曹瑞珍，尹美珍，張國文，張樹軍，喬 偉

（內(nèi)蒙古民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028043）

近年來，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，快節(jié)奏的生活、長期的熬夜和不合理飲食等諸多因素，使2 型糖尿病的發(fā)病率逐年升高，且趨于年輕化。2019 年公布的數(shù)據(jù)顯示，全世界約有4.63 億糖尿病患者，其中，中國約占1/4［1］。2型糖尿病患者，隨著病情的進(jìn)展，前期的胰島素抵抗和后期胰島素分泌不足，使細(xì)胞對血糖利用障礙，葡萄糖在血液堆積引起血糖升高，進(jìn)而引起脂代謝紊亂，引起患者血脂升高［2］。高糖高脂和胰島素抵抗還可引起組織細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)加強(qiáng)，全身血管神經(jīng)損害，導(dǎo)致各種并發(fā)癥［3］，如糖尿病腎病、眼底病變、心腦及下肢血管病變等，而糖尿病腎病在終末期腎病患者中的百分比例逐年升高，需要引起大家足夠的重視。

中蒙藥在治療糖尿病方面有其獨(dú)特的優(yōu)勢，對糖尿病患者肝腎損傷的預(yù)防和治療也有豐富的經(jīng)驗(yàn)［4-5］。現(xiàn)代研究表明，中蒙藥大多是通過其有效成分如類胰島素、黃酮類、多糖類、生物堿類等促進(jìn)細(xì)胞對血糖的攝取、降低氧化應(yīng)激損傷等途徑而控制血糖和調(diào)節(jié)血脂等，同時(shí)利用這些活性物質(zhì)清除自由基等達(dá)到抗氧化、保護(hù)肝腎等器官的目的［6-8］。

塔本文都蘇方劑由黃精、玉竹、天冬、刺蒺藜和天花粉組成，每味藥有相似活性成分，也有自己獨(dú)特成分，這些活性成分或有抗氧化、調(diào)血脂功能，或有降糖功能等，組成方劑后功能互補(bǔ)，作用得到加強(qiáng)［7-8］，通過這些作用最終使肝腎等組織器官得到保護(hù)。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖墙⑻悄虿∧I病小鼠模型，考察塔本文都蘇提取物對糖尿病腎病小鼠腎功能的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1.5～2 月齡C57BL/6J 雄性小鼠70 只，SPF 級(jí)，體重18～22 g，購于吉林省億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司［SCXK-（吉）2018-0007］［8］。環(huán)境溫度24 ℃左右（空調(diào)），濕度50%左右。

1.2 主要試劑與儀器

塔本文都蘇各組方由內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院教師鑒定，從通遼市中醫(yī)院購買［8］。轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）多克隆抗體（上海谷研實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)：GOY-667）；鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ，sigma公司，批號(hào)：13071275422）；基底膜六胺銀染色液（北京雷根生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：DZ0050）；活性氧（ROS）試劑盒（批號(hào)：20190825）、肌酐（CRE）試劑盒（批號(hào)：20190920）、尿素氮（BUN）試劑盒（批號(hào)：20190821）、尿微量白蛋白（mAlb）試劑盒（批號(hào)：20190924）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號(hào)：20190815）、丙二醛（MDA）試劑盒（批號(hào)：20190809）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒（批號(hào)：20190912）和考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒（批號(hào)：20190927）均購自南京建成生物工程研究所。

RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞索生化儀器廠）；DY-89-1型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)（寧波新芝生物技術(shù)公司）；羅氏活力型血糖儀（德國羅氏公司）；ZS-2型自動(dòng)板式酶標(biāo)儀（京航宇浪琴設(shè)備公司）；奧林巴斯BX-41型顯微鏡（日本olimpus公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 TBWDS提取液的制備

取TBWDS 方劑400 g，20目粗粉，用75%乙醇2.40 L，浸泡10余小時(shí)，回流提取，并重復(fù)2次，將提取液合在一起，乙醇充分回收，用蒸餾水溶解，最后定容至1.25 L，配成每毫升含生藥0.32 g，按每星期的藥量分裝，4 ℃冰箱冷藏［8］。

