孟世龍 童銘豪 張徐 符新蕾 余陽 張偉 史曉林 劉康,*

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,杭州 310053

2.福建中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,福州 350000

3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院仙居分院,臺州 317300

4.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院,杭州 310005

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)是蛋白質(zhì)合成、折疊和分泌的主要部位,在細(xì)胞生命活動中扮演著重要的角色[1]。ER在合成蛋白質(zhì)的過程中,正確折疊的蛋白會被運(yùn)出腔外,而未折疊/錯(cuò)誤折疊的蛋白則留在腔內(nèi)被進(jìn)一步降解[2]。在某些因素影響下,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊功能發(fā)生紊亂,造成大量未折疊/錯(cuò)誤折疊蛋白累積,進(jìn)而誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

ER主要通過3種傳感蛋白來感知應(yīng)激壓力:肌醇需要酶1α(inositol requiring enzyme 1α,IRE1α)、雙鏈RNA活化蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PRK-like ER kinase,PERK)和活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6,ATF6)。在識別應(yīng)激壓力后,它們可以誘導(dǎo)未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)[3]。UPR是緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激壓力、恢復(fù)ER結(jié)構(gòu)和功能的主要途徑[4]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬在緩解ER壓力、維持ER結(jié)構(gòu)和功能方面與UPR相輔相成,也發(fā)揮著重要作用[5]。一方面,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬可以降解UPR途徑中不能清除的錯(cuò)誤折疊蛋白以及部分ER。另一方面,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬還可通過擴(kuò)大內(nèi)質(zhì)網(wǎng)容量,減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自身負(fù)荷,從而緩解應(yīng)激壓力[6]。此外,長期或高強(qiáng)度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)可能會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7]。

骨骼是一個(gè)動態(tài)的、代謝活躍的、功能多樣化的器官,主要由細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和磷酸鈣組成[8]。骨代謝過程主要由成骨細(xì)胞主導(dǎo)的骨形成和破骨細(xì)胞主導(dǎo)的骨吸收調(diào)控,共同維持骨礦物質(zhì)的密度和代謝平衡[9]。骨代謝一旦失衡,繼而會導(dǎo)致一系列代謝性骨病。其中,骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是老年群體中常見的骨代謝疾病,主要以骨量降低和骨組織細(xì)微結(jié)構(gòu)破壞為特點(diǎn)[10]。近來有研究表明[11-12],UPR信號傳導(dǎo)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬與OP之間存在密切聯(lián)系。此外,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下的UPR以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬也是維持ER結(jié)構(gòu)和功能的重要途徑[13-14]。其中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬在OP領(lǐng)域的研究內(nèi)容較新、相關(guān)研究較少。因此,本研究將主要從UPR的3種激活途徑來闡述UPR和OP之間的關(guān)系及作用機(jī)制。

1 UPR的激活途徑

在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未應(yīng)激狀態(tài)下,ER腔內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)(binding protein for immunoglobulins,BIP)或78000調(diào)節(jié)蛋白(glucose regulated protein of 78000,GRP78)結(jié)合,阻止相應(yīng)的傳感蛋白激活;在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下,BIP與腔內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域解離,啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[15]。

1.1 IRE1α信號通路

未折疊/錯(cuò)誤折疊蛋白累積過量時(shí),通過BIP釋放壓力信號,促使IRE1α聚合并自磷酸化,進(jìn)而激活其蛋白激酶活性和核酸內(nèi)切酶。IRE1α通過核酸內(nèi)切酶從X盒-結(jié)合蛋白1上(X box-binding protein 1,XBP1)切除26核苷酸內(nèi)含子,產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄蛋白XBP1s(X box-binding protein 1 splicing)。隨后,XBP1s轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)并與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)元件(ER stress response element,ERSE)的基因啟動子結(jié)合,激活UPR靶基因和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解途徑,緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[15-16]。

1.2 PERK信號通路

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激啟動后,PERK與真核生物起始因子2的α亞基(eukaryotic initiation factor 2α,eIF2α)結(jié)合,并使其磷酸化[17]。磷酸化的eIF2α能夠抑制蛋白質(zhì)翻譯,進(jìn)而緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。此外,磷酸化的eIF2α還可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子4(activating transcription factor 4,ATF4)的表達(dá)。ATF4可以增強(qiáng)生長停滯與DNA損傷誘導(dǎo)蛋白34(growth arrest and DNA damage inducible protein 34,GADD34)的活性,導(dǎo)致eIF2α去磷酸化以及恢復(fù)ER的蛋白質(zhì)合成水平[18]。

