李文娜，秦 怡，彭偉盼

（天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300072）

0 引 言

MicroRNA（miRNA）是一類大約19 ～24 個(gè)核苷酸的非編碼小RNA，通過與目標(biāo)mRNA 的3’-UTR 結(jié)合而抑制蛋白質(zhì)的翻譯。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 可直接與蛋白質(zhì)相互作用，調(diào)節(jié)基因表達(dá)或影響表觀遺傳機(jī)制［1］。研究表明，miRNA的異常表達(dá)與多種癌癥（例如乳腺癌、肺癌及口腔癌等）的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可作為一種非侵入理想的生物標(biāo)志物用于腫瘤等疾病的檢測(cè)［2］。然而，miRNA具有序列短、同源性高及易降解等特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)其精準(zhǔn)檢測(cè)具有較大挑戰(zhàn)性［3］。因此，在過去的幾十年里，研究者投入了大量精力開發(fā)miRNA 檢測(cè)方法［4］。目前，miRNA 檢測(cè)技術(shù)可分為兩類：傳統(tǒng)檢測(cè)與新型檢測(cè)方法。其中，傳統(tǒng)miRNA檢測(cè)方法主要包括印跡雜交（Northern blot）技術(shù)［5，6］、微陣列分析技術(shù)［7，8］和定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)［5，9，10］。為了進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度和特異性，新型miRNA生物傳感器往往依賴于信號(hào)放大策略，如基于納米粒子的信號(hào)放大［11，12］及等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)的信號(hào)放大［13，14］等技術(shù)?；诖耍疚膰@傳統(tǒng)檢測(cè)方法與新型檢測(cè)方法兩個(gè)方面，總結(jié)miRNA檢測(cè)方法的研究成果，并討論了其在改進(jìn)miRNA生物傳感器設(shè)計(jì)方面的優(yōu)勢(shì)與局限性，最后，提出miRNA檢測(cè)技術(shù)未來的發(fā)展趨勢(shì)。

1 傳統(tǒng)miRNA檢測(cè)方法

傳統(tǒng)miRNA檢測(cè)方法主要包括Northern blot 技術(shù)、微陣列分析技術(shù)和qPCR技術(shù)。

Northern blot技術(shù)：該技術(shù)不僅可用于成熟miRNA 檢測(cè)，還可用于其前體檢測(cè)。如圖1（a）所示，基本原理如下：RNA樣本經(jīng)電泳分離后，轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜或尼龍膜上，設(shè)計(jì)含有miRNA 互補(bǔ)的序列及同位素或其他標(biāo)記的DNA標(biāo)記探針，利用對(duì)該探針的檢測(cè)實(shí)現(xiàn)miRNA 定量［15～17］。Northern blot技術(shù)可實(shí)現(xiàn)miRNA 的相對(duì)分子大小和相對(duì)豐度檢測(cè)，但存在半定量、靈敏度較低及操作復(fù)雜等弊端。

圖1 傳統(tǒng)miRNA檢測(cè)方法

微陣列技術(shù)：該技術(shù)廣泛應(yīng)用于miRNA 的高通量檢測(cè)。如圖1（b）所示，首先，通過標(biāo)記探針將目標(biāo)miRNA逆轉(zhuǎn)錄為熒光團(tuán)或生物素標(biāo)記的cDNA。其次，利用目標(biāo)miRNA序列相同的固相寡核苷酸與其配對(duì)并進(jìn)行熒光檢測(cè)［18］。如果雜交的cDNA被生物素化，鏈霉親和素標(biāo)記的熒光團(tuán)可被標(biāo)記；如果cDNA被熒光團(tuán)標(biāo)記，則可直接測(cè)量每孔的熒光強(qiáng)度，確定miRNA的表達(dá)水平。雖然微陣列技術(shù)一次性可分析數(shù)千個(gè)樣本，但存在成本高、操作復(fù)雜及特異性差等弊端。

