劉任祝,胡毅翔,閆慶梓,劉湘

伏立康唑是在氟康唑結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上合成的一種新型三唑類廣譜抗真菌藥,主要對(duì)急性侵襲性曲霉菌、耐氟康唑嚴(yán)重的侵襲性念珠菌屬、足放線病菌屬和鐮刀菌屬有良好的抗菌活性[1]。伏立康唑通過抑制真菌麥角甾醇生物合成,從而發(fā)揮抗真菌作用,目前已成為治療侵襲性曲霉菌病和耐氟康唑的光滑念珠菌、克柔念珠菌和白色念珠菌感染的首選藥物。

伏立康唑由CYP2C19介導(dǎo)代謝,具有代謝飽和性,使其體內(nèi)呈非線性藥動(dòng)學(xué),個(gè)體差異大。通過監(jiān)測(cè)伏立康唑體內(nèi)藥物濃度,從而預(yù)測(cè)臨床療效及避免不良反應(yīng)[2-3]。伏立康唑主要監(jiān)測(cè)體內(nèi)用藥谷濃度,可用于制定個(gè)體化給藥方案提高療效,確保用藥安全。當(dāng)伏立康唑谷濃度>2 μg/ml,可獲得88%以上的臨床有效率,當(dāng)谷濃度≤2 μg/ml有效率僅有54%;當(dāng)谷濃度為5～6 μg/ml時(shí),神經(jīng)毒性、視覺障礙和肝毒性等不良反應(yīng)發(fā)生率明顯升高[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)伏立康唑血藥濃度個(gè)體差異大,影響因素包括年齡、肝腎功能、CYP2C19基因多態(tài)性,以及由CYP2C19介導(dǎo)的藥物相互作用等[6]。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道激素、利尿劑等使用,以及患者感染程度也可能是影響伏立康唑血藥濃度的因素[7-8]。但由于缺乏大樣本、高質(zhì)量的隨機(jī)對(duì)照研究,現(xiàn)階段還未有一個(gè)可信的伏立康唑治療濃度范圍,且臨床療效及安全性方面的評(píng)估仍存在較大差異。治療藥物監(jiān)測(cè)(TDM)可通過測(cè)定血液或其他體液中藥物濃度并利用藥代動(dòng)力學(xué)原理和公式使給藥方案?jìng)€(gè)體化,以提高藥物療效,避免或減少不良反應(yīng),同時(shí)也為藥物過量引發(fā)不良反應(yīng)/事件的診斷和處理提供有意義的臨床依據(jù)。臨床藥師根據(jù)TDM結(jié)果,為患者提供個(gè)體化用藥方案,參與臨床診療實(shí)踐,使臨床用藥更加安全、有效、合理。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 LC-20AT高效液相色譜儀(包括SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、LC-20AT二元泵、SPD-20A紫外檢測(cè)器、CTO-10AS柱溫箱、DGU-20A在線脫氣機(jī),日本島津公司);Mini plus離心機(jī)(eppendorf公司);ME104電子天平(梅特勒托利多);FE28 pH計(jì)(梅特勒托利多);EASY系列超純水機(jī)(Heal Force)。伏立康唑?qū)φ掌?中國(guó)藥品生物制品檢定所);甲醇、乙腈(色譜純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司),磷酸、甲酸、硫酸鋅均為分析純;水為超純水(自制)?；颊哐獫{由湘潭市中心醫(yī)院各臨床科室提供;健康人空白血漿由醫(yī)院輸血科提供。

1.2 溶液配置 (1)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：精密稱取伏立康唑?qū)φ掌犯?0 mg,甲醇溶解,轉(zhuǎn)移至10 ml容量瓶中定容,配置成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?2)對(duì)照品工作液：取1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液2 ml置于50 ml容量瓶中,用10%甲醇定容,配置成質(zhì)量濃度為40 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,4 ℃保存?zhèn)溆谩?3)0.1%甲酸：精密量取甲酸1 ml置于1 000 ml容量瓶中,加水定容至刻度,真空泵抽濾,超聲脫氣,配置成0.1%甲酸沖液,4 ℃保存?zhèn)溆谩?4)硫酸鋅溶液：精密稱取七水硫酸鋅4.459 1 g,用50%甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至50 ml容量瓶中定容,配置成5%硫酸鋅(50%甲醇溶解、pH值3)的硫酸鋅溶液,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件：色譜柱：島津Inertsil ODS-4 C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相：0.1%甲酸∶乙腈=63∶37;流速：1 ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：255 nm;進(jìn)樣量：50 μl;柱溫：30 ℃。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控品制備：精密量取對(duì)照品工作液適量,用空白血漿稀釋20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5 mg/L各200 μl。另取對(duì)照品工作液適量,用空白血漿稀釋成2.5、5、10 mg/L,并分裝成200 μl數(shù)管,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 樣品處理：精密量取200 μl血漿樣品,加入200 μl 5%硫酸鋅(50%甲醇溶解、pH值3)溶液,渦旋混勻30 s,12 000 r/min離心5 min,取上清液50 μl進(jìn)樣。

