鐘舒紅 彭紅艷 李軍 石艷 白慧麗 李常挺 馬春霞 吳翠蘭 蘭美益 彭昊

摘要： 利用形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)與分子生物學(xué)方法對(duì)分離自牛瘤胃內(nèi)容物的1株腸球菌GXNN20210320-4進(jìn)行分類學(xué)鑒定，并通過生長(zhǎng)性能測(cè)定，動(dòng)物安全性試驗(yàn)、耐受性試驗(yàn)及體外抑菌試驗(yàn)等評(píng)價(jià)該菌的益生特性，旨在為進(jìn)一步研究該菌株及開發(fā)成益生菌制劑提供一定的前期基礎(chǔ)。結(jié)果顯示，腸球菌GXNN20210320-4為屎腸球菌，該菌從4 h開始進(jìn)入對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期并持續(xù)至14 h，生長(zhǎng)繁殖速度較快，生長(zhǎng)周期短，適合工業(yè)化生產(chǎn)。小鼠安全性試驗(yàn)顯示，屎腸球菌GXNN20210320-4不是致病性微生物，對(duì)于動(dòng)物可能是安全的。在模擬人工胃液（pH值=3.0）和模擬人工腸液（pH值= 6.8）中孵育3 h后屎腸球菌GXNN20210320-4存活率分別為76.85%、80.26%，在0.3%膽鹽濃度下孵育1、3 h的存活率分別為83.15%、70.74%，在0.5%膽鹽濃度下孵育1、3 h的存活率分別為57.97%、46.78%，說明屎腸球菌GXNN20210320-4具有較好的耐酸耐膽鹽能力，該菌株能夠經(jīng)受胃腸道消化液的抑制而發(fā)揮作用。屎腸球菌GXNN20210320-4在60 ℃水浴中孵育15 min后仍有82.35%的菌株存活率，80 ℃水浴中孵育 15 min 后活菌數(shù)為0，表明屎腸球菌GXNN20210320-4可耐受60 ℃高溫，而不能長(zhǎng)時(shí)間耐受80 ℃的高溫。體外抑菌試驗(yàn)顯示，屎腸球菌GXNN20210320-4對(duì)鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均具有一定的抑制能力，其中對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用最好。綜上所述，本研究中的牛源屎腸球菌GXNN20210320-4生長(zhǎng)性能良好，對(duì)動(dòng)物無致病性，具有良好的益生特性和抑菌作用，可作為益生菌株進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用。

關(guān)鍵詞： 屎腸球菌；分離鑒定；益生特性；抑菌作用；益生菌

中圖分類號(hào)：S182 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）02-0198-07

長(zhǎng)期以來，抗生素添加劑在畜禽生產(chǎn)中發(fā)揮著積極的促進(jìn)作用，然而，長(zhǎng)期將抗生素作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑添加在飼料中所導(dǎo)致的耐藥病原體和藥物殘留嚴(yán)重威脅著公共衛(wèi)生健康［1］。我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部194號(hào)公告宣布自2020年1月1日起，全面禁止在飼料中添加抗生素。在“禁抗”“替抗”的大環(huán)境下，益生菌作為抗生素潛在替代產(chǎn)品成為人們研究的熱點(diǎn)［2-3］。益生菌是一類服用一定量后能夠定殖在宿主腸道并對(duì)機(jī)體健康產(chǎn)生益生作用的活性微生物，因其具有抗腫瘤、抗過敏、抑制細(xì)菌生長(zhǎng)和增強(qiáng)機(jī)體免疫等作用，廣泛應(yīng)用于飼料、醫(yī)藥保健和食品等領(lǐng)域［4］。乳酸菌是定殖于動(dòng)物腸道中的一種重要生理菌群，因其具有調(diào)整機(jī)體腸道菌群平衡、調(diào)節(jié)機(jī)體代謝、提高機(jī)體免疫力和動(dòng)物生產(chǎn)力等益生功能，廣泛應(yīng)用于畜、禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中［5-6］。腸球菌作為乳酸菌的一種，其生長(zhǎng)性能好、抗逆性強(qiáng)、能產(chǎn)有機(jī)酸、細(xì)菌素等抑菌物質(zhì)，具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)機(jī)體胃腸道菌群平衡、維持微生態(tài)穩(wěn)定、提高機(jī)體免疫等益生作用，常被用作飼料添加劑［7-8］。屎腸球菌作為腸球菌的一種，被列入我國(guó)《飼料添加劑品種目錄（2023）》。同時(shí)，歐盟（EU）發(fā)布的2015/1053號(hào)法規(guī)，批準(zhǔn)屎腸球菌DSM 10663/NCIMB 10415作為母牛繁殖、保育仔豬和肉雞育肥、火雞育肥、貓和狗的飼料添加劑使用，屎腸球菌作為飼料添加劑在畜禽生產(chǎn)中有著廣闊的應(yīng)用市場(chǎng)［9］。因此，本研究利用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)與現(xiàn)代分子生物學(xué)相結(jié)合的方法，從牛瘤胃內(nèi)容物中分離鑒定得到1株屎腸球菌GXNN20210320-4，并進(jìn)一步對(duì)其生長(zhǎng)特性、動(dòng)物安全性、人工胃腸液耐受性、膽鹽耐受性、高溫耐受性及體外抑菌活性等益生特性進(jìn)行測(cè)定，旨在為牛源屎腸球菌益生菌制劑的研發(fā)提供基礎(chǔ)候選菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 牛瘤胃內(nèi)容物于2021年3月采自廣西南寧某養(yǎng)牛場(chǎng)。

