程 洪，張振洋，白炯堂，許貝貝，王 振*，潘玉春*

[1.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽（豬）資源評價利用重點(diǎn)實驗室，浙江杭州 310058；2.史記生物技術(shù)有限公司，安徽合肥 230031]

人工授精是目前養(yǎng)豬業(yè)中廣泛使用的一種繁殖技術(shù)，其關(guān)鍵環(huán)節(jié)在于豬精液的體外保存技術(shù)。精液保存分為常溫保存、低溫保存和冷凍保存3 種[1]。常溫和低溫保存精液又稱鮮精，其有效期都較短（2～10d)[2,3]，給遺傳資源的保存和育種計劃的實施帶來很多限制。在非洲豬瘟（African swine fever，ASF) 疫情威脅下，凍精較之鮮精更易保障生物安全、長期貯存，且優(yōu)秀公豬的精液通過冷凍保存能進(jìn)行廣泛的推廣[4]。但精子凍后活率較低、輸精后母豬繁殖效率不理想[5-7]。張鎖宇等[8]研究發(fā)現(xiàn)，凍精較鮮精在窩總產(chǎn)仔數(shù)上少1.26 頭，在窩產(chǎn)活仔數(shù)上少1.33 頭。因此，目前豬冷凍精液在人工授精生產(chǎn)中的實際應(yīng)用仍十分有限，世界只有約1%的母豬使用冷凍精液進(jìn)行人工授精[9]。

非洲豬瘟的暴發(fā)對地方豬種的保種和商品豬繁育產(chǎn)業(yè)都帶來了嚴(yán)重的挑戰(zhàn)。當(dāng)前地方豬種活體保種的管理模式應(yīng)對ASF 的能力非常脆弱，存在群體規(guī)?？s減、遺傳結(jié)構(gòu)失衡的問題。而商品豬活體引種也有疾病傳播、病原體擴(kuò)散的風(fēng)險。為減少豬只的流動性，降低疾病傳播風(fēng)險，杜（D) ×長（L) ×大（Y) 三元雜交繁育體系中大量祖代豬場（G) 已開始自繁大白母豬，父母代豬場則使用輪回雜交自繁父母代母豬。對于這些豬場而言，由頂級的國家核心育種豬場購買生物安全且育種值高的優(yōu)秀公豬精液，是保障其自繁大白母豬和父母代母豬質(zhì)量的有效途徑。因此，凍精的有效應(yīng)用與推廣，對于恢復(fù)地方品種遺傳多樣性和我國豬繁育體系的生物安全等具有重要意義。

混合輸精技術(shù)即將數(shù)頭公畜的精液混合后用于人工授精，已有研究表明混合輸精可以提高母羊受胎率、產(chǎn)羔率及雙羔率[10]，并提高雞的受精率[11]和桑蠶的體質(zhì)和產(chǎn)量[12]。為探尋豬凍精應(yīng)用的思路，筆者提出“凍精+鮮精”混合授精的新模式通過用鮮精彌補(bǔ)凍精在母豬受胎率和產(chǎn)仔數(shù)減少的不足。然而混精模式在種豬上的應(yīng)用尚未見報道，本研究以大白豬作為試驗對象，探討了“長白鮮精+大白凍精”混精對母豬繁殖性能的影響，并對這一模式的推廣應(yīng)用做了討論。

1 材料與方法

1.1 試驗?zāi)肛i

在史記生物綏化種豬場選擇50 頭體況相近、健康無病、胎次為3～4 胎、三代內(nèi)系譜無重復(fù)的大白母豬。為便于配種和妊娠管理，根據(jù)上一胎分娩時間將母豬分為相對一致的5 個亞群（每個亞群10 頭，編號為A～E)。試驗時間為2023年3 月25 日至2023 年7 月23 日。

1.2 混精比例

在史記生物綏化種公豬站購入10 頭4℃低溫保存的長白公豬的鮮精和10 頭大白公豬的凍精（2021 年8 月生產(chǎn))。不同個體的鮮精和凍精兩兩隨機(jī)組成10 個組合為1 組，共5 組重復(fù)。5 組分別按照長白鮮精與大白凍精有效精子數(shù)（直線前進(jìn)的精子數(shù)) 比例1∶0、1∶1、1∶2、2∶1、0∶1 等5 個比例混合，即T1∶0、T2∶1、T1∶1、T1∶2、T0∶1。每個母豬亞群隨機(jī)采用一種混精配種，配種方案如表1 所示。

表1 鮮精與凍精混合配種方案

1.3 混精制備及配種

將凍精稀釋劑和鮮精稀釋劑提前加熱到37℃?zhèn)溆?，將凍精?xì)管置于50℃水浴鍋解凍12 秒后與凍精稀釋劑按1∶20 的比例混勻稀釋，將鮮精水浴到37℃后與鮮精稀釋劑按1∶1 的比例混勻稀釋，并通過計算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)檢測凍精和鮮精的前進(jìn)活力（直線前進(jìn)的精子比率)。經(jīng)檢測，凍精的前進(jìn)活力為65.27%～70.59%，鮮精的前進(jìn)活力為76.33%～84.91%。按相應(yīng)有效精子數(shù)配比將凍精和鮮精混合，每頭母豬每次輸精量為8 億。母豬發(fā)情當(dāng)天每頭母豬制備2 份混精，取出其中一份進(jìn)行輸精，剩下的一份17℃保存，間隔12h 再輸一次。為了避免發(fā)情鑒定和輸精操作對實驗結(jié)果的影響，參與試驗的母豬均由同一配種員完成上述操作。