1.3.2 動(dòng)物模型的建立及分組

70只小鼠按體重隨機(jī)分為正常對照組10只和糖尿?。―M）組60只，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，DM組不進(jìn)食24 h，然后以0.08 g/kg劑量連續(xù)腹腔注射STZ（溶解在檸檬酸緩沖液，酸堿度4.5）2 d，5 d后斷尾取血，用血糖儀測定空腹血糖濃度，大于11.1 mmol/L的小鼠為DM小鼠（成功46只）。對正常對照組小鼠繼續(xù)常規(guī)飼料飼養(yǎng)，DM小鼠改為高脂高糖飼料飼養(yǎng)，30 d后測定24 h尿蛋白≥30 mg者則認(rèn)為糖尿病腎病造模成功（43只）［8-9］。

將DN 小鼠隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍組和TBWDS 高劑量組、TBWDS 低劑量組，每組10只，每日按1 mL體積灌胃治療，TBWDS高、低劑量組小鼠分別給與8 g/kg和4 g/kg TBWDS提取物，二甲雙胍組小鼠給與30 mg/kg的二甲雙胍，模型組和正常對照組小鼠均給與等量蒸餾水［8］。正常對照組依舊常規(guī)飼料飼養(yǎng)，其余組繼續(xù)高脂高糖飼料飼養(yǎng)。

1.3.3 標(biāo)本采集

12周后對小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的采集和制備。（1）處死前1 d，用尿液收集器收集小鼠24 h尿液，離心后上清液分裝保存于4 ℃冰箱；（2）用斷頭取血法采集小鼠血液，制備血清，按組4 ℃保存以備用；（3）處死后，立即解剖取腎，將部分腎皮質(zhì)置于4%多聚甲醛中固定；（4）其余腎組織快速用冰冷的生理鹽水漂洗，并拭干水稱重，用生理鹽水于電動(dòng)勻漿機(jī)中制成10%勻漿，離心后取上清液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 標(biāo)本生化指標(biāo)檢測

取出保存的血清、尿液和腎勻漿液，分別按照試劑盒說明書，檢測各項(xiàng)指標(biāo)。（1）采用全自動(dòng)生化分析儀對血UA、BUN、Scr含量進(jìn)行測定，用ELISA法測尿mAlb含量。（2）取-20 ℃保存的各組腎組織勻漿上清液，按照試劑盒操作說明，用ELISA法測ROS含量，比色法測定MDA、SOD和GSH-Px的水平。

1.3.5 觀察腎組織病理學(xué)改變及TGF-β1表達(dá)量

（1）將各組固定24 h的腎組織取出，常規(guī)制作5 μm的石蠟切片，并分別行基底膜黏多糖六胺銀染色和HE染色，光鏡下觀察腎組織的病理學(xué)改變。（2）將上述制備的各組腎組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，按照TGF-β1免疫組化檢測試劑盒進(jìn)行抗原修復(fù)，過氧化氫酶阻斷，山羊血清封閉，兔抗TGF-β1多克隆抗體孵育，緩沖液洗滌，羊抗兔二抗孵育，鏈霉親合素-生物素復(fù)合物（SABC）標(biāo)記；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察并拍照。以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作為陰性對照，檢測小鼠腎皮質(zhì)TGF-β1的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

各組數(shù)據(jù)用xˉ±s表示。用SPSS20 軟件單因素方差分析及t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，P＜0.05 和P＜0.01分別表示有顯著、極顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 塔本文都蘇提取物對糖尿病腎病小鼠血清UA、BUN、Scr及尿mAlb的影響

模型組與正常對照組比較，小鼠血清Scr、BUN和UA濃度以及尿mAlb含量均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，TBWDS高、低劑量組的血清Scr、BUN和UA濃度以及尿mAlb含量均顯著降低（P＜0.01），且與二甲雙胍組比較無明顯差異。結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠血清UA、BUN、Scr及尿mAlb的比較Tab. 1 Comparison of serum UA，BUN，Scr and urine mAlb of mice in each groupxˉ±s，n=10

