王懿，陳康，羅權(quán)能，成偉，2

1.湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院/湖南省人民醫(yī)院 肝膽外科，湖南 長(zhǎng)沙 410002；2.湖南省血吸蟲病防治所/湖南省第三人民醫(yī)院，湖南 岳陽 414022

1 近紅外熒光成像技術(shù)

分子成像技術(shù)使我們能夠在分子水平上觀察活體組織的生理或病理過程，從而在早期準(zhǔn)確診斷疾病。光學(xué)成像技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)組織和病理過程的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。近紅外區(qū)根據(jù)光譜波長(zhǎng)劃分為近紅外Ⅰ區(qū)（near infrared Ⅰ，NIR-Ⅰ）和近紅外Ⅱ區(qū)（near infraredⅡ，NIR-Ⅱ），波長(zhǎng)范圍分別為700～900 nm和900～1 700 nm[1]。近紅外熒光成像技術(shù)與肝膽外科常規(guī)影像學(xué)技術(shù)如CT、膽道造影等比較，具有成本低廉、使用簡(jiǎn)便、無放射性、安全性高等優(yōu)點(diǎn)[2]。

目前國(guó)內(nèi)外開展的熒光引導(dǎo)手術(shù)常用的染料是吲哚菁綠（indocyanine green，ICG）。ICG主要用于NIR-Ⅰ熒光成像，可被波長(zhǎng)為750～810 nm的光激發(fā)，發(fā)射波長(zhǎng)為840 nm的近紅外光，由硅鏡頭接收后成像。ICG具有靈敏度高、脂肪組織中淋巴結(jié)顯影效果好、過敏反應(yīng)發(fā)生率低等優(yōu)點(diǎn)[3]。NIR-Ⅱ熒光成像可以減少組織光子吸收、組織自發(fā)熒光和散射，實(shí)現(xiàn)更高的保真度和空間分辨率效應(yīng)[4]。NIR-Ⅱ成像具有優(yōu)越的空間、時(shí)間分辨率和深度組織穿透性，可以清晰區(qū)分解剖結(jié)構(gòu)（如內(nèi)臟器官、脈管系統(tǒng)、淋巴結(jié)、骨骼和腫瘤），適用范圍包括：（1）無創(chuàng)解剖成像；（2）實(shí)時(shí)獲取解剖和血流動(dòng)力學(xué)信息；（3）監(jiān)測(cè)血管疾?。ㄈ缛毖?、動(dòng)脈血栓形成、腫瘤和血管生成）的血流動(dòng)力學(xué)和血液灌注，以及常規(guī)成像技術(shù)無法捕捉的快速生理過程；（4）檢測(cè)生理和藥物作用的動(dòng)態(tài)過程；（5）用于圖像引導(dǎo)的臨床手術(shù)（例如腫瘤切除）[5]。近紅外Ⅰ區(qū)和近紅外Ⅱ區(qū)熒光探針的主要區(qū)別在于兩者激發(fā)光源的波長(zhǎng)不同。大多數(shù)探針主要是通過腫瘤血管的高通透性和滯留效應(yīng)被動(dòng)靶向。由于腫瘤是一種非正常組織，有著非常復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和獨(dú)特的微環(huán)境，如低氧、低pH值等。通過腫瘤微環(huán)境和正常組織微環(huán)境之間的差異設(shè)計(jì)提高了靶向能力的探針，ICG是唯一被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于臨床的熒光染料。ICG在近紅外Ⅰ區(qū)和近紅外Ⅱ區(qū)廣泛使用，現(xiàn)以ICG為例解釋其靶向機(jī)理：ICG通過外周靜脈注射后，能夠與低密度脂蛋白和高密度脂蛋白中的磷脂親水端相結(jié)合。當(dāng)ICG和脂蛋白的復(fù)合物進(jìn)入肝臟后，在正常生物體內(nèi)，ICG只能被具有主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)膜蛋白功能的肝細(xì)胞所攝取，而無法被機(jī)體的其他細(xì)胞所攝取[6]。ICG的攝取主要依靠有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體1B3（organic anion transporting polypeptide 1B3，OATPlB3）和鈉離子-牛磺膽酸共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Na+-taurocholate co-transporting polypeptide，NTCP）共同完成，其排泄通過毛細(xì)膽管上表達(dá)的多耐藥相關(guān)蛋白2（multidrug resistance-associated protein 2，MRP2）載體系統(tǒng)進(jìn)行[7]，基于上述原理ICG進(jìn)行肝膽熒光顯影。術(shù)中靜脈注射ICG，在高分化肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）中保留了門靜脈攝取的ICG，并伴有膽道排泄障礙，導(dǎo)致ICG在癌組織中蓄積，這使得術(shù)中ICG熒光成像能夠高度敏感地識(shí)別HCC[8]。局部注射ICG，ICG被淋巴系統(tǒng)吸收并與淋巴系統(tǒng)中的白蛋白結(jié)合，隨淋巴系統(tǒng)引流至淋巴結(jié)最終回流至血液系統(tǒng)。由于淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)緩慢，ICG可在淋巴系統(tǒng)內(nèi)存在較長(zhǎng)時(shí)間，從而實(shí)現(xiàn)淋巴結(jié)定位[9]。胰腺癌的腫瘤血管生成過程中會(huì)形成有缺陷的毛細(xì)血管。當(dāng)ICG灌注時(shí)，可從這種新生的脈管系統(tǒng)滲出，從而對(duì)胰腺腫瘤定位[10]。