1.4 繁殖性狀表型采集

母豬分娩后詳細(xì)記錄其妊娠期、產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)、健仔數(shù)和初生重。受胎率計算公式為：

1.5 統(tǒng)計分析

應(yīng)用R 4.1.2 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計和分析。通過Fisher 精確概率檢驗比較不同分組母豬的受胎率差異，其余繁殖性狀表型數(shù)據(jù)先使用Levene 檢驗、Shapiro-Wilk 檢驗、卡方獨(dú)立檢驗等方法分別檢驗數(shù)據(jù)的正態(tài)性、方差齊性和獨(dú)立性，滿足正態(tài)分布、方差齊性、獨(dú)立性條件的數(shù)據(jù)利用單因素方差分析統(tǒng)計組別差異，不滿足條件的用Kruskal-Wallis 檢驗分析統(tǒng)計組別差異，統(tǒng)計結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P <0.01 表示差異極顯著，P<0.05 表示差異顯著，P >0.05 表示差異不顯著。單因素方差分析模型表示為：

式（2) 中：yij表示某頭母豬的繁殖性狀觀測值，μ 為所有觀測值均值，ai表示第i 種混精比例對繁殖性狀的影響；εij代表隨機(jī)誤差。Kruskal-Wallis 檢驗的分析模型為：

式（3) 中：H 是Kruskal-Wallis 統(tǒng)計量，N是總體樣本數(shù)。k 是組的數(shù)量。Ri2是第i 組的秩和。ni是第i 組的樣本數(shù)。

2 結(jié)果

數(shù)據(jù)分析表明，總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)滿足正態(tài)性、獨(dú)立性和方差齊性分布條件（表2)，采用方差分析統(tǒng)計組別差異。窩重和妊娠期數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)性分布條件，采用Kruskal-Wallis 檢驗統(tǒng)計組別差異。

表2 母豬繁殖性能統(tǒng)計檢驗

由表3 可知，T1:0組仔豬窩重和個體初生重最低；T1:1組總產(chǎn)仔數(shù)最少、母豬妊娠期最長；T1:2組仔豬窩重和個體初生重最大，而且母豬妊娠期最短；T2:1組受胎率最低，產(chǎn)活仔數(shù)最少；T0:1組母豬受胎率最高，總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)最多。但不同混精比例分組母豬的妊娠期、受胎率、總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)、仔豬初生窩重、仔豬個體初生重均無顯著影響（P＞0.05)。

表3 不同混精比例母豬繁殖性能描述性統(tǒng)計

3 討論

3.1 “凍精+鮮精”混精的應(yīng)用效果

本試驗研究結(jié)果表明，“凍精+鮮精”混精的新授精模式對大白母豬繁殖性能無顯著影響。但混合使用鮮+凍精的母豬（T1:1、T1:2、T2:1) 產(chǎn)仔窩重、仔豬初生重均高于只配鮮精的母豬（T1:0)，說明混精有提高母豬繁殖性能的潛力。而且當(dāng)混精比例為2∶1（T2:1) 時，母豬的窩重和仔豬初生重最大，但可能由于樣本量較小，未能得到統(tǒng)計學(xué)差異。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)只配鮮精（T1:0)和只配凍精（T0:1) 的大白母豬6 項繁殖性能指標(biāo)均無顯著差異，且凍精組這6 項指標(biāo)均高于鮮精組，這與前人研究認(rèn)為凍精會降低母豬繁殖效率的結(jié)論不一致[5-8]。這可能是凍精技術(shù)和人工授精技術(shù)的進(jìn)步和成熟提升了凍精的保護(hù)效果。周開峰等[13]發(fā)現(xiàn)，不同廠家采用凍精配種后窩均總仔數(shù)和窩均健仔數(shù)有顯著差異，且試驗結(jié)果主要影響因素為凍精質(zhì)量（冷凍保存技術(shù))。鄧雙義等[14]通過采取子宮內(nèi)深部輸精技術(shù)，冷凍精液配種母豬情期受胎率、分娩率和健仔數(shù)與鮮精配種相比差異不顯著，而凍精與配母豬產(chǎn)仔初生重顯著高于鮮精配種母豬。這說明隨著技術(shù)的進(jìn)步，凍精與鮮精的繁殖成績差距已經(jīng)逐漸縮小，有著光明的應(yīng)用前景。