qPCR技術(shù)：該技術(shù)具有動(dòng)態(tài)范圍大及靈敏度高等優(yōu)勢(shì)，已成為miRNA 常規(guī)且可靠的檢測(cè)技術(shù)。如圖1（c）所示，目標(biāo)miRNA通過莖環(huán)引物或聚胸腺嘧啶適配體逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)變成cDNA，利用PCR技術(shù)對(duì)cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)，從而確定miRNA 含量。qPCR 技術(shù)可實(shí)現(xiàn)miRNA 高靈敏檢測(cè)，但其假陽性高及引物設(shè)計(jì)困難等弊端限制了其進(jìn)一步應(yīng)用。

2 新型miRNA檢測(cè)方法

針對(duì)傳統(tǒng)miRNA檢測(cè)方法存在靈敏度低、特異性差且往往需要大型儀器輔助等缺陷。研究學(xué)者開發(fā)了多種新型miRNA生物傳感器，實(shí)現(xiàn)miRNA低成本、高靈敏及高特異檢測(cè)，在臨床診斷和生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域具有較大應(yīng)用潛力。主要包括：基于等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)信號(hào)放大的miRNA檢測(cè)方法與基于納米粒子信號(hào)放大的miRNA檢測(cè)方法。

2.1 基于等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)信號(hào)放大的miRNA檢測(cè)方法

等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)的出現(xiàn)，為miRNA高靈敏檢測(cè)帶來新契機(jī)，與傳統(tǒng)PCR 方法相比，其更適用于目標(biāo)物的及時(shí)快速檢測(cè)。目前，滾環(huán)擴(kuò)增（rolling circle amplification，RCA）、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、基于雙鏈特異性核酸酶（duplex-specific nuclease，DSN）擴(kuò)增和無酶擴(kuò)增等多種等溫核酸擴(kuò)增方法已被用于miRNA檢測(cè)，如圖2。通常利用SYBR Green 作為DNA 熒光嵌入染料，用于熒光實(shí)時(shí)檢測(cè)，然而，SYBR Green 染料以劑量依賴方式降低擴(kuò)增效率，易發(fā)生非特異性擴(kuò)增。為實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物特異性檢測(cè)，TaqMan 探針被用于檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，但其依賴Taq 外切酶的耐高溫活性。與TaqMan 相比，分子信標(biāo)（molecular beacons，MBs）和一步式鏈置換（one-step strand displacement，OSD）報(bào)告分子在檢測(cè)序列特異性核酸中具有更好的檢測(cè)性能，并可阻礙假陽性產(chǎn)物的生成。

圖2 基于等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)信號(hào)放大的miRNA檢測(cè)方法

2.1.1 基于RCA的miRNA檢測(cè)方法

RCA技術(shù)因其高靈敏度、高特異性的優(yōu)勢(shì)，廣泛應(yīng)用于核酸檢測(cè)中，其中，miRNA可作為啟動(dòng)RCA所需連接反應(yīng)的理想模板。近年來，為提高特異性與擴(kuò)增效率，研究學(xué)者基于Phi29 DNA聚合酶的強(qiáng)鏈置換活性，提出多種RCA改良技術(shù)，例如設(shè)計(jì)特殊的掛鎖或啞鈴探針、添加第二個(gè)引物等。如圖2（a）所示，Deng R等人［19］通過將RCA與支鏈介導(dǎo)的鏈置換也稱Toehold 介導(dǎo)DNA 鏈置換（Toehold mediated strand displacement，TMSD）反應(yīng)技術(shù)相結(jié)合，開發(fā)了一種新型miRNA原位檢測(cè)方法。該研究設(shè)計(jì)了啞鈴狀封閉探針在TMSD 和RCA 中均發(fā)揮了關(guān)鍵作用。目標(biāo)miRNA通過啟動(dòng)TMSD過程介導(dǎo)探針結(jié)構(gòu)的變化，從而觸發(fā)RCA反應(yīng)產(chǎn)生大量報(bào)告分子。與傳統(tǒng)的RCA 反應(yīng)，該系統(tǒng)依賴TMSD和啞鈴狀封閉探針的作用，與連接反應(yīng)或酶識(shí)別無關(guān)，提高了檢測(cè)的特異性。同時(shí)，基于RCA 的高效擴(kuò)增，與熒光原位雜交技術(shù)相比，該檢測(cè)平臺(tái)具有較高的靈敏度。