1.1.2 供試菌株 用于體外抑菌試驗(yàn)的大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium），均由廣西獸醫(yī)研究所細(xì)菌室保存。

1.1.3 供試動(dòng)物 雄性8周齡健康C57 BL/6J小鼠［體質(zhì)量（18±2） g］，購自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 主要試劑 本研究中用到的主要試劑詳見表1。

1.2 方法

1.2.1 益生菌的分離培養(yǎng) 牛瘤胃內(nèi)容物和滅菌生理鹽水按1 ∶ 9混懸，上清液倍比稀釋，接種環(huán)蘸取適量稀釋液劃線于MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。接種環(huán)挑取單個(gè)長(zhǎng)勢(shì)較好的菌落繼續(xù)劃線接種MRS固體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，直至分離到形態(tài)一致的單個(gè)菌落，革蘭氏染色并觀察其染色結(jié)果和形態(tài)特征。同時(shí)，接種環(huán)挑取單個(gè)菌落接種MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃ 200 r/min恒溫培養(yǎng)24 h，連續(xù)活化3代，4 ℃保存?zhèn)溆?。益生菌的分離培養(yǎng)在廣西獸醫(yī)研究所細(xì)菌研究室進(jìn)行，后續(xù)益生菌益生性能的測(cè)定均相同。

1.2.2 分離菌的生化鑒定 根據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)（第二版）》腸球菌生理生化鑒定試驗(yàn)，采用細(xì)菌微量生化鑒定管對(duì)分離菌株進(jìn)行生理生化鑒定。

1.2.3 16S rRNA基因序列的測(cè)定 提取分離菌株DNA，采用通用引物27F（5′- A?G?A?G?T?T?T?G?A?T?C?M?T?G?G?C?T?C?A?G -3′）、1492R（5′- T?A?C?G?G?Y?T?A?C?C?T?T?G?T?T?A?C?G?A?C?T?T -3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為 1 500 bp。擴(kuò)增體系為25.0 μL，包括Taq mix 12.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，DNA模板2.5 μL，ddH2O補(bǔ)至25.0 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增結(jié)束后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。PCR 產(chǎn)物條帶大小符合預(yù)期，送蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行16S rRNA測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果通過NCBI中的BLAST進(jìn)行同源性分析。

1.2.4 分離菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定 將分離菌種子液按2%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 恒溫培養(yǎng)，并以MRS液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照，每隔2 h測(cè)定菌懸液吸光度D600 nm，繪制菌株生長(zhǎng)曲線。

1.2.5 動(dòng)物安全性試驗(yàn) 10只8周齡健康C57 BL/6J小鼠隨機(jī)分成2組，5只/組，分別為試驗(yàn)組（E），空白對(duì)照組（C）。E組灌服濃度為1×109 CFU/mL 的分離菌混懸液，C組灌服滅菌生理鹽水，0.2 mL/只，連續(xù)7 d。記錄試驗(yàn)期間2組小鼠的精神狀況，采食、飲水、運(yùn)動(dòng)及被毛生長(zhǎng)情況。

1.2.6 模擬人工胃、腸液耐受試驗(yàn) 參照丁詩瑤等的方法配制模擬人工胃液：稀HCl 16.4 mL，H2O 900 mL，胃蛋白酶10 g，均勻混合后蒸餾水定容至 1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值=3.0，過0.22 μm濾膜除菌，4 ℃保存?zhèn)溆茫?0-11］。