2.2 塔本文都蘇提取物對糖尿病腎病小鼠腎組織氧化及抗氧化指標(biāo)的影響

模型組與正常對照組比較，小鼠腎組織GSHPx、SOD 活性下降，而ROS、MDA 水平升高，有明顯差異（P＜0.01）；與模型組比較，TBWDS 高、低劑量組和二甲雙胍組的小鼠腎組織GSH-Px、SOD 活性均顯著上升（P＜0.01），而ROS、MDA 水平均明顯降低（P＜0.01）；TBWDS 高、低劑量組與二甲雙胍組比較，GSH-Px、SOD 活性均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但TBWDS 低劑量組在降低ROS、MDA 水平方面不如二甲雙胍組（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組小鼠腎組織GSH-Px、SOD、ROS及MDA的比較Tab. 2 Comparison of GSH-Px，SOD，ROS and MDA in kidney tissues of mice in each groupxˉ±s，n=10

2.3 塔本文都蘇提取物對糖尿病腎病小鼠腎組織的影響

圖1為各組小鼠腎組織HE染色結(jié)果，光鏡下可見正常對照組腎組織中腎小體和腎小管結(jié)構(gòu)清晰且較完整。模型組腎小管結(jié)構(gòu)不規(guī)整，腎小管上皮細(xì)胞腫脹、有空泡，甚至細(xì)胞游離部的胞質(zhì)和胞膜脫落；腎小球內(nèi)毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)明顯減少，系膜細(xì)胞增生，嗜酸性的基質(zhì)明顯增多，腎小囊擴(kuò)張。與模型組比較，二甲雙胍組和TBWDS提取液高劑量組的腎組織結(jié)構(gòu)改善較為明顯。

圖1 各組小鼠腎組織HE染色的光鏡照片F(xiàn)ig.1 Light microscope photos of HE staining in kidney tissue of mice in each group

各組小鼠腎組織六胺銀染色呈棕黃至棕黑色，可顯示腎小球系膜和基底膜以及腎小囊和腎小管的基底膜，見圖2。光鏡下明顯可見，模型組較其余各組小鼠腎小球系膜和基底膜染色重。正常對照組小鼠的腎小球內(nèi)血管、基底膜、系膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，而模型組呈現(xiàn)彌漫性腎小球系膜基質(zhì)區(qū)增寬，基質(zhì)增多，基底膜明顯增厚，球內(nèi)血管管腔狹窄。二甲雙胍組和TBWDS 提取物高、低劑量組的腎小球內(nèi)結(jié)構(gòu)明顯改善，球內(nèi)系膜和基底膜僅見局灶性改變，其中，二甲雙胍組和TBWDS提取物高劑量組改善最為明顯。

2.4 塔本文都蘇提取物對糖尿病腎病小鼠腎組織中TGF-β1蛋白表達(dá)的影響

TGF-β1在機(jī)體的腎臟細(xì)胞中都有廣范表達(dá)。TGF-β1免疫組化染色呈棕黃至棕黑色。圖3顯示，各組腎組織中腎小體、腎小管以及腎間質(zhì)均呈陽性染色，但與正常對照組比較，模型組的腎小體、腎小管以及腎間質(zhì)的染色均明顯加深，而二甲雙胍組和TBWDS提取物高、低劑量組的各部位染色則明顯較模型組的染色淺，尤其是二甲雙胍組和TBWDS提取物高劑量組染色更淺。這些結(jié)果表明，模型組腎組織細(xì)胞中TGF-β1表達(dá)明顯增強(qiáng)，而二甲雙胍組和TBWDS提取物可降低腎組織細(xì)胞中TGF-β1的表達(dá)。

圖3 各組小鼠腎組織TGF-β1免疫組化染色的光鏡照片F(xiàn)ig.3 Light microscope photos of immunohistochemical staining of TGF-β1 in kidney tissue of mice in each group

3 討論

糖尿病腎病（DN）從早期病變逐漸發(fā)展到腎衰竭，以往大家認(rèn)為，DN的早期病變發(fā)生在腎小球，但現(xiàn)在越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，腎小管病變不僅具有獨(dú)立性且病變的程度與腎功能的相關(guān)性更為密切，無論從發(fā)病時(shí)間上還是發(fā)病機(jī)制上均具有獨(dú)立性［10］。本實(shí)驗(yàn)的病理學(xué)觀察結(jié)果顯示，DN模型組小鼠的腎小球結(jié)構(gòu)以及腎小管上皮細(xì)胞的損傷較為嚴(yán)重，而TBWDS提取物能明顯改善腎組織的損傷。

