楊 毅,黃麗娜,王 博,李 斌,蔣希成

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040)

缺血性腦卒中(ischemic stroke,IS)是因腦內(nèi)動(dòng)脈閉塞,腦組織血液與氧氣供應(yīng)障礙而出現(xiàn)猝然昏仆、半身不遂、言語(yǔ)謇澀、偏身麻木等病理癥狀的疾病[1],其發(fā)病率、復(fù)發(fā)率、病死率和致殘率近年來(lái)持續(xù)處于較高水平,已成為我國(guó)成年人致殘、致死的首位病因[2],給社會(huì)與家庭造成了沉重負(fù)擔(dān)。目前西藥治療IS的主要機(jī)制是改善病變處血液循環(huán),調(diào)控血壓、血脂等[3],但服藥時(shí)間較長(zhǎng),可能會(huì)出現(xiàn)耐藥性及肝腎損傷、橫紋肌溶解等不良反應(yīng),具有潛在的治療風(fēng)險(xiǎn)。利用中醫(yī)藥治療IS可發(fā)揮其安全、有效、穩(wěn)定的優(yōu)勢(shì)。中醫(yī)藥對(duì)IS的研究歷史悠久,根據(jù)其證候演變規(guī)律總結(jié)病變核心是“氣虛血瘀”,其中“氣虛”為發(fā)病之本,“血瘀”是發(fā)展之要[4]。黃芪和丹參是中醫(yī)臨床益氣活血使用頻率較高的重要藥對(duì),黃芪益氣補(bǔ)虛,為“補(bǔ)氣之最”,丹參“補(bǔ)新血,調(diào)經(jīng)脈”,為調(diào)血首藥[5]。臨床研究證實(shí)黃芪-丹參合用治療急性腦梗死患者能夠恢復(fù)神經(jīng)功能且改善預(yù)后[6]。然而黃芪-丹參治療IS的分子機(jī)制尚未明確。本研究以中醫(yī)藥整合藥理學(xué)平臺(tái)(TCMIP)v 2.0和GEO數(shù)據(jù)庫(kù)為靶點(diǎn)信息挖掘?qū)ο?建立黃芪-丹參治療IS靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)、成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò),拓?fù)鋽?shù)據(jù)分析獲得關(guān)鍵成分及核心靶點(diǎn),并通過(guò)計(jì)算二者的結(jié)合能以驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果,從而闡釋黃芪-丹參治療IS的分子機(jī)制,為中醫(yī)藥的治療作用提供證據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1活性成分及靶標(biāo)的篩選 TCMIP v2.0(http:www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/Login/login.html)平臺(tái)是以定量評(píng)估類藥性(quantitative estimate of drug-likeness,QED)值評(píng)估各藥物成分的相似性,將Tanimoto系數(shù)下的相似度算法與FDA上市藥物的相似性評(píng)分賦值于成分靶點(diǎn)。平臺(tái)以0.49≤QED≤1即強(qiáng)與中等類藥性成分作為藥物的活性成分,以0.8≤相似性評(píng)分≤1作為活性成分的潛在作用靶點(diǎn)。在平臺(tái)中分別輸入“黃芪”和“丹參”,檢索并收集二者的活性成分及藥物靶點(diǎn)信息。

1.2IS芯片選取及差異基因篩選 以“ischemic stroke”為關(guān)鍵詞在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)中檢索,選取到以“Homo sapiens”為物種、以“DataSet”為條目類型的基因表達(dá)譜GSE22255。通過(guò)GEO2R進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,以P.Value<0.05且|lgFC|≥0.5為篩選標(biāo)準(zhǔn),選取IS的顯著性差異表達(dá)基因。