1.3 ATF6信號通路

感受到應(yīng)激壓力后,ATF6通過囊泡運(yùn)輸?shù)礁郀柣w,隨后被S1P和S2P蛋白酶依次剪切處理[19]。經(jīng)過剪切處理后的N端細(xì)胞質(zhì)片段ATF6p50轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核激活UPR靶基因,發(fā)揮與IRE1α-XBP1類似的作用[20]。此外,ATF6家族中的其他轉(zhuǎn)錄因子具有與ATF6類似的結(jié)構(gòu),如老年星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性誘導(dǎo)物質(zhì)(OASIS)、cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白H(CREBH)、CREB3以及CREB4。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下,它們也會發(fā)揮類似ATF6的作用。

2 UPR和骨質(zhì)疏松癥之間的關(guān)系

2.1 UPR調(diào)節(jié)成骨生成及分化

2.1.1IRE1信號通路:目前,IRE1-XBP1信號通路和成骨分化的相關(guān)研究較少,且部分研究之間存在爭議。Tohmonda等[21]研究表明,IRE1-XBP1通路可以促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。他們在骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP2)誘導(dǎo)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)成骨分化的過程中發(fā)現(xiàn),成骨分化過程伴隨著XBP1 含量、骨形成轉(zhuǎn)錄因子Osx表達(dá)、膠原蛋白I和骨鈣素的生物合成以及堿性磷酸酶活性的增高。隨后,他們敲除IRE1蛋白發(fā)現(xiàn),BMP2誘導(dǎo)成骨分化的過程中未見堿性磷酸酶活性增加,并且骨唾液蛋白(BSP)、膠原蛋白I和骨鈣素均有不同程度的降低,提示IRE1的缺失會抑制成骨細(xì)胞分化。而Guo等[22]報(bào)告了相反的結(jié)果,在IRE1敲低的情況下,BMP2誘導(dǎo)的C2C12系間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的作用增強(qiáng)。

2.1.2PERK信號通路:PERK-eIF2α-ATF4通路在成骨細(xì)胞分化以及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)成骨分化的過程中扮演著重要的角色。Zhang等[23]研究發(fā)現(xiàn),甲狀旁腺激素(PTH)刺激成骨細(xì)胞分化和增殖的分子機(jī)制與PERK-eIF2α-ATF4信號通路存在一定的聯(lián)系。Li等[24]研究表明,PERK-eIF2α通路在維持BMSC衰老表型中發(fā)揮著重要作用。通過salubrinal(eIF2α去磷酸化的抑制劑)激活eIF2α信號有助于衰老BMSC的清除和改善老年小鼠的骨完整性。此外,ATF4在成骨分化中也發(fā)揮著重要作用,而PERK對于激活A(yù)TF4至關(guān)重要[25]。ATF4不僅能夠誘導(dǎo)骨鈣素合成、加速骨質(zhì)礦化,還位于諸多調(diào)控成骨分化通路的下游。有研究證實(shí)[26-27],缺乏PERK基因的小鼠會出現(xiàn)嚴(yán)重的骨質(zhì)減少,主要表現(xiàn)為骨皮質(zhì)厚度、基質(zhì)礦化程度以及骨小梁體積和厚度均有不同程度的降低。相反,攜帶ATF4基因載體的小鼠成骨細(xì)胞,堿性磷酸酶活性和基質(zhì)礦化可以恢復(fù)到正常水平[27]。ATF4調(diào)節(jié)成骨分化的機(jī)制還與β-連環(huán)蛋白和CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer binding protein homologous protein,CHOP)有關(guān)。ATF4通過誘導(dǎo)細(xì)胞分化所需的β-連環(huán)蛋白合成,進(jìn)而促進(jìn)成骨分化。但是CHOP對成骨分化的作用還存在爭議。CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子,Zhou等[28]研究發(fā)現(xiàn),褪黑素可以通過抑制PERK-eIF2α-ATF4-CHOP信號軸,下調(diào)CHOP的表達(dá),抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡。Guo等[29]研究也發(fā)現(xiàn),高劑量的地塞米松(Dex)可以通過提高CHOP表達(dá),從而誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡。但有研究發(fā)現(xiàn)[30],CHOP在成骨細(xì)胞表型正常表達(dá)中是必需的,同時(shí)還能促進(jìn)成骨細(xì)胞生成。

2.1.3ATF6信號通路:ATF6可以誘導(dǎo)骨鈣素合成,從而參與成骨分化的調(diào)控過程[31]。BMP2誘導(dǎo)成骨分化的過程也涉及ATF6,BMP2通過加強(qiáng)Runx6與ATF3啟動子的結(jié)合,進(jìn)而提高ATF6的表達(dá)和活化。此外,ATF6家族的轉(zhuǎn)錄因子OASIS能夠通過UPR激活Collal基因轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而合成膠原蛋白Ⅰ。研究發(fā)現(xiàn)[32],缺乏OASIS基因的小鼠由于成骨細(xì)胞分化延遲,最終發(fā)展為嚴(yán)重的骨質(zhì)減少癥。其中,最顯著的特征是膠原蛋白Ⅰ減少。目前,關(guān)于ATF6及其家族轉(zhuǎn)錄因子在成骨分化的作用仍需進(jìn)一步研究。

