pVEC 細(xì)胞穿透能力較強(qiáng)，該載體可以有效穿過BBB 進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而gHo 的靶向能力可使gHoPe2 與神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織特異性結(jié)合。并且在小鼠異種移植物模型中，將gHoPe2 與阿霉素結(jié)合后發(fā)現(xiàn)此結(jié)合體比游離阿霉素藥效更加有效，但阿霉素對于非腫瘤細(xì)胞毒性較大，強(qiáng)制限制治療并與其他抗癌藥物聯(lián)合使用后發(fā)現(xiàn)阿霉素改善了載體的基因傳遞，不影響載體對癌細(xì)胞的選擇性并增強(qiáng)了對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力，此研究證明靶向運(yùn)送載體gHoPe2 聯(lián)合阿霉素用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療具有可行性[29]。

BBTB 是由腦腫瘤毛細(xì)血管形成的與BBB 不同的屏障，在靶向給藥的過程中會抑制給藥效率。Ff 噬菌體文庫中存在一種BBB/BBTB 穿透肽M1，將M1靶向修飾成為M1-RGD 后與藥物結(jié)合形成PDC M1-RGD-PTX，此結(jié)合物與傳統(tǒng)給藥載體相比可以明顯提高給藥效率，M1 在穿過BBB 的同時(shí)也存在較強(qiáng)BBTB 穿透力。將M1 注入小鼠體內(nèi)后在提高給藥效率的同時(shí)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，小鼠的存活時(shí)間明顯延長。這表明M1 可作為穿過BBB/BBTB 的載體，將其修飾后可形成一種與腫瘤特異性結(jié)合、抑制腫瘤增殖、提高治療效率的新載體[30]。以上研究提示從Ff 噬菌體文庫中篩選出的靶向肽具有較強(qiáng)的BBB/BBTB 穿透能力及腫瘤組織特異性結(jié)合力，將該靶向肽應(yīng)用于膠質(zhì)瘤治療可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)治療模式中的不足，通過基因修飾可進(jìn)一步發(fā)揮其優(yōu)勢，并且Ff 噬菌體展示技術(shù)在膠質(zhì)瘤的治療中也發(fā)揮明顯作用。

2.3 Ff 噬菌體可以將藥物運(yùn)送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)

由于BBB 的存在降低了靶向治療的給藥效率，因此帶藥載體通過BBB 的能力成為膠質(zhì)瘤治療的關(guān)鍵之一。BBB 在低級別膠質(zhì)瘤中功能處于正常狀態(tài)，F(xiàn)f 噬菌體可以通過BBB 并在鼻內(nèi)給藥時(shí)直接向中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳送藥物。同時(shí)Ff 噬菌體可以抑制膠質(zhì)瘤的生長，這種活性是由通過鼻內(nèi)途徑附著在病毒上的脂多糖分子介導(dǎo)的。Tsedev 等[31]將P3 衣殼氯毒素與inho 環(huán)狀單鏈DNA 基因包裝系統(tǒng)融合后生產(chǎn)出長度為50 nm 的噬菌體顆粒，將患者來源的膠質(zhì)瘤標(biāo)本植入小鼠顱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)后注入此噬菌體顆粒，該顆?？梢园邢蛐∈箫B內(nèi)原位患者來源的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腫瘤，提示此噬菌體顆粒具有較強(qiáng)BBB 穿透力及腫瘤特異性結(jié)合力，對于膠質(zhì)瘤治療也具有一定價(jià)值。對流增強(qiáng)傳送（convection-enhanced delivery，CED）是近幾年用于腦腫瘤化療的新方法，同時(shí)也是將M13 噬菌體傳送至顱內(nèi)的有效辦法，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的滲透是一個(gè)活躍的軸突轉(zhuǎn)運(yùn)過程，因此Ff 噬菌體可以通過CED 將藥物傳送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)用于膠質(zhì)瘤治療，但其效果仍需通過大量臨床試驗(yàn)證實(shí)。Ff 噬菌體可以在高級別膠質(zhì)瘤患者的正常血管受到干擾的情況下跨越BBB。Przystal 等[32]將腺相關(guān)病毒基因組和M13 噬菌體外殼相結(jié)合形成混合AAV/M13 噬菌體作為治療雙重靶向的神經(jīng)膠質(zhì)瘤的載體，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)重組載體靶向小鼠的顱內(nèi)腫瘤，并在人的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)基因，提示該雙重靶向載體在穿越BBB的同時(shí)也可以進(jìn)入神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，另因其特異性結(jié)合能力較強(qiáng)，將該重組噬菌體進(jìn)行基因修飾后可能會發(fā)揮更強(qiáng)的治療效果。其中PⅢ/PVⅡ噬菌體-基因組雙顯示系統(tǒng)可以攜帶兩種不同的外源性肽通過BBB 后進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)與腫瘤組織特異性結(jié)合執(zhí)行不同的生物學(xué)功能。盡管目前膠質(zhì)瘤治療藥物對腫瘤細(xì)胞有抑制作用，但研究表明其對正常細(xì)胞也會產(chǎn)生細(xì)胞毒性，F(xiàn)f 噬菌體具有抗腫瘤能力并且在鼻內(nèi)、CED 或靜脈注射時(shí)是無害的，將其作為載體可減少對于正常神經(jīng)細(xì)胞的損害[33]。有研究已使用人體腫瘤組織從Ff 噬菌體展示庫中獲取相應(yīng)配體，這具有更高的臨床相關(guān)性，并且這對于人體是可以耐受的，同時(shí)對膠質(zhì)瘤患者進(jìn)行不同劑量Ff 噬菌體展示毒性譜庫后獲得腫瘤歸位噬菌體抗體和可溶性單鏈抗體，發(fā)現(xiàn)這些抗體可與膠質(zhì)瘤特異性結(jié)合，并在臨床試驗(yàn)中應(yīng)用納米纖維形狀的Ff 噬菌體作為新型傳遞載體可有效穿透BBB 致使阿爾茨海默病、帕金森病患者顱內(nèi)蛋白失調(diào)，延緩了疾病進(jìn)展[34]。此外，F(xiàn)f 噬菌體在靜脈注射和人體循環(huán)后仍具有活性且未發(fā)生不良反應(yīng)，提示Ff 噬菌體展示技術(shù)可用于識別腫瘤特異性配體，同時(shí)開發(fā)出一種在患者體內(nèi)選擇Ff 噬菌體顯示配體的方案。根據(jù)以上學(xué)者的研究可以在理論上認(rèn)為Ff 噬菌體可應(yīng)用于膠質(zhì)瘤的靶向治療，并通過生物標(biāo)志物的特異性對膠質(zhì)瘤患者進(jìn)行管理，在靶向治療前對治療靶點(diǎn)進(jìn)行分析后開發(fā)個(gè)性化治療。

3 小結(jié)與展望

Ff 噬菌體展示技術(shù)是開發(fā)有效藥物傳送載體的有力方法，它為未來的個(gè)性化治療奠定了基礎(chǔ)。Ff 噬菌體在攜帶藥物的同時(shí)可增加藥物對于BBB/BBTB的滲透性，盡管目前對于Ff 噬菌體的分離及純化還存在諸多問題，但由于其安全性高，并且可以通過基因技術(shù)在其蛋白質(zhì)外殼上表達(dá)多種多肽，以附著靶向肽和抗體，并且其本身具有抗腫瘤能力，能與細(xì)胞毒性藥物相結(jié)合，使其成為膠質(zhì)瘤治療的理想載體。

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。