2.1.2 基于LAMP的miRNA檢測(cè)方法

LAMP是一種特異性強(qiáng)、靈敏度高及擴(kuò)增效率高的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)［4］，通過4～6 種不同的引物同時(shí)識(shí)別6～8種不同的目標(biāo)序列，從而明顯提高檢測(cè)的特異性。在大多數(shù)基于LAMP的miRNA定量檢測(cè)中，miRNA可作為觸發(fā)器啟動(dòng)反應(yīng)（圖2（b）），當(dāng)目標(biāo)miRNA 存在時(shí)，引物在DNA聚合酶的作用下進(jìn)行聚合延伸，并進(jìn)行鏈置換合成高分子量的DNA產(chǎn)物。Tian W 等人［23］將RCA 與LAMP 相結(jié)合，設(shè)計(jì)了快速且超靈敏RCA-LAMP 技術(shù)實(shí)現(xiàn)miRNA檢測(cè)。目標(biāo)let-7a可直接以鎖狀探針連接為模板，進(jìn)而觸發(fā)RCA反應(yīng)，產(chǎn)生重復(fù)串聯(lián)的擴(kuò)增產(chǎn)物。其次，RCA 產(chǎn)物可進(jìn)一步作為模板，生成大量具有功能序列的雙莖環(huán)DNA，作為后續(xù)LAMP反應(yīng)的起始原料。該生物傳感器通過目標(biāo)物介導(dǎo)連接反應(yīng)，依次觸發(fā)RCA與LAMP級(jí)聯(lián)反應(yīng)，顯著提高擴(kuò)增效率與檢測(cè)靈敏度，檢測(cè)限低至10 amol／L。該傳感器為miRNA的分析提供了廣闊的應(yīng)用前景，并可擴(kuò)展至多種基因生物標(biāo)志物的檢測(cè)。

2.1.3 基于DSN擴(kuò)增的miRNA檢測(cè)方法

目前，上述RCA 與LAMP 反應(yīng)仍依賴復(fù)雜的序列設(shè)計(jì)，包括莖環(huán)引物與模板。從整體上看，等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)設(shè)計(jì)復(fù)雜，并存在可能發(fā)生副反應(yīng)和檢測(cè)背景高等問題?；诖?，研究學(xué)者開發(fā)了以酶為基礎(chǔ)的等溫切刻擴(kuò)增技術(shù)用于miRNA 檢測(cè)。DSN 可水解DNA／RNA 或雙鏈DNA（double strand DNA，dsDNA）中DNA結(jié)構(gòu)，而對(duì)核苷酸序列無特殊要求?；贒SN的特性，miRNA可在該反應(yīng)中實(shí)現(xiàn)循環(huán)使用，有效放大檢測(cè)信號(hào)。如圖2（c）所示，Yin B C等人［21］報(bào)道了一種基于DSN的簡便快速的miRNA檢測(cè)系統(tǒng)。該系統(tǒng)無需設(shè)計(jì)復(fù)雜探針、鏈延伸或置換等過程。該方法僅需目標(biāo)miRNA 與Taqman 探針簡單配對(duì)雜交，可實(shí)現(xiàn)序列特異性miRNA 的定量檢測(cè)，檢測(cè)限低至fmol／L級(jí)別，比傳統(tǒng)MBs的檢測(cè)限低近5 個(gè)數(shù)量級(jí)。該生物傳感器靈敏高、特異性強(qiáng)、重現(xiàn)性強(qiáng)且操作簡單，有望成為組織或細(xì)胞中多種miRNA定量分析常規(guī)工具，并為生物醫(yī)學(xué)研究和臨床早期診斷提供應(yīng)用平臺(tái)。