2.2 UPR調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞生成及分化

2.2.1IRE1α-XBP1信號通路:IRE1α-XBP1通路主要通過誘導(dǎo)RANKL表達(dá)或直接結(jié)合NFATc1促進(jìn)破骨細(xì)胞生成[20]。RANKL/RANK誘導(dǎo)的鈣振蕩對破骨細(xì)胞的形成非常重要。研究發(fā)現(xiàn)[33],鈣振蕩可以通過肌醇1,4,5-三磷酸受體2(inositol 1,4,5-trisphosphate receptors 2,ITPR2)和ITPR3誘導(dǎo)IRE1α-XBP1信號通路的激活,進(jìn)而促進(jìn)NFATC1轉(zhuǎn)錄以及小鼠破骨細(xì)胞分化。但是在沒有ITPR2和ITPR3參與的情況下,細(xì)胞中還檢測到較低水平的XBP1。提示除ITPR2和ITPR3以外的鈣通道或其他機(jī)制,也可能參與RANKL誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

此外,IRE1α-XBP1通路還可參與炎癥因素介導(dǎo)的骨流失過程。磨損顆粒引起的假體無菌松動和假體周圍骨溶解是關(guān)節(jié)成形術(shù)的主要并發(fā)癥。研究發(fā)現(xiàn)[34],內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以通過BIP-IRE1α通路及下游的c-Fos、NF-kB和Ca2+等信號因子,介導(dǎo)假體周圍磨損顆粒誘發(fā)炎性骨溶解和破骨生成。Wang等[35]也發(fā)現(xiàn),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以通過促進(jìn)炎癥反應(yīng)介導(dǎo)磨損顆粒促進(jìn)破骨細(xì)胞形成和骨溶解。以上研究表明,IRE1α-XBP1通路可參與不同機(jī)制誘導(dǎo)的骨流失,并在破骨細(xì)胞形成以及骨吸收過程中發(fā)揮了積極作用。

2.2.2PERK-eIF2α信號通路:PERK-eIF2α通路在破骨細(xì)胞成熟分化過程中也扮演著重要的角色。研究表明[36],在破骨細(xì)胞分化過程中,伴隨著UPR的短暫激活。Guo等[37]也發(fā)現(xiàn),PERK可以通過激活NF-κB和MAPK通路,調(diào)控RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化和骨吸收。此外,他們還發(fā)現(xiàn)活性氧(ROS)可以誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,從而增強(qiáng)PERK磷酸化并進(jìn)一步促進(jìn)自噬以誘導(dǎo)破骨形成。Xu等[38]研究發(fā)現(xiàn),硼酸可以抑制RANKL誘導(dǎo)的PERK-eIF2α通路活化,顯著阻止脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的骨質(zhì)流失。

Salubrinal是eIF2α去磷酸化的抑制劑,可有效緩解小鼠骨量丟失。Li等[39]在小鼠廢用骨質(zhì)疏松癥模型中發(fā)現(xiàn),eIF2α表達(dá)水平與成骨細(xì)胞計(jì)數(shù)呈正相關(guān),與破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)。Salubrinal可以增加eIF2α表達(dá)水平,并抑制RANKL、NFATc1、CTSK和CHOP的表達(dá)。此外,他們還在小鼠去卵巢骨質(zhì)疏松模型中發(fā)現(xiàn)[40],Salubrinal通過抑制Rac1 GTP酶和NFATc1的活性來抑制TRAP和CTSK的表達(dá),從而抑制破骨細(xì)胞的遷移、粘附。He等[41]也發(fā)現(xiàn),Salubrinal可以作用于PERK-eIF2α信號通路,從而減少NFATc1的表達(dá)并抑制破骨形成。綜上所述,PERK-eIF2α通路對破骨形成有積極影響,但是更詳細(xì)的機(jī)制需要進(jìn)一步探索和驗(yàn)證。

2.2.3ATF6信號通路/CREBH:目前,ATF6對破骨細(xì)胞的調(diào)控作用存在爭議。但是AFT6家族轉(zhuǎn)錄因子CREBH已被證實(shí)可促進(jìn)破骨細(xì)胞生成。Zheng等[42]研究表明,S1P可以促進(jìn)破骨細(xì)胞生成。在S1P缺陷的破骨細(xì)胞中,S1P和ATF6的表達(dá)水平顯著降低,但BIP、XBP1、PERK、ATF4等其他內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)水平無顯著變化。提示S1P可能通過其他機(jī)制調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化和骨吸收。