2 NIR-Ⅰ ICG熒光成像技術(shù)的應(yīng)用

ICG在肝膽外科、乳腺外科、胃腸外科等多個(gè)臨床科室已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。本文將分別從以下幾個(gè)方面介紹ICG在當(dāng)前肝膽胰外科中的應(yīng)用。

2.1 NIR-Ⅰ ICG熒光成像在肝臟手術(shù)中的應(yīng)用

ICG經(jīng)肝臟特異性攝取并經(jīng)膽道排泄的特性使其在肝膽外科中得到廣泛的應(yīng)用。ICG熒光成像主要用于肝臟腫瘤的精準(zhǔn)定位，肝切除術(shù)中實(shí)時(shí)導(dǎo)航，微小病灶的偵測(cè)，以及腫瘤分化程度的初步判定等[11]。自2009年Ishizawa等[12]首次將近紅外熒光技術(shù)應(yīng)用于HCC肝切除術(shù)，近紅外熒光成像技術(shù)在肝膽外科使用頻率逐年升高，其功能與作用也不斷得到開發(fā)和改進(jìn)。對(duì)于腹腔鏡肝切除術(shù)，ICG熒光染色主要分為兩種：（1）正向染色法，通過術(shù)中解剖或術(shù)中超聲等手段辨別預(yù)切除肝段的門靜脈分支，使用細(xì)針穿刺并注入ICG溶液行預(yù)切除肝段或肝葉的熒光顯影；（2）反向染色法，分離出預(yù)切除肝段的門靜脈并切斷，此后經(jīng)外周靜脈使用ICG行保留肝臟部分的熒光顯影。ICG有多種用途：評(píng)估肝臟儲(chǔ)備功能，判斷腫瘤性質(zhì)，原發(fā)性肝癌的定位與邊界界定，定位轉(zhuǎn)移性肝癌，肝段染色等[13]。術(shù)中微小肝癌病灶的偵測(cè)與處理對(duì)于預(yù)后十分重要。以往外科醫(yī)師主要通過CT、MRI檢查識(shí)別微小肝癌病灶，但無法用于實(shí)時(shí)定位[14]。術(shù)中超聲可用于定位切除，但對(duì)微小肝癌靈敏性較低，且多數(shù)早期的肝癌病灶（＜1 cm）無典型新生血管，影像學(xué)特征難以在術(shù)前偵測(cè)識(shí)別[15]。ICG熒光成像對(duì)微小肝癌具有較高的靈敏度，不僅可以術(shù)中實(shí)時(shí)偵測(cè)肝癌病灶，還能夠偵測(cè)到術(shù)前CT、MRI未發(fā)現(xiàn)的微小病灶，從而降低腫瘤殘余風(fēng)險(xiǎn)，提升患者預(yù)后[16]。ICG熒光染色在HCC中可呈現(xiàn)出全熒光、部分熒光、環(huán)形熒光等類型，熒光來源于HCC細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和假腺結(jié)構(gòu)。高分化HCC中參與ICG攝取的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白仍然存在于癌細(xì)胞表面，但膽道排泄功能異常，導(dǎo)致ICG聚集在病灶內(nèi)表現(xiàn)為全熒光型；低分化HCC對(duì)ICG攝取減弱，且周圍正常組織受腫瘤壓迫導(dǎo)致ICG延遲排泄，故常表現(xiàn)為環(huán)形熒光型；中分化HCC的癌灶介于上述兩者之間，表現(xiàn)為部分熒光型[17]。肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌本身不攝取ICG，由于腫瘤壓迫或浸潤(rùn)導(dǎo)致膽道充血，周圍非腫瘤組織被染色，其腫塊型呈現(xiàn)邊緣型熒光，而混合型則呈現(xiàn)由膽管腫瘤浸潤(rùn)引起的節(jié)段性熒光，其機(jī)制需要進(jìn)一步研究證實(shí)[18]。ICG熒光成像技術(shù)在肝臟腫瘤染色、解剖性肝切除、活體肝移植、肝包蟲病手術(shù)等方面具有重要的臨床價(jià)值及應(yīng)用前景，有助于提高肝臟外科手術(shù)精準(zhǔn)度及腫瘤學(xué)療效（圖1）[19]。