1.3關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選與PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將黃芪-丹參的藥物靶點(diǎn)和IS的疾病靶點(diǎn)取交集后錄入STRING(https://cn.string-db.org)網(wǎng)站在線分析,物種選項(xiàng)設(shè)置為“Homo sapiens”,互作閾值(confidence score)≥0.4,構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.4網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與核心成分、靶點(diǎn)篩選 PPI及成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)通過(guò)Cytoscape(version 3.9.0)軟件進(jìn)行可視化展示,并通過(guò)Network Analyzer功能分析網(wǎng)絡(luò)性質(zhì),篩選黃芪-丹參的關(guān)鍵成分。MCODE和cytoHubba插件篩選核心靶點(diǎn),在MCODE插件中設(shè)置degree cutoff=2,node score cutoff=0.2,k-score=2,max.depth=100,以score值最高模塊的seed靶點(diǎn)定義為潛在核心靶點(diǎn)。在Cytohubba插件中分別以MCC、MNC、Radaility、EPC、Degree、Closeness為算法分別得到與IS發(fā)生相關(guān)的TOP 10靶點(diǎn),取6種算法的交集為潛在核心靶點(diǎn)。2種插件得到的結(jié)果取并集為作為核心靶點(diǎn)。

1.5分子對(duì)接 在PubChem(http://pubchem.ncbi.nlm.gov)和RCSB PDB(http://www.rcsb.org)數(shù)據(jù)庫(kù)中下載關(guān)鍵成分和核心靶點(diǎn)的結(jié)構(gòu)文件,并分別轉(zhuǎn)換為sdf和pdb格式。應(yīng)用AutoDock4.2軟件計(jì)算關(guān)鍵成分與核心靶點(diǎn)的對(duì)節(jié)能值,驗(yàn)證二者之間的對(duì)接情況。

1.6GO與KEGG富集分析 使用R語(yǔ)言程序和Bioconductor數(shù)據(jù)庫(kù)中的“org. Hs. eg. db”人類數(shù)據(jù)庫(kù)和“clusterProfiler”“DOSE”“stringi”“enrichplot”“ggplot2”等包對(duì)黃芪-丹參治療IS的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體論(GO)和京都基因和基因組百科全書(shū)(KEGG)富集分析。

2 結(jié) 果

2.1活性成分及靶點(diǎn)篩選 在TCMIP數(shù)據(jù)庫(kù)中共檢索到111種黃芪和丹參的有效成分,基于以上成分共得到靶點(diǎn)374個(gè)。

2.2差異基因篩選 在GSE22255基因譜中共篩選差異基因1 210個(gè),其中表達(dá)上調(diào)基因934個(gè),表達(dá)下調(diào)基因276個(gè)。前40位IS相關(guān)差異基因的聚類熱圖和火山圖見(jiàn)圖1。

圖1 前40位缺血性腦卒中相關(guān)差異基因表達(dá)分析圖

2.3PPI網(wǎng)絡(luò)分析及靶點(diǎn)篩選 黃芪-丹參的藥物靶點(diǎn)和IS的疾病靶點(diǎn)中共有26個(gè)交集靶點(diǎn)?；赟TRING網(wǎng)站對(duì)黃芪-丹參治療IS的26個(gè)交集靶點(diǎn)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),含有20個(gè)節(jié)點(diǎn)和92條邊,平均連接度為4.60,見(jiàn)圖2。通過(guò)MCODE及cytoHubba插件篩選出SYK、IL1B、CASP3、ACOX1、HMGCR、TNF、ACTB共7個(gè)核心靶點(diǎn),見(jiàn)圖3及圖4。

圖2 黃芪-丹參治療缺血性腦卒中的PPI網(wǎng)絡(luò)

A. score=6.571,seed=TNF;B. Score=4.000,seed=HMCGR;C. Score=3.000,Seed=MTHFR

2.4成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 黃芪-丹參治療IS的成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖見(jiàn)圖5,其中含49個(gè)結(jié)點(diǎn),69條邊,結(jié)點(diǎn)中含中藥結(jié)點(diǎn)2個(gè),成分結(jié)點(diǎn)21個(gè),靶點(diǎn)結(jié)點(diǎn)26個(gè),平均連接度2.816。根據(jù)拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)篩選到6個(gè)關(guān)鍵成分,見(jiàn)表1。關(guān)鍵成分包括黃芩苷、棕櫚酸、華良姜素、黃芪甲苷、4-羥基香豆素、胡蘿卜苷。