2 結(jié) 果

2.1 專屬性試驗(yàn) 分別取空白血漿、加入伏立康唑?qū)φ掌返难獫{按1.3.3方法處理后分析,考察內(nèi)源性物質(zhì)的干擾。結(jié)果表明,對(duì)照品溶液、空白血漿和流動(dòng)相中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾樣品峰,伏立康唑的保留時(shí)間為10.624 min。色譜圖見圖1、圖2。

圖1 空白血漿色譜圖

圖2 加入伏立康唑?qū)φ掌返难獫{色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 在1.3.3方法處理后標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液,測(cè)定伏立康唑峰面積,以峰面積為橫坐標(biāo),系列溶液濃度為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合。伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=2.068 35×104X-6 599.46(R=0.999 4,R2=0.998 9,RSD%=9.002)

2.3 方法回收率試驗(yàn)和精密度試驗(yàn) 取1.3.2配置好的低、中、高濃度為2.5、5、10 mg/L血漿樣品各5份,按1.3.2方法處理后分析,計(jì)算日內(nèi)精密度和方法回收率均值,方法回收率=(實(shí)測(cè)濃度/目標(biāo)濃度)×100%;連續(xù)測(cè)定5 d,計(jì)算日間精密度。方法回收率、日內(nèi)精密度、日間精密度見表1。

表1 伏立康唑方法回收率、日內(nèi)精密度、日間精密度 (n=5)

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取1.3.2配置好的低、中、高濃度為2.5、5、10 mg/L血漿樣品各5份,按1.3.2方法處理,將上清液4 ℃放置0、4、24、48 h后重復(fù)測(cè)定,計(jì)算變異系數(shù)(CV%),血漿樣品穩(wěn)定性見表2。

表2 伏立康唑血漿樣品穩(wěn)定性 (n=5)

2.5 患者血藥濃度測(cè)定結(jié)果 2019年1月—2022年7月,醫(yī)院采用上述方法測(cè)定伏立康唑血藥濃度598例,按臨床專科統(tǒng)計(jì)學(xué)分類,以呼吸科、重癥監(jiān)護(hù)室、血液科、感染科居多。測(cè)定結(jié)果在目標(biāo)范圍(0.5～5.0 mg/L)內(nèi)的有411例(68.73%),<0.5 mg/L患者中18例低于檢測(cè)限值;>5.0 mg/L的有155例(25.92%),最高濃度為16.36 mg/L,而按目標(biāo)范圍(1.0～5.5 mg/L)內(nèi)的有402例(67.22%),見表3。

表3 2019年1月—2022年7月醫(yī)院患者伏立康唑血藥濃度測(cè)定結(jié)果

3 討 論

本文通過參考文獻(xiàn)[9-11]報(bào)道利用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定伏立康唑,選取適合本實(shí)驗(yàn)室的儀器參數(shù)和處理方法,建立一種較為精確、實(shí)用的伏立康唑測(cè)定方法,并根據(jù)監(jiān)測(cè)結(jié)果,對(duì)臨床應(yīng)用伏立康唑素實(shí)施全程藥學(xué)監(jiān)護(hù),避免不良反應(yīng)發(fā)生,為臨床個(gè)體化用藥提供科學(xué)依據(jù)。