活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）是多種氧自由基統(tǒng)稱，少量的ROS具有免疫和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用［11］，但過多的ROS 會(huì)破壞人體的組織細(xì)胞，而高血糖、高血脂、缺血等會(huì)刺激ROS 的產(chǎn)生，引起組織細(xì)胞損害［12-13］；ROS還可作為類似于第二信使，激活多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，TGF-β1通路就是其中最重要的一個(gè)［14］。ROS使TGF-β1表達(dá)增加，而TGF-β1促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化［15］。本實(shí)驗(yàn)通過分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)結(jié)合的手段，觀察到糖尿病腎病模型組小鼠的腎小球、腎小管以及腎間質(zhì)部位的TGF-β1表達(dá)明顯增強(qiáng)，這就意味著隨病情的發(fā)展，不僅出現(xiàn)腎小球纖維化，腎間質(zhì)也發(fā)生了纖維化。TGF-β1反過來又可刺激ROS的產(chǎn)生，從而加劇腎臟的損傷［16］。TBWDS提取物能明顯降低腎組織ROS含量并降低TGF-β1的表達(dá)，表明其具有抗氧化、保護(hù)腎組織纖維化的作用。

高糖高脂環(huán)境刺激下，機(jī)體產(chǎn)生的大量氧自由基使脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生MDA，同時(shí)降低SOD、GSH-PX的活性，使后兩者清除氧自由基和過氧化物的能力不足，MDA堆積，進(jìn)一步引起腎組織損傷［17］。本研究結(jié)果顯示，TBWDS 提取物高、低劑量組的SOD、GSH-PX 活性較模型組升高明顯，MDA 明顯降低，說明TBWDS提取物可提高機(jī)體抗氧化能力，減少M(fèi)DA產(chǎn)生，加速其清除，保護(hù)腎組織免受氧化應(yīng)激的損傷，從而改善腎功能。

由于腎小球基底膜的分子屏障和電荷屏障，在健康人和小鼠尿液中僅含有微量的白蛋白，尿微量白蛋白是反映腎早期損害的指標(biāo)［18］。腎小球基底膜受損，屏障破壞，致使通透性增加，引起大量白蛋白尿。血尿素氮和肌酐是反映腎損害的晚期指標(biāo)，反映腎小球?yàn)V過功能隨著腎纖維化的發(fā)生發(fā)展，腎小球?yàn)V過功能逐漸下降，導(dǎo)致血尿素氮和肌酐水平升高［19］。TBWDS提取物可以顯著降低糖尿病腎病小鼠尿mAlb含量和血肌酐、尿素氮的水平，能夠修復(fù)腎小球的損傷，改善腎功能。

糖尿病患者其不良飲食習(xí)慣，攝入高嘌呤食物，再加上高糖引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)，使組織細(xì)胞損傷，細(xì)胞中的嘌呤化合物分解代謝增強(qiáng)，產(chǎn)生尿酸增多，而由于其溶解度低，一旦含量升高就會(huì)沉積在腎臟，引起腎損傷；腎損傷后又引起尿酸的排泄障礙，進(jìn)一步使血尿酸升高［18］。近來發(fā)現(xiàn)，在2型糖尿病和糖代謝異常人群中高尿酸血癥者明顯高于正常人群，并且血尿酸在腎臟疾病進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用，可能是慢性腎臟?。–KD）進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［20］。因此，越早控制高尿酸血癥越有利于延緩DN的進(jìn)展，達(dá)到防止終末期腎衰竭。TBWDS 提取液具有明顯降低糖尿病腎病小鼠血尿酸水平的作用，進(jìn)而可以改善腎功能。

綜上所述，TBWDS提取物能夠提高DN小鼠腎組織細(xì)胞的抗氧化能力，改善和保護(hù)腎小球和腎小管的損傷，降低腎組織細(xì)胞對促纖維化因子TGF-β1的表達(dá)，從而保護(hù)腎功能。TBWDS提取物具體藥效成分及改善DN小鼠腎功能的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步開發(fā)和研究。