張冬梅，王麗杰，潘悅

錦州醫(yī)科大學(xué)食品與健康學(xué)院 （錦州121001）

黑枸杞是我國西部沙漠地帶特有的一種植物黑枸杞，主要產(chǎn)自我國的青海省、甘肅省以及西藏等地區(qū)，也是目前已知的花青素最多的野生植物[1]?；ㄇ嗨兀址Q花色素，是一種可溶于水的天然色素，在植物體內(nèi)廣泛分布。研究表明，較高的花青素?cái)z入量與較低的癌癥風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[2]?；谄鋵】档囊嫣?，花青素作為膳食抗氧化劑和營養(yǎng)保健品具有潛在的益處[3]。

花青素會受到光、熱、酸和堿的負(fù)面影響。因此，為了在不降解的情況下獲得最大量的花青素和其他生物活性分子，選擇一種對花青素?fù)p傷最小的提取方法至關(guān)重要[4]，而且，雖然黑枸杞中花青素的含量很高，但是產(chǎn)量較低，這給它的使用和試驗(yàn)帶來了一些不便。從植物中提取花青素的方法有溶劑萃取、酶萃取、超臨界二氧化碳萃取、超聲波、微波等[5]。酶促法是一種高效、條件溫和、環(huán)境友好的提取方法，其利用酶反應(yīng)的高度專一性將植物細(xì)胞壁降解，從而可以獲取其內(nèi)容物。Laophongphit等[6]的研究表明果膠酶和熱處理顯著提高了Mahachanok芒果果肉的酚類含量，而且對類胡蘿卜素含量和抗氧化能力沒有影響。超聲輔助提取法是目前常用提取方法之一，該法利用高頻率超聲波在振蕩過程中產(chǎn)生空化作用使植物細(xì)胞壁受損，從而加速有效成分溶出[7]。陳俊樸等[8]采用超聲輔助提取紫大薯原花青素，最佳工藝為超聲時間19 min、液料比1∶22（g/mL）、鹽酸體積分?jǐn)?shù)0.63%，花青素的提取量為93.62 mg/100 g，提取量顯著高于未超聲前。

提取是從植物原料中回收有效成分的關(guān)鍵步驟[9]。需要一種有效的提取方法，以獲得高濃度目標(biāo)化合物的最大收率。文章采用響應(yīng)面方法優(yōu)化了酶-超聲波提取黑枸杞花青素的最佳工藝條件，為進(jìn)一步開發(fā)利用黑枸杞奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑枸杞（市售，產(chǎn)地青海）；果膠酶（酶活性≥ 30 000 U/g，滄州夏盛酶生物技術(shù)有限公司）；乙醇（國藥化學(xué)試劑有限公司）；鹽酸（青島福通化工有限公司）；氯化鉀、乙酸鈉、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、抗壞血酸（興恒泰化工科技有限公司）；冰乙酸（上海艾瑞化工有限公司）；過硫酸鉀（百運(yùn)度生物科技有限公司）；2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：北京盒子生工科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DH-945型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（蘇州格瑞達(dá)有限公司）；ZN粉碎機(jī)（螞蟻源科技有限公司）；85-A型恒溫磁力攪拌器（上海梅穎浦有限公司）；DK-1型電熱恒溫水浴鍋（天津奧特塞恩儀器有限公司）；TL-5A型臺式電動離心機(jī)（廣州吉迪儀器有限公司）；GT-P9型超聲波清洗機(jī)（徐州永泰有限公司）；PHS-25臺式酸度計(jì)（上?；艉嘤邢薰荆籙V-B型紫外分光光度計(jì)（上海奧析有限公司）；LCFA104型分析天平（上海天平儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