表1 黃芪-丹參治療缺血性腦卒中關(guān)鍵成分

圖5 黃芪-丹參治療缺血性腦卒中成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.5分子對(duì)接結(jié)果 將黃芩苷、胡蘿卜苷、華良姜素、棕櫚酸、黃芪甲苷、4羥基香豆素6個(gè)關(guān)鍵成分和7個(gè)核心靶點(diǎn)蛋白SYK、IL1B、CASP3、AXOX1、HMGCR、TNF、ACTB進(jìn)行分子對(duì)接。以結(jié)合能(binding energy)<0 kcal/mol認(rèn)為分子蛋白質(zhì)自發(fā)結(jié)合并相互作用,當(dāng)結(jié)合能越低時(shí)表明分子構(gòu)象越穩(wěn)定,圖6展示了結(jié)合能值熱圖。選取結(jié)合能≤-5 kcal/mol為黃芪-丹參治療IS的關(guān)鍵成分篩選依據(jù),并通過(guò)PyMOL軟件將關(guān)鍵成分與核心靶點(diǎn)的結(jié)合進(jìn)行3D展示,見(jiàn)圖7。

圖6 分子對(duì)接結(jié)合能力熱圖

SYK-Daucosterol(binding energy=-7.42 kcal/mol);SYK-Kumatakenin(binding energy=-6.15 kcal/mol);TNF-4-Hydroxycoumarin(binding energy=-6.06 kcal/mol);IL1B-Daucosterol(binding energy=-5.91 kcal/mol);TNF-Daucosterol(binding energy=-5.29 kcal/mol)

2.6GO和KEGG富集分析結(jié)果 以2.3結(jié)果中的26個(gè)交集靶點(diǎn)為分析對(duì)象,以p.value<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行GO富集分析,見(jiàn)圖8。黃芪-丹參藥對(duì)治療IS的生物過(guò)程(BP)條目的主要涉及脂質(zhì)定位、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性調(diào)節(jié)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、急性炎癥反應(yīng)正向調(diào)控、脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)等。分子功能(MF)條目主要涉及花生酮輔酶A連接酶活性、長(zhǎng)鏈脂肪酸輔酶A連接酶活性、磷脂酶激活劑活性、脂肪酶激活劑活性等。細(xì)胞組成(CC)主要有過(guò)氧化物酶體膜、微體膜、過(guò)氧化物酶體、微體。為核心靶點(diǎn)參與的相關(guān)信號(hào)通路,以p.value<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行KEGG通路分析,見(jiàn)圖9。篩選出的通路主要包括:抗葉酸劑、一碳單位池、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路等。

圖8 核心靶點(diǎn)的GO功能富集分析

圖9 核心靶點(diǎn)KEGG通路富集分析

3 討 論

黃芪-丹參是臨床常用的中藥材,是以其補(bǔ)氣活血之功治療氣虛血瘀證的典型藥對(duì)。本研究通過(guò)中醫(yī)藥整合藥理學(xué)平臺(tái)(TCMIP v2.0)、GEO數(shù)據(jù)庫(kù)及分子對(duì)接技術(shù)建立中藥、疾病與作用通路的網(wǎng)絡(luò)模型,探討黃芪-丹參治療IS的潛在分子機(jī)制。