CREBH作為AFT6家族的轉(zhuǎn)錄因子,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用機(jī)制類似ATF6。研究發(fā)現(xiàn)[3],CREBH激活后,其結(jié)構(gòu)域可以進(jìn)入細(xì)胞核中,通過與NFATC1結(jié)合并上調(diào)其表達(dá)水平,最終促進(jìn)RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成。此外,在炎癥因素介導(dǎo)的骨吸收過程中,炎癥因子TNF-α通過NF-κB通路上調(diào)CREBH表達(dá)水平,進(jìn)而抑制BMP2介導(dǎo)的骨形成,同時(shí)又能提高NFACT1的表達(dá),促進(jìn)破骨分化[18]。

3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬和骨質(zhì)疏松癥之間的關(guān)系

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬是Bernales等[43]在研究UPR時(shí)發(fā)現(xiàn)并首次命名。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬是通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)碎片化,并將其轉(zhuǎn)移至溶酶體進(jìn)行清除的選擇性自噬過程。目前,關(guān)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬的相關(guān)研究主要以巨自噬為主,過程主要分為4個(gè)步驟[44]:①內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬受體通過LC3、Atg8、GABARAP作用結(jié)構(gòu)域與自噬雙層膜相互作用,形成碎片從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上脫離;②自噬雙層膜包裹內(nèi)質(zhì)網(wǎng)部分片段形成自噬小體;③自噬小體外膜與溶酶體融合;④溶酶體降解過程開始。

作為一種新發(fā)現(xiàn)的自噬類型,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬與OP之間也存在一定的聯(lián)系。除自噬基礎(chǔ)作用機(jī)制外,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬還可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬受體影響骨代謝過程。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬受體不僅可以識別ER腔內(nèi)累積的蛋白或受損內(nèi)質(zhì)網(wǎng),還能通過LC3、Atg8相互作用域與相關(guān)蛋白LC3/Atg8/GABARAP特異性結(jié)合,形成自噬體進(jìn)而發(fā)揮降解作用[45]。根據(jù)目前研究[2],哺乳動物中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬受體主要包括FAM134B、RTN、ALT3、TEX264、SEC62、CCPG1 6種。成纖維細(xì)胞生長因子18(FGF18)通過FAM134B的TFEB/TFE依賴性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)特異性激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬,這是骨化和骨骼發(fā)育的必需過程[46]。ATL可以調(diào)節(jié)脂質(zhì)液滴大小并抑制骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)信號傳導(dǎo),但是具體作用機(jī)制尚不明確[47]。有研究指出,ATL3突變會導(dǎo)致感覺神經(jīng)病變和骨質(zhì)破壞[48]。CCPG1的跨膜域錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上,胞質(zhì)面含有兩個(gè)FIP200互作區(qū)域(FIRs),胞質(zhì)N端還有一個(gè)能與LC3/GABARAP互作的LIR[49]。其中,成骨細(xì)胞的FIP200的缺失會導(dǎo)致小鼠骨量減少以及骨骼發(fā)育受損,同時(shí)還伴有小鼠骨骼顯著的機(jī)械性能改變,抵抗斷裂的強(qiáng)度下降[41],而LC3的缺失會對破骨細(xì)胞骨吸收過程產(chǎn)生影響[42]。

綜上所述,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬與OP之間存在著一定的聯(lián)系。但是目前內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬和疾病的相關(guān)研究主要集中在腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等方面,在OP領(lǐng)域的研究很少,未來有待深入研究。

4 小結(jié)及展望

UPR的3條激活路徑在骨代謝的調(diào)控過程中扮演著重要角色。其中,PERK信號通路的研究是最多、最為成熟的,在成骨和破骨分化中均發(fā)揮著重要作用。PERK通路的主要功能是促進(jìn)破骨細(xì)胞分化,PERK位于RANKL-RANK介導(dǎo)的破骨發(fā)育信號通路的下游,與NF-kB、MAPK、ROS、Ca2+、NFATc1等信號因子之間存在密切的聯(lián)系。在促進(jìn)破骨分化方面,PERK通路存在巨大潛力,未來有待深入研究。此外,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬和骨代謝之間也有一定聯(lián)系,但是其過程較為復(fù)雜,與ROS、炎癥因素、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激之間有著復(fù)雜的聯(lián)系。目前該領(lǐng)域的研究內(nèi)容較少、較新,仍有許多機(jī)制尚不明確,未來有待進(jìn)一步研究補(bǔ)充。值得注意的是,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬受體CCPG1介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬,是兩者之間聯(lián)系的直接途徑,未來有待深入研究。