根據(jù)《中國(guó)人民共和國(guó)藥典（2015）》配制模擬人工腸液：KH2PO4 6.8 g，H2O 500 mL使之溶解，NaOH調(diào)節(jié)pH值=6.8，按10 g/L濃度加入胰蛋白酶，使之溶解，過0.22 μm濾膜除菌，4 ?℃保存?zhèn)溆茫?2］。

菌懸液按10%接種量分別接種至配制好的模擬胃、腸液中，混合均勻，于37 ℃水浴鍋中分別孵育0、3 h后，平板計(jì)數(shù)法分別計(jì)數(shù)0、3 h混懸液中屎腸球菌活菌數(shù)，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，求平均值。以菌株存活率評(píng)估屎腸球菌對(duì)模擬人工胃、腸液的耐受能力，菌株存活率計(jì)算公式如下：存活率=lg（3 h 活菌數(shù)）/lg（0 h活菌數(shù)）×100%。后續(xù)試驗(yàn)中屎腸球菌存活率的測(cè)定方法均相同。

1.2.7 膽鹽耐受試驗(yàn) 參照寧豫昌等的方法在MRS液體培養(yǎng)基中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0、0.3%和0.5%的豬膽鹽，將上述含不同濃度豬膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基于121 ℃條件下滅菌15 min，冷卻備用。菌懸液按10%接種量分別接種于不同濃度豬膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中，以不加豬膽鹽的培養(yǎng)基為對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)0、1、3 h后，平板計(jì)數(shù)法分別計(jì)數(shù)各濃度各時(shí)間段菌懸液中屎腸球菌活菌數(shù)和存活率［13］。

1.2.8 高溫耐受試驗(yàn) 參照翟夢(mèng)凱的方法測(cè)定屎腸球菌耐高溫能力，即提前將水浴鍋溫度分別調(diào)至37、50、60、80 ℃，菌懸液按10%接種量接種至滅菌生理鹽水后靜置于以上不同水浴中孵育 15 min，以37 ℃作對(duì)照，平板計(jì)數(shù)法分別測(cè)定不同溫度下菌懸液中屎腸球菌的活菌數(shù)和存活率［9］。

1.2.9 體外抑菌試驗(yàn) 參照鐘舒紅等的方法用牛津杯測(cè)定屎腸球菌對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的體外抑菌能力，即將滅菌牛津杯分別放置于涂有大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的LB固體培養(yǎng)基上，每個(gè)牛津杯中滴加150 μL屎腸球菌菌懸液，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，測(cè)定抑菌圈直徑（mm），以抑菌圈直徑大小評(píng)估屎腸球菌對(duì)致病菌的體外抑菌能力［14］。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離純化和形態(tài)學(xué)觀察

由圖1-A可知，分離菌在MRS瓊脂平板上菌落凸起呈圓形、表面光滑、邊緣整齊的灰白菌落，直徑為0.5～1.0 mm。由圖1-B可知，革蘭氏染色鏡檢呈單個(gè)、成對(duì)或短鏈狀排列，是無芽孢、無莢膜的革蘭氏陽性球菌。

2.2 分離菌鑒定結(jié)果

由表2可知，分離菌生理生化試驗(yàn)結(jié)果顯示，七葉苷試驗(yàn)、甘露醇產(chǎn)酸、精氨酸水解酶、馬尿酸鈉水解均呈陽性，觸酶試驗(yàn)、運(yùn)動(dòng)性和V-P測(cè)定及山梨醇產(chǎn)酸為陰性，能在6.5% NaCl中生長(zhǎng)，可發(fā)酵糖類，結(jié)果符合腸球菌生化標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)合菌株形態(tài)與革蘭氏染色結(jié)果，可初步鑒定該分離菌株為腸球菌，命名為GXNN20210320-4。

2.3 16S rRNA分子鑒定及序列分析結(jié)果

由圖2可知，分離菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)在1 000～2 000 bp 間出現(xiàn)1 500 bp的預(yù)期目的條帶。將PCR產(chǎn)物測(cè)序序列經(jīng)BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與NCBI基因庫中已收錄的屎腸球菌基因組序列相似度最高，并利用Megalign進(jìn)行同源性比較。由圖 ?3 可知，GXNN20210320-4（GenBank 登錄號(hào)MZ452349.1）菌株與基因庫中已收錄的11株屎腸球菌基因序列相似度高達(dá)99%以上，由此判定分離菌株GXNN20210320-4為屎腸球菌。隨后利用MEGA 7.0 軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，由圖4可知，MZ452349.1菌株與E.faecium GXNN20201226-1（MZ4523347.1）、E.faecium BHN-LAB 106（MN533909.1）親緣關(guān)系較近。