2.1.4 基于無酶擴(kuò)增的miRNA檢測(cè)方法

無酶擴(kuò)增是一種由支鏈介導(dǎo)的DNA鏈置換反應(yīng)，因其無需變溫操作且無酶的優(yōu)點(diǎn)，在miRNA檢測(cè)等方面引起了廣泛關(guān)注。其中，催化發(fā)夾組裝（catalytic hairpin assembly，CHA）具有良好的信號(hào)放大能力及可忽略的背景干擾等優(yōu)勢(shì)，廣泛應(yīng)用于miRNA檢測(cè)領(lǐng)域。如圖2（d）所示，Kim H等人［22］基于目標(biāo)物觸發(fā)CHA 反應(yīng)和DNA-銀納米團(tuán)簇（DNA-Ag nanoclusters，AgNCs）的熒光增強(qiáng)技術(shù)，構(gòu)建了一種簡單、無酶及無標(biāo)記的miRNA 檢測(cè)策略，并可進(jìn)一步應(yīng)用于人血清樣本檢測(cè)。然而，該策略的靈敏度仍受到發(fā)夾組裝效率差和目標(biāo)與染料修飾的探針之間結(jié)合率低的限制?；诖?，Zhen S J等人［24］利用捕獲探針將染料修飾探針固定在氧化石墨烯（graphene oxide，GO）表面，構(gòu)建了高靈敏miRNA生物傳感器。當(dāng)目標(biāo)miRNA-21 觸發(fā)CHA 反應(yīng)，產(chǎn)生H1-H2探針時(shí)，染料修飾的探針才脫離GO 表面。通過收集熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)miRNA 定量檢測(cè)，檢測(cè)限低至47 pmol／L。

2.2 基于納米粒子信號(hào)放大的miRNA檢測(cè)方法

近幾年，隨著納米技術(shù)的蓬勃發(fā)展，納米粒子，例如金納米粒子（Au nanoparticles，AuNPs）、AgNCs、銅納米粒子（Cu nanoparticles，CuNPs）和多壁碳納米管-氧化石墨烯納米帶（MWCNTs-GONPs）等已成為改善傳統(tǒng)檢測(cè)方法性能的有力工具，可有效實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，提高檢測(cè)靈敏度，廣泛應(yīng)用于miRNA檢測(cè)研究領(lǐng)域，如圖3所示。

圖3 基于納米粒子信號(hào)放大的miRNA檢測(cè)方法

AuNPs具有強(qiáng)表面等離子體共振吸收和高消光系數(shù)等優(yōu)良光學(xué)性質(zhì)，廣泛應(yīng)用于生物檢測(cè)技術(shù)的開發(fā)?；贏uNPs的比色檢測(cè)技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)miRNA快速簡便且無需昂貴儀器輔助檢測(cè)。通過Au-S鍵結(jié)合目標(biāo)捕獲探針，實(shí)現(xiàn)AuNPs核酸探針的制備。目標(biāo)物存在時(shí)，通過觸發(fā)分散的AuNPs發(fā)生聚集反應(yīng)，產(chǎn)生強(qiáng)表面等離子體共振吸收，導(dǎo)致溶液顏色從紅色變?yōu)樽仙ersano S 等人［25］基于AuNPs表面等離子體共振吸收特性，構(gòu)建了比色生物傳感器用于生物樣品中miRNA 的檢測(cè)。如圖3（a）所示，當(dāng)目標(biāo)物存在時(shí)，觸發(fā)等溫切刻酶擴(kuò)增反應(yīng)，隨后擴(kuò)增產(chǎn)物和AuNPs、磁納米粒子偶聯(lián)，實(shí)現(xiàn)miRNA裸眼比色檢測(cè)。該檢測(cè)平臺(tái)靈敏度高且特異性強(qiáng)，檢測(cè)限低至amol／L 級(jí)別，同時(shí)可實(shí)現(xiàn)乳腺癌相關(guān)miRNA-10b檢測(cè)，并應(yīng)用于乳腺癌細(xì)細(xì)胞裂解液和乳腺癌小鼠模型的血清樣本檢測(cè)。同樣地，Li R D等人［26］受Park K W等人［27］實(shí)驗(yàn)的啟發(fā)，基于等溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)（exponential amplification reaction，EXPAR）與AuNPs信號(hào)放大，構(gòu)建了快速且靈敏的miRNA 比色生物傳感器。在50 fmol／L ～10 nmol／L的線性范圍內(nèi)，該檢測(cè)技術(shù)可實(shí)現(xiàn)miRNA定量，檢測(cè)限低至46 fmol／L，同時(shí)具備區(qū)分同源miRNA之間單核苷酸差異能力。