圖1 不同肝臟腫瘤病灶I(lǐng)CG熒光染色[19]

2.2 NIR-Ⅰ ICG熒光成像在膽道手術(shù)中的應(yīng)用

Ishizawa等[12]證實(shí)了術(shù)中膽道造影的有效性。Aoki等[20]將ICG熒光成像用于腹腔鏡膽囊切除術(shù)（laparoscopic cholecystectomy，LC）導(dǎo)航，在14例患者中成功識(shí)別出10例患者的膽總管和膽囊管。Boogerd等[21]在用ICG引導(dǎo)LC時(shí)，其膽囊管檢出成功率高達(dá)96%，表明ICG能精準(zhǔn)可視化膽管系統(tǒng)。Kaibori等[22]驗(yàn)證了ICG熒光膽管造影可用于預(yù)防肝切除術(shù)后膽汁滲漏。在一項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照LC中，相比白光組，熒光膽道成像組具有更高的肝外膽管解剖結(jié)構(gòu)識(shí)別率，尤其在肝總管和副肝管的解剖識(shí)別具有顯著優(yōu)勢(shì)（圖2）[23]。有研究用放射造影劑與ICG混合稀釋后獲得了更加清晰的肝內(nèi)外膽管結(jié)構(gòu)成像[24]。在活體肝移植供體獲取肝切除術(shù)中，熒光成像可用于判斷膽管離斷位置，指導(dǎo)膽管吻合，有利于降低術(shù)后膽漏、膽管吻合口狹窄等并發(fā)癥發(fā)生率，用于判斷移植肝臟膽汁分泌功能[25]。熒光膽道成像能夠發(fā)現(xiàn)膽囊管擴(kuò)張及膽囊管內(nèi)的結(jié)石，但不能排除膽總管內(nèi)結(jié)石的存在[26]。

圖2 ICG熒光染色膽道成像[23]

2.3 NIR-Ⅰ ICG熒光成像在胰腺手術(shù)中的應(yīng)用

目前ICG在胰腺外科的應(yīng)用尚處于起始階段，原因在于胰腺實(shí)質(zhì)血供不及肝臟豐富，ICG難以有效富集于胰腺腫瘤，ICG在胰腺手術(shù)中應(yīng)用的報(bào)道較少。ICG熒光成像識(shí)別胰腺腫瘤，雖然不是常規(guī)方法，但是具有廣闊的應(yīng)用前景。在腹腔鏡胰十二指腸切除術(shù)中ICG熒光成像被用于驗(yàn)證胰腺系膜的完全切除，有利于改善預(yù)后[27]。有研究報(bào)道，由于腫瘤供血血管的差異，ICG熒光成像對(duì)胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的準(zhǔn)確識(shí)別率是100%，對(duì)胰腺囊性腫瘤的識(shí)別率是90.9%（圖3）[28]。ICG能夠識(shí)別完整的胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，甚至可以識(shí)別切除邊緣殘留的神經(jīng)內(nèi)分泌組織，Paiella等[29]對(duì)10例胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤患者術(shù)中注射ICG（25 mg，分5次注射，每次注射5 mg），熒光顯像率為100%。

圖3 ICG熒光染色胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤[28]

3 NIR-Ⅱ熒光成像技術(shù)的應(yīng)用

Welsher等[30]于2009年首次實(shí)現(xiàn)NIR-Ⅱ活體熒光成像。許多研究設(shè)計(jì)和開發(fā)了在NIR-Ⅱ窗口發(fā)射的新型熒光探針，包括半導(dǎo)體量子點(diǎn)（QDs）、有機(jī)熒光（NPs），單壁碳納米管（SWCNTs）等[31]。NIR-Ⅱ熒光探針可用于體內(nèi)肝損傷模型的動(dòng)態(tài)成像，監(jiān)測(cè)藥物誘導(dǎo)的肝毒性，準(zhǔn)確診斷和有效治療缺氧性腫瘤，及時(shí)跟蹤和評(píng)價(jià)放療的療效，以及肝缺血再灌注損傷病變的導(dǎo)航和病理分析，原位肝腫瘤的術(shù)前定位，評(píng)估胰腺腫瘤類型并鑒定腫瘤邊緣，胰腺癌的動(dòng)態(tài)成像并監(jiān)測(cè)低劑量放療和化療誘導(dǎo)的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞數(shù)量，預(yù)測(cè)胰腺炎的嚴(yán)重程度等（表1）。