通過(guò)黃芪-丹參治療IS的PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)分析,得到SYK、IL1B、CASP3、ACOX1、HMGCR、TNF、ACTB共7個(gè)重要靶點(diǎn)蛋白。SYK信號(hào)通路參與ROS的產(chǎn)生[7],導(dǎo)致促炎基因TNF-α、COX-2和iNOS的表達(dá)[8]。研究發(fā)現(xiàn)SYK在IS后的病變組織及氧糖剝奪/復(fù)氧小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)升高[9],而經(jīng)過(guò)SYK抑制劑治療后,IS模型鼠的神經(jīng)功能評(píng)分和病灶面積均有改善[10],細(xì)胞中的炎性因子TNF-α和氧化應(yīng)激因子iNOS表達(dá)顯著下降[9]。IL-1β能夠損傷神經(jīng)細(xì)胞的完整性,其機(jī)制是誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞或單核細(xì)胞浸潤(rùn)受損的神經(jīng)元細(xì)胞,并提高自由基水平進(jìn)而發(fā)生氧化應(yīng)激障礙[11]。在腦缺血狀態(tài)下Caspase-3可放大蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng),Caspase蛋白的激活與過(guò)表達(dá)可直接誘導(dǎo)凋亡過(guò)程[12-13]。TNF-α是主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的早期促炎因子[14]。TNF-α通過(guò)激活免疫系統(tǒng),使IS病灶組織中的白細(xì)胞數(shù)量增多,進(jìn)而導(dǎo)致局部炎癥加重,內(nèi)皮細(xì)胞凋亡以及腦梗死體積增加[15]。ACTB編碼神經(jīng)細(xì)胞骨架蛋白,對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育及功能發(fā)揮重要作用[16]。此外,ACTB影響血管發(fā)育及血栓形成,其基因的多態(tài)性參與IS的發(fā)病過(guò)程[17]。ACOX1能夠調(diào)節(jié)脂肪酸-β氧化過(guò)程,促進(jìn)脂肪酸代謝[18],而脂質(zhì)對(duì)于神經(jīng)元的發(fā)育、突觸的可塑性和功能至關(guān)重要[19],是維持神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和軸突正常生理功能的必需成分[20],缺失后會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)功能快速衰退[21]。膽固醇代謝障礙導(dǎo)致的動(dòng)脈粥樣硬化是IS發(fā)病最常見(jiàn)誘因[22],由于膽固醇在人體內(nèi)的合成速率受HMGCR的調(diào)控,故HMGCR也影響IS的發(fā)生。

黃芪-丹參治療IS的關(guān)鍵成分包括黃芩苷、胡蘿卜苷、華良姜素、棕櫚酸、黃芪甲苷、4羥基香豆素。黃芩苷屬于黃酮苷類化合物,側(cè)重保護(hù)IS的神經(jīng)元細(xì)胞,發(fā)揮抗凋亡、抗炎、抗氧化應(yīng)激等作用[23]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)黃芩苷可改善腦缺血再灌注損傷模型大鼠腦水腫程度,可能與通過(guò)抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹并抑制TRPV4和AQP4的通道開(kāi)放有關(guān)[24]。棕櫚酸是人體重要的飽和脂肪酸,可誘導(dǎo)炎癥基因表達(dá)引起內(nèi)皮細(xì)胞胰島素抵抗及eNOS脫偶聯(lián),降低NO合成和釋放[25],促使動(dòng)脈粥樣硬化,是內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂的重要因素[26],也是誘發(fā)IS的潛在病因。黃芪甲苷是治療IS的重要活性成分[27],它不但可以促進(jìn)血管生成從而改善腦血流量,又能作用于病變組織以抑制細(xì)胞凋亡與炎癥反應(yīng)等功能改善神經(jīng)功能損傷[28]。胡蘿卜苷是在植物中廣泛存在的甾醇糖苷[29],具有抗炎[30]、抗氧化作用[31],為IS患者的神經(jīng)保護(hù)提供了保障。同時(shí),胡蘿卜苷的降血糖作用也間接降低了IS的發(fā)生[32]。