凍精與鮮精混合使用在大白母豬繁殖中呈現(xiàn)出潛在的優(yōu)勢。本研究將大白凍精與長白鮮精混合輸精，旨在用鮮精彌補(bǔ)凍精對母豬繁殖性能上的不足，并同時生產(chǎn)純繁和雜交后代，實現(xiàn)純繁保種和雜交生產(chǎn)兼顧的目標(biāo)，優(yōu)化管理模式。然而，不同品種的精液品質(zhì)有差異[15,16]，本研究中不同品種公豬精液是否對母豬繁殖性能產(chǎn)生影響，這需要在未來的研究中進(jìn)一步加以探討和確認(rèn)。同時，混合使用鮮精和凍精輸精的效果尚需進(jìn)一步研究，特別是在大樣本數(shù)量下進(jìn)行更詳盡的分析，以確定最佳混合比例。

3.2 關(guān)于“凍精+鮮精”混精在保種中的應(yīng)用

當(dāng)前地方豬的保種的主要管理模式是種公豬活體保種，每年每頭公豬純繁配種3～5 次，兩年左右淘汰；母豬一般在4～5 胎進(jìn)行純繁保種，其他胎次主要用于雜交生產(chǎn)。因此，在ASF 疫情下，一旦1 頭公豬感染ASF 將有可能喪失一個家系，而1 頭母豬如果在純繁之前沒有留種，也會造成沒有后代，導(dǎo)致家系性狀丟失的后果。整體而言，當(dāng)前的保種管理模式，對于應(yīng)對ASF 的能力非常脆弱?！皟鼍?鮮精”混精的新授精模式的推廣，有助于通過優(yōu)化公豬和母豬的管理模式，來提高生物安全和遺傳多樣性降低的速度。具體而言，凍精+鮮精”混精的應(yīng)用場景如下：

一是公豬管理模式優(yōu)化。對公豬管理模式的改進(jìn)是種公豬性成熟后均進(jìn)行采精，并進(jìn)行冷凍貯存，冷凍精液間隔一定時期通過人工授精的方式使用。此方案的優(yōu)點(diǎn)是：冷凍精液可以長期保存，相對活體保種更為安全；冷凍精液可使用的公豬個體大大增加，因此血緣豐富，有助于提高群體有效含量；有助于延長世代間隔，降低近交導(dǎo)致的遺傳多樣性降低的速度。

二是母豬管理模式優(yōu)化。母豬管理模式的改變是對母豬每胎通過混精（純種凍精+引進(jìn)品種鮮精) 新授精模式同時生產(chǎn)純繁和雜交后代，實現(xiàn)純繁保種和雜交生產(chǎn)兼顧的目標(biāo)。通過此管理模式的優(yōu)化，可以使得每頭母豬每個胎次都有一定數(shù)量的純種后代個體，即便是母豬感染ASF 導(dǎo)致淘汰，也有后代進(jìn)行替換，使得家系不易丟失，增強(qiáng)抵御疫病風(fēng)險的生物安全能力。值得指出的是，通過適當(dāng)選擇與地方品種凍精混合的鮮精，可以做到后代自別純種、雜種的目的。圖1是我們做的另外一個實驗的結(jié)果。除了毛色可用之外，一般而言純種、雜種在體型上也有區(qū)別。

4 關(guān)于“凍精+鮮精”混精在引進(jìn)品種遺傳改良中的應(yīng)用

非洲豬瘟的暴發(fā)改變了引進(jìn)品種的遺傳改良模式：一是大量祖代豬場自繁大白母豬；二是大量父母代豬場采用輪回雜交自繁父母代母豬。因為祖代、父母代母豬的育種值相對較低，用其繁殖其后代的生產(chǎn)性能無法持續(xù)得以改良。如果凍精較鮮精在繁殖效率無差異，那么可以通過從國家級核心育種豬場購買最優(yōu)秀的種公豬凍精予以彌補(bǔ)。如果有差異，則可采用本文提出的混精模式，即一方面由國家級核心育種豬場將最優(yōu)秀的種公豬精液通過精液冷凍以擴(kuò)大利用的時間和范圍，另一方面祖代豬場可從國家核心育種場購買最優(yōu)秀大白種公豬的冷凍精液與本場的長白豬鮮精混精，父母代豬場可購買長白豬或大白豬冷凍精液與本場杜洛克豬鮮精混精，從而確保后代生產(chǎn)性能源源不斷得到提高。一個潛在問題可能是，在祖代母豬的后代中如何區(qū)分純種大白和長大二元雜種，在父母代母豬的后代中如何準(zhǔn)確區(qū)分二元輪回雜種和三元輪回商品豬。對此可以嘗試根據(jù)體型外貌，但更準(zhǔn)確的方法可能是利用基因檢測。

5 結(jié)論

本研究提出“凍精+鮮精”混精使用的授精模式，通過對不同混精比例母豬的產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)、健仔數(shù)和初生重、受胎率、妊娠期等6 項繁殖性能的分析發(fā)現(xiàn)，“凍精+鮮精”混精的新授精模式不會顯著影響大白母豬的繁殖性能，并在大白母豬繁殖中呈現(xiàn)出潛在的優(yōu)勢。本研究還深入探討了“凍精+鮮精”混精模式在大白母豬繁殖中的應(yīng)用，為地方豬的保種和引進(jìn)品種遺傳改良提供了新的思路和方法。