3.1 樣品前處理、流動(dòng)相選擇 關(guān)于樣品前處理,國(guó)內(nèi)外采用的方法主要有固相萃取法、液液萃取法和蛋白沉淀法。固相萃取法成本較高、操作復(fù)雜,液液萃取操作復(fù)雜,而蛋白沉淀法操作簡(jiǎn)單、成本較低,故一般選取蛋白沉淀法。選擇合適蛋白沉淀劑處理樣品可減少內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)測(cè)定的干擾,一般為有機(jī)溶劑、重金屬鹽等。黃曉會(huì)等[12]文獻(xiàn)報(bào)道,選擇5%硫酸鋅效果較好。本文使用甲醇、5%硫酸鋅、10%硫酸鋅、5%硫酸鋅(50%甲醇溶解)、10%硫酸鋅(50%甲醇溶解)、5%硫酸鋅(50%甲醇溶解、pH值3)、10%硫酸鋅(50%甲醇溶解、pH值3)做蛋白沉淀劑進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)甲醇沉淀效果較好,但回收率較低。硫酸鋅沉淀效果較好,但常溫下離心后,靜置短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)渾濁,回收率>90%。使用50%甲醇(pH值3)溶解硫酸鋅做蛋白沉淀劑,沉淀完全,回收率基本維持在90%,但同樣硫酸鋅也會(huì)產(chǎn)生一定色譜吸收,故本文選用5%硫酸鋅(50%甲醇溶解、pH值3)作為蛋白沉淀劑處理樣品。

文獻(xiàn)報(bào)道HPLC測(cè)定伏立康唑采用的流動(dòng)相大多為一定濃度的甲酸,其主要目的是為調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH,從而改善峰型和解決樣品峰拖尾。本文使用0.5%、0.3%、0.1%甲酸及不同比例的甲醇、乙腈,綜合考慮保留時(shí)間、峰型、pH值對(duì)色譜柱及儀器損傷、空白血漿及內(nèi)源性物質(zhì)存在的干擾,最終選擇0.1%甲酸∶乙腈=64∶37作為流動(dòng)相。

3.2 臨床樣本監(jiān)測(cè)結(jié)果分析 目前國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道,伏立康唑血藥濃度范圍大多定在1.0～5.5 mg/L[13-15];而中國(guó)藥理學(xué)會(huì)治療藥物監(jiān)測(cè)委員會(huì)發(fā)布的《中國(guó)伏立康唑個(gè)體化用藥指南》推薦伏立康唑目標(biāo)血藥濃度范圍為0.5～5.0 mg/L,主要考慮當(dāng)血藥濃度>5.0 mg/L的亞洲患者肝毒性發(fā)生率升高,同時(shí)考慮血藥濃度≥0.5 mg/L患者感染治療有效率會(huì)更高。但從醫(yī)院伏立康唑TDM患者數(shù)據(jù)來(lái)看,若血藥濃度范圍設(shè)定為0.5～5.0 mg/L,達(dá)標(biāo)率升高,主要處于0.5～1.0 mg/L范圍內(nèi)例數(shù)比5.0～5.5 mg/L多9例。同時(shí)在臨床實(shí)踐過程中,觀察到血藥濃度處于5.0～5.5 mg/L時(shí),部分患者出現(xiàn)幻視和輕度肝功能損傷的幾率升高,因此對(duì)中國(guó)人群,伏立康唑血藥濃度監(jiān)測(cè)范圍設(shè)定為0.5～5 mg/L能提高感染治療有效率,同時(shí)降低不良反應(yīng)發(fā)生率。

綜上所述,臨床藥師通過監(jiān)測(cè)伏立康唑血藥濃度,及時(shí)建議醫(yī)師調(diào)整給藥方案,有助于臨床個(gè)體化給藥方案制定,在達(dá)到有效治療前提下減少藥物不良反應(yīng)和耐藥性產(chǎn)生,使其臨床應(yīng)用更加合理。臨床藥師在實(shí)際工作中,應(yīng)熟知患者臨床癥狀和相關(guān)檢查結(jié)果,合理利用血藥濃度監(jiān)測(cè)及基因檢測(cè)等手段,制定個(gè)體化給藥方案,為臨床合理化用藥提供理論依據(jù)。本研究由于臨床實(shí)踐復(fù)雜性,對(duì)根據(jù)檢測(cè)結(jié)果調(diào)整給藥方案后僅通過臨床效果驗(yàn)證,未建立群體藥動(dòng)學(xué)模型預(yù)測(cè)伏立康唑血藥濃度,存在一定不足。未來(lái)應(yīng)收集更多樣本,建立伏立康唑群體藥動(dòng)學(xué)模型進(jìn)行驗(yàn)證,為臨床用藥提供更加科學(xué)的依據(jù)。

利益沖突所有作者聲明無(wú)利益沖突