核心基因GO功能富集分析的生物學(xué)過(guò)程條目中,P-value最小值為脂質(zhì)定位。脂質(zhì)的種類繁多,功能多樣,能夠儲(chǔ)存能量、傳遞細(xì)胞信號(hào)及構(gòu)成生物膜骨架等。過(guò)多的脂肪堆積于內(nèi)臟可改變體內(nèi)脂肪因子譜,提高血漿黏度,進(jìn)而導(dǎo)致血液流變學(xué)異常,血管鈣化,促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化形成[33]。過(guò)多的內(nèi)臟脂肪也能夠破壞人體信號(hào)系統(tǒng),使其錯(cuò)誤傳遞,導(dǎo)致糖脂代謝紊亂,增加了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生概率[34]。脂質(zhì)參與大腦對(duì)生命活動(dòng)的精準(zhǔn)調(diào)控[34],如三磷酸肌醇[35]、二酰基甘油[36]等第二信使分子均參與了信號(hào)通路傳導(dǎo),并參與能量供應(yīng),對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有重要調(diào)節(jié)作用。腦卒中發(fā)生后,腦組織迅速?gòu)募?xì)胞膜上大量釋放PUFAs,產(chǎn)生多種脂質(zhì)介質(zhì),如二十烷類化合物等。這些介質(zhì)對(duì)中風(fēng)后的腦組織具有神經(jīng)保護(hù)作用,因此對(duì)于中風(fēng)的預(yù)后及康復(fù)具有重要作用。脂質(zhì)與腦的病理變化也關(guān)系密切,如急性腦損傷及其繼發(fā)的炎癥反應(yīng)通常伴隨氧化磷脂與氧化游離脂肪酸的升高[37]。脂質(zhì)在大腦內(nèi)所涵蓋的種類多樣、比例各異,并廣泛參與IS的病理進(jìn)程[38],對(duì)IS的發(fā)生及發(fā)展具有重要意義。

核心靶點(diǎn)KEGG通路富集分析結(jié)果顯示,P-value最小值為葉酸拮抗劑抵抗。葉酸在體內(nèi)經(jīng)酶作用轉(zhuǎn)化為5-甲基四氫葉酸(5-MTHF),后經(jīng)脫甲基形成四氫葉酸(THF),THF與多種一碳單位結(jié)合參與人體代謝。若一碳單位減少則致使5-MTHF和同型半胱氨酸(Hcy)再次甲基化的減少,最終導(dǎo)致Hcy在體內(nèi)堆積[39]。血漿高濃度Hcy是IS發(fā)生的重要誘因[40],機(jī)制是血漿中的Hcy經(jīng)自氧化反應(yīng)后生成同型半胱氨酸二硫化物、硫化脂及大量氧自由基,損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞,影響血管內(nèi)皮功能,進(jìn)而發(fā)生腦血管疾病[41]。同時(shí),血管內(nèi)皮細(xì)胞在長(zhǎng)時(shí)間接觸高濃度Hcy后其自身功能發(fā)生失調(diào),血栓調(diào)控因子生成受阻,凝血因子大量生成導(dǎo)致血栓[42],是誘發(fā)IS的潛在因素。

分子對(duì)接能值表明黃芪-丹參的關(guān)鍵成分黃芩苷、胡蘿卜苷、華良姜素、棕櫚酸、黃芪甲苷、4羥基香豆素和核心靶點(diǎn)蛋白SYK、IL1B、CASP3、AXOX1、HMGCR、TNF、ACTB均能自發(fā)結(jié)合,其中胡蘿卜苷與SYK、IL1B、TNF,華良姜素與SYK、4羥基香豆素與TNF具有較好的結(jié)合活性?；谏鲜鲅芯繕?gòu)建黃芪-丹參治療IS的中藥-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò),通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理分析及分子對(duì)接驗(yàn)證,從分子層面闡述了黃芪-丹參對(duì)IS的治療機(jī)制。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討黃芪-丹參治療IS的作用機(jī)制,通過(guò)構(gòu)建靶點(diǎn)、成分和通路的關(guān)系網(wǎng)絡(luò),證實(shí)黃芪-丹參中多種活性成分包含的多個(gè)靶點(diǎn)蛋白,能夠調(diào)控葉酸代謝、脂肪代謝、炎癥反應(yīng)等信號(hào)通路,即以多成分、多靶點(diǎn)、多通路、多機(jī)制發(fā)揮對(duì)IS的治療作用。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。