2.4 生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果

屎腸球菌GXNN20210320-4的生長(zhǎng)曲線，由圖5可知，從4 h開始進(jìn)入對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，并持續(xù)至14 h，14～18 h進(jìn)入穩(wěn)定期， 18 h后進(jìn)入衰亡期。本研究中分離鑒定的屎腸球菌生長(zhǎng)繁殖速度較快，生長(zhǎng)周期較短，適合工業(yè)化生產(chǎn)，是其作為益生菌制劑的一個(gè)很大的優(yōu)勢(shì)，為其作為飼料添加劑奠定了基礎(chǔ)。

2.5 動(dòng)物安全性試驗(yàn)結(jié)果

本研究試驗(yàn)觀察期間，灌服屎腸球菌GXNN20210320-4的陽性對(duì)照組小鼠與灌服生理鹽水的空白對(duì)照組均無死亡情況，2組小鼠一般的體態(tài)特征如呼吸、運(yùn)動(dòng)、行為、皮毛光澤、精神狀態(tài)無明顯差異。 結(jié)果表明，屎腸球菌GXNN20210320-4 不具有致病性，對(duì)動(dòng)物可能是安全的，但為了充分保證分離 菌株屎腸球菌 GXNN20210320-4在臨床使用上的安全性，下一步需進(jìn)行動(dòng)物的亞急性毒性試驗(yàn)和慢性毒性試驗(yàn)。

2.6 屎腸球菌耐受模擬人工胃、腸液能力測(cè)定結(jié)果

由表3可知，屎腸球菌GXNN20210320-4分別在模擬人工胃液（pH值3.0）和模擬人工腸液（pH值6.8）中孵育3 h后，存活率分別為76.85%、80.26%，說明屎腸球菌GXNN20210320-4無論對(duì)模擬人工胃液還是模擬人工腸液，均具有較好的耐受能力，該菌株能夠經(jīng)受胃腸道消化液的抑制而發(fā)揮作用。

2.7 屎腸球菌耐膽鹽能力的測(cè)定結(jié)果

由表4可知，屎腸球菌GXNN20210320-4在膽鹽濃度為0.3%情況下分別孵育1、3 h的存活率分別為83.15%、70.74%；隨著膽鹽濃度由0.3%提高至0.5%，屎腸球菌GXNN20210320-4存活率分別下降至57.97%、46.78%。說明膽鹽可降低屎腸球菌GXNN20210320-4的存活率，膽鹽濃度越高影響越大，但同時(shí)也說明，屎腸球菌GXNN20210320-4對(duì)0.3%膽鹽具有較好的抵抗能力。

2.8 屎腸球菌耐高溫能力的測(cè)定結(jié)果

由表5可知，在不同高溫條件下處理15 min后，以37 ℃為對(duì)照，屎腸球菌GXNN20210320-4在50～80 ℃條件下，存活率由103.10%下降至0，但在60 ℃中處理15 min仍有82.35%的存活率，說明屎腸球菌GXNN20210320-4能在60 ℃環(huán)境下生長(zhǎng)，而不能長(zhǎng)時(shí)間耐受80 ℃的高溫。

2.9 屎腸球菌對(duì)致病菌的體外抑菌能力測(cè)定結(jié)果

由表6可知，屎腸球菌GXNN20210320-4對(duì)鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑菌圈直徑分別為13.13、17.17、12.06 mm。結(jié)果表明，屎腸球菌GXNN20210320-4對(duì)鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均具有一定的抑制能力，其中對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用最好。

3 討論與結(jié)論

本研究從牛瘤胃內(nèi)容物中分離到的分離菌株GXNN20210320-4菌落凸起呈圓形、革蘭氏染色呈單個(gè)、成對(duì)或短鏈狀排列的G+球菌。其抗逆性較好，能在6.5% NaCl中生長(zhǎng)，七葉苷試驗(yàn)、甘露醇產(chǎn)酸、精氨酸水解酶、馬尿酸鈉水解均呈陽性，觸酶試驗(yàn)、運(yùn)動(dòng)性和V-P測(cè)定及山梨醇產(chǎn)酸陰性，可發(fā)酵糖類等主要生物學(xué)表型符合腸球菌屬特征。且分離菌GXNN20210320-4 16S rRNA測(cè)序結(jié)果與NCBI基因庫中收錄的屎腸球菌基因序列相似度高達(dá)99%以上，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化試驗(yàn)和16S rRNA序列分析可判定GXNN20210320-4為屎腸球菌。