表1 NIR-Ⅱ熒光探針及應(yīng)用

Chen等[42]NIR-Ⅱ熒光成像可更好地對(duì)肝臟成像。2020 年首次報(bào)道NIR-Ⅱ熒光成像引導(dǎo)下的肝癌手術(shù)，23例患者進(jìn)行了原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性肝腫瘤的切除，術(shù)中發(fā)現(xiàn)NIR-Ⅱ成像對(duì)腫瘤檢測(cè)靈敏度更高[43]（圖4）。NIR-Ⅱ成像能夠顯示一些被NIR-Ⅰ成像遺漏的腫瘤病變（表2）。

表2 NIR-Ⅱ成像能夠顯示遺漏病灶

圖4 NIR-Ⅱ熒光成像引導(dǎo)下的肝癌切除術(shù)[43]

4 近紅外Ⅰ/Ⅱ區(qū)熒光成像技術(shù)的局限性

4.1 NIR-Ⅰ熒光成像技術(shù)的局限性

ICG受激發(fā)后發(fā)出熒光的組織穿透最大深度為8 mm，組織穿透深度欠佳[46]。ICG熒光成像特異性較低，單純的ICG不具備腫瘤靶向性，對(duì)于非惡性病變?nèi)绺斡不Y(jié)節(jié)、囊腫等也可顯示熒光信號(hào)，在術(shù)中難以區(qū)分微小癌灶或良性病變。特別是對(duì)于肝硬化較嚴(yán)重的患者，ICG潴留在肝硬化結(jié)節(jié)中，術(shù)中單憑肉眼難以區(qū)分微小癌灶或肝硬化結(jié)節(jié)。對(duì)于深部病灶，ICG熒光成像偵測(cè)深度有限，無法探及肝實(shí)質(zhì)深部結(jié)節(jié)，假陽性率高。

ICG的定量研究主要集中在評(píng)估組織的血流灌注方面，但在肝臟手術(shù)中仍缺乏熒光的量化指標(biāo)。在確定膽管的解剖位置和走行區(qū)域時(shí)，使用NIR-Ⅰ熒光成像技術(shù)進(jìn)行膽管檢查，由于肝臟的高自發(fā)熒光背景，使肝門部膽管結(jié)構(gòu)圖像受到干擾而難以辨別；再加上膽管解剖變異，膽管炎性水腫，NIR-Ⅰ熒光難以穿透較厚結(jié)締組織，所獲圖像的信背比和分辨率較低，難以準(zhǔn)確識(shí)別膽管走行[47]。此外，NIR-Ⅰ熒光成像技術(shù)無法有效降低醫(yī)源性膽管損傷的風(fēng)險(xiǎn)。

4.2 NIR-Ⅱ熒光成像技術(shù)的局限性

NIR-Ⅱ熒光成像技術(shù)的瓶頸包括：（1）對(duì)于肝臟等大實(shí)質(zhì)器官仍難以突破幾厘米的穿透深度；（2）通過肝臟、腎臟的代謝緩慢，毒性大；（3）缺乏合適的成像儀器和光學(xué)探頭，儀器價(jià)格昂貴；（4）大多數(shù)NIR-Ⅱ探針未在臨床實(shí)踐中得到測(cè)試，臨床轉(zhuǎn)化速度慢。

5 小結(jié)與展望

近紅外熒光成像已成為臨床尤其是肝膽胰外科重要的診斷利器。在現(xiàn)有的診斷方法下，紅外熒光成像給醫(yī)師、患者均帶來了新的希望，有助于改善患者的預(yù)后。NIR-Ⅰ熒光成像在肝膽胰外科中取得了較好的療效，但NIR-Ⅰ難以穿透深部、深厚結(jié)締組織，假陽性率高。NIR-Ⅱ熒光成像較NIR-Ⅰ熒光成像在穿透深度、空間分辨率和抗自發(fā)背景熒光干擾方面效果更好，在前哨淋巴結(jié)定位、血管成像腫瘤探查、膽管識(shí)別[48]、引導(dǎo)腫瘤手術(shù)等方面均顯示了良好的臨床效應(yīng)，但其毒性高、缺乏特異性組織靶向特點(diǎn)限制了其在臨床上的應(yīng)用。開發(fā)安全、具有靶向基團(tuán)的新型熒光探針迫在眉睫。未來我們需要醫(yī)學(xué)、光學(xué)、材料學(xué)等多學(xué)科聯(lián)合開發(fā)新的熒光染色劑和成像設(shè)備，為患者帶來福音。