AgNCs具有高生物相容性、光穩(wěn)定性及亞納米尺寸等優(yōu)勢(shì)，可在生物檢測(cè)中作為新的信號(hào)轉(zhuǎn)換器。與AuNPs不同，當(dāng)富含鳥嘌呤的DNA序列與AgNCs結(jié)合時(shí)，可顯著增強(qiáng)其熒光強(qiáng)度，避免了其與核酸之間的共價(jià)連接。研究學(xué)者基于等溫?cái)U(kuò)增策略與AgNCs信號(hào)放大，構(gòu)建了多種高靈敏miRNA生物傳感器［19，28］。然而，由于AgNCs 對(duì)蛋白酶及酶促反應(yīng)條件比較敏感，可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差。為克服此弊端，科研工作者將AgNCs 與無酶擴(kuò)增技術(shù)（如CHA［22］和SDA［29］）結(jié)合，顯著提高檢測(cè)的靈敏度、特異性及穩(wěn)定性。

CuNPs具有無毒、高生物相容性和易合成等優(yōu)勢(shì)，引起研究者的廣泛關(guān)注，開發(fā)了多種生物傳感器用于miRNA高靈敏檢測(cè)［30，31］。如圖3（b）所示，Park K W等人［27］基于目標(biāo)輔助EXPAR技術(shù)結(jié)合聚（胸腺嘧啶）修飾熒光CuNPs作為信號(hào)探針，構(gòu)建了快速且超靈敏miRNA檢測(cè)平臺(tái)。同樣地，Borghei Y S等人［32］基于CuNPs熒光發(fā)射的變化，通過寡核苷酸置換CuNPs，成功實(shí)現(xiàn)人血清樣品中miRNA-155檢測(cè)。

近年來，碳納米材料也被廣泛應(yīng)用于miRNA 檢測(cè)領(lǐng)域，主要包括石墨烯和碳納米管（carbon nanotubes，CNTs），其在硬度、機(jī)械性能、耐熱性和導(dǎo)電性等方面均優(yōu)于其他材料。如圖3（c）所示，Wang J等人［33］將單鏈DNA捕獲探針固定于MWCNTs-GONPs修飾的電極表面，通過DSN 輔助靶標(biāo)循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了miRNA-21 高靈敏且高特異性檢測(cè)，檢測(cè)限低至0.034 fmol／L。

基于不同納米粒子信號(hào)放大的miRNA檢測(cè)方法如表1。

表1 基于不同納米粒子信號(hào)放大的miRNA檢測(cè)方法匯總

3 結(jié)束語

綜上所述，本文圍繞傳統(tǒng)miRNA 檢測(cè)方法與新型miRNA生物傳感器2 個(gè)方面，總結(jié)了多種miRNA 檢測(cè)策略，其進(jìn)一步推動(dòng)了等溫核酸擴(kuò)增策略與納米技術(shù)在生物檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用，為相關(guān)疾病的診斷與預(yù)防提供了新思路。然而，上述策略仍存在較大改進(jìn)空間，目前亟需開發(fā)更為便攜和智能化的多功能核酸生物傳感平臺(tái)，助力于miRNA和納米材料在臨床診斷中的實(shí)際應(yīng)用。