對(duì)分離菌株進(jìn)行安全性評(píng)估，是篩選分離菌株作為益生菌或者微生態(tài)制劑基礎(chǔ)候選菌株的前提，而動(dòng)物急性口服毒性試驗(yàn)是作為細(xì)菌安全性評(píng)估的基本試驗(yàn)［15］。本研究連續(xù)7 d灌服屎腸球菌GXNN20210320-4（1×109 CFU/mL）的陽性對(duì)照組小鼠與灌服生理鹽水的空白對(duì)照組小鼠在觀察期間，其一般的體態(tài)特征、運(yùn)動(dòng)、飲食飲水也未發(fā)生明顯變化，表明屎腸球菌GXNN20210320-4無致病性，對(duì)動(dòng)物可能是安全的，但為充分保證屎腸球菌GXNN20210320-4在臨床使用上的安全性，下一步需進(jìn)行動(dòng)物亞急性毒性試驗(yàn)和慢性毒性試驗(yàn)，這結(jié)果與王朝等的試驗(yàn)研究結(jié)果［16］一致。

理想的益生菌或微生態(tài)制劑生產(chǎn)用菌株不但應(yīng)具有較好的生理功能還應(yīng)具備良好的抗逆性，這不僅可滿足菌株在工業(yè)生產(chǎn)過程中需要大規(guī)模傳代復(fù)制的要求，也同時(shí)能保證菌株更容易在體內(nèi)胃腸道中存活及定殖，特別是抵抗消化道中胃酸和膽鹽的侵襲［17］。體外試驗(yàn)在益生菌的益生特性評(píng)判中，由于其準(zhǔn)確性高、易于操作等優(yōu)點(diǎn)，往往作為實(shí)驗(yàn)室篩選優(yōu)良菌株的基礎(chǔ)工作。本研究分離鑒定的屎腸球菌GXNN20210320-4從4 h開始進(jìn)入對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，并持續(xù)到14 h，14～18 h進(jìn)入穩(wěn)定期，說明該屎腸球菌生長(zhǎng)繁殖速度較快，適合工業(yè)化生產(chǎn)，是其作為益生菌制劑的一個(gè)優(yōu)勢(shì)。

動(dòng)物胃腸道內(nèi)環(huán)境復(fù)雜，胃腸道中低pH值、高膽鹽環(huán)境能抑制微生物的生長(zhǎng)，潛在的益生菌應(yīng)具有較強(qiáng)的耐酸、耐膽鹽能力，還需要在腸道定殖并達(dá)到一定的濃度后才能發(fā)揮益生作用［18-19］。屎腸球菌作為動(dòng)物腸道的一種常見兼性厭氧型乳酸菌，腸道黏附能力和抗逆性較強(qiáng)［20］，而乳酸菌在代謝過程中本身能產(chǎn)乳酸，對(duì)低pH值環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，一般均可抵抗較低pH值的環(huán)境［21］。而在動(dòng)物十二指腸中，從肝臟中分泌出具有抑菌活性的膽鹽對(duì)細(xì)胞膜具有很強(qiáng)的破壞力，它的疏水作用可導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂和膜蛋白離解［22-23］，而小腸中的膽鹽濃度一般為0.03%～0.30%［24］，所以益生菌要在腸道中黏附和定殖，不僅需要承受低pH值環(huán)境，還需要能夠耐受高滲透壓的膽鹽環(huán)境。徐淑琴等研究中藏羊源屎腸球菌EF1-mh最低能耐受pH值=2.0的酸性環(huán)境，在0.3%的膽鹽濃度下培養(yǎng)8 h后活菌數(shù)仍有100 CFU/mL［25］。

沈中艷等研究顯示，豬源屎腸球菌在pH值=3.0的合成胃液中可存活3 h，在pH值=1.5的合成胃液中可存活3 min，而最高耐膽鹽濃度為3.0%［26］。Zaghloul等的研究顯示，海洋源屎腸球菌EA9在pH值=3的條件下孵育4 h的存活率為83%，在0.1%、0.3%的膽鹽濃度中持續(xù)培養(yǎng)24 h后的存活率分別為79.7%、60.0%［27］。因此，屎腸球菌可通過胃存活下來的可能性較大，具有良好的耐酸性，耐膽鹽能力，從而順利進(jìn)入腸道定殖發(fā)揮益生作用。本研究中，屎腸球菌GXNN20210320-4 分別在模擬胃液（pH值3.0） 和模擬腸液（pH值6.8） 中孵育3 h后， 存活率分別為76.85%、80.26%，其菌落形成單位活菌數(shù)從 108 CFU/mL降至106 CFU/mL， 說明本研究中的屎腸球菌GXNN20210320-4無論對(duì)模擬人工胃液還是模擬人工腸液，均具有較好的耐受能力，該菌株能夠經(jīng)受胃腸道消化液的抑制而發(fā)揮作用，而在膽鹽濃度為0.3%情況下分別孵育1、3 h，存活率分別為83.15%、70.74%，其菌落形成單位活菌數(shù)從108 CFU/mL分別降至106 CFU/mL和105 CFU/mL，表明屎腸球菌GXNN20210320-4對(duì)0.3%膽鹽具有較好的抵抗能力。駱海龍等對(duì)細(xì)菌適應(yīng)膽鹽脅迫的機(jī)制進(jìn)行綜述，認(rèn)為細(xì)菌可通過形成生物膜、修復(fù)受損的蛋白質(zhì)、調(diào)整能量代謝途徑與方式、修復(fù)與維持細(xì)胞膜完整性，利用特定的泵出系統(tǒng)將進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的膽鹽成分排至胞外等產(chǎn)生對(duì)膽鹽的抵抗能力［28］。

商品化的益生菌在生產(chǎn)、運(yùn)輸過程中可能會(huì)面臨特殊的環(huán)境，如溫度變化等。作為飼用微生態(tài)制劑時(shí)，飼料制粒過程中的高溫對(duì)細(xì)菌的活菌數(shù)影響也很大，所以菌株的耐熱能力也需要被考慮。蔡爽等在5株豬源屎腸球菌對(duì)溫度的耐受性試驗(yàn)研究中指出，不同屎腸球菌菌株對(duì)溫度的耐受具有差異性，經(jīng)過60 ℃熱處理10 min后，5株菌株均可穩(wěn)定的存在，經(jīng)過80 ℃熱處理10 min后， 只有1株菌株穩(wěn)定存在［29］。本試驗(yàn)中屎腸球菌GXNN20210320-4 在60 ℃水浴中孵育15 min后仍有82.35%的菌株存活率，80 ℃水浴中孵育15 min后活菌數(shù)為0，說明屎腸球菌GXNN20210320-4可耐受60 ℃高溫，而不能長(zhǎng)時(shí)間耐受80 ℃的高溫，在后期的益生菌制劑開發(fā)過程中可采用真空冷凍干燥或者膠囊包被技術(shù)可以提高活菌數(shù)。

屎腸球菌在生長(zhǎng)過程中能產(chǎn)有機(jī)酸、細(xì)菌素等特殊物質(zhì)，這些物質(zhì)具有抑制其他細(xì)菌生長(zhǎng)、繁殖的能力［30］。本研究利用牛津杯法測(cè)定屎腸球菌GXNN20210320-4對(duì)大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為12.06、13.13、17.17 mm，表明屎腸球菌GXNN20210320-4對(duì)大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌均具有一定的抑制能力。其結(jié)果與王朝等的研究結(jié)果［16，26］一致。

綜上所述，本研究從牛瘤胃內(nèi)容物中分離鑒定出1株益生性能良好的牛源屎腸球菌GXNN20210320-4，其生長(zhǎng)性能良好，對(duì)動(dòng)物無致病性，具有良好的益生特性和抑菌作用，可作為益生菌株進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用。

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收 稿日期：2023-03-22

基金項(xiàng)目：廣西重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：AB21238003）；南寧市重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：20212023）；廣西基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)（編號(hào)：桂科專項(xiàng) 21-6）。

作者簡(jiǎn)介：鐘舒紅（1986—），女，廣西臨桂人，碩士，高級(jí)獸醫(yī)師，主要從事動(dòng)物疫病防控和病原分子生物學(xué)研究，E-mail：zhongshuhong11@163.com；共同第一作者：彭紅艷（1994—），女，青海西寧人，碩士研究生，主要從事獸醫(yī)藥理與病理學(xué)方面的研究，E-mail：2018393040@st.gxu.edu.cn。

通信作者：彭 昊，博士，高級(jí)獸醫(yī)師，主要從事動(dòng)物疫病防控與病原分子生物學(xué)研究。E-mail：hpeng2006@163.com。