黑枸杞去蒂→45 ℃干燥至恒重，磨碎→過0.250 mm篩網(wǎng)，置于-4 ℃，避光處貯存，待用

1.3.2 黑枸杞花青素提取

準(zhǔn)確稱取0.5 g黑枸杞粉，加入經(jīng)過酸化的70%乙醇溶液（pH 1）及一定量的果膠酶[10]。將混合物于40 ℃使用恒溫磁力攪拌器攪拌10 min[11]。在一定超聲功率下提取一段時間后于離心機(jī)中按10 000 r/min離心35 min，收集上清液。將提取液取0.25 mL，用緩沖液定容到25 mL，用pH差示法測定黑枸杞花青素的含量。

1.3.3 花青素含量的計(jì)算

花青素含量（mg/g）按式（1）計(jì)算。

式中：A=（A527-A700）pH1.0-（A527-A700）pH4.5；Mr為分子質(zhì)量（以C3G摩爾質(zhì)量計(jì)算），449.2 g/mol；Df為稀釋倍數(shù)；ε為C3G摩爾質(zhì)量的消光系數(shù)，26 900 L/（mol·cm）；I為光程，1.0 cm；m為樣品質(zhì)量，mg。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

1.3.4.1 液料比值對花青素含量的影響

固定超聲功率150 W、超聲時間15 min、酶用量0.4%，液料比值分別為2.5，5，7.5，10和12.5 mL/g，考察液料比值對花青素含量的影響。每個水平均做3個平行。

1.3.4.2 超聲功率對花青素含量的影響

固定液料比值5 mL/g、超聲時間15 min、酶用量0.4%，超聲功率分別為100，150，200，250和300 W，考察超聲功率對花青素含量的影響。每個水平均做3個平行。

1.3.4.3 超聲時間對花青素含量的影響

固定液料比值5 mL/g、超聲功率150 W、酶用量0.4%，超聲時間分別為10，15，20，25和30 min，考察超聲時間對花青素含量的影響。每個水平均做3個平行。

1.3.4.4 酶用量對花青素含量的影響

固定液料比值5 mL/g、超聲功率150 W、超聲時間15 min，酶用量分別為0.1%，0.2%，0.3%，0.4%和0.5%，考察酶用量對花青素含量的影響。每個水平均做3個平行。

1.3.5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定各因素的最佳水平范圍。以液料比值（A）、超聲功率（B）、超聲時間（C）、酶用量（D）為自變量，以花青素含量為響應(yīng)值，其響應(yīng)面因素試驗(yàn)水平見表1，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面因素試驗(yàn)水平

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果

1.3.6 花青素抗氧化活性分析

1.3.6.1 DPPH自由基清除率的測定

將花青素分別配成質(zhì)量濃度為0.05，0.1，0.15，0.2，0.25和0.3 mg/mL的花青素溶液。用2.0 mL不同濃度的花青素和VC溶液，加入2.0 mL DPPH乙醇溶液（0.2 mmol/L），放置30 min，測定DPPH自由基清除率，按式（2）計(jì)算[12]。

式中：A為樣品溶液的吸光度；A1為樣品溶液本底吸光度；A0為空白對照溶液吸光度。

1.3.6.2 ABTS自由基清除率的測定

將50 mL的ABTS溶液（2 mmol/L）與200 mL的過硫酸鉀（70 mmol/L）混合，在4 ℃下放置12 h，并用無水乙醇稀釋。取花青素浸提液和VC溶液各0.1 mL，質(zhì)量濃度分別為0.05，0.1，0.15，0.2，0.25和0.3 mg/mL，再加入1.9 mL的ABTS自由基溶液，在暗處靜置15 min，按式（3）進(jìn)行ABTS自由基清除率的計(jì)算[12]。

式中：A0為樣品本底的吸光度；A為樣品溶液在波長734 nm處測定的吸光度；A空為用無水乙醇代替樣品在波長734 nm處測定的吸光度。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

使用Design Expert 13進(jìn)行響應(yīng)面分析。使用Origin Pro 2021軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行繪制圖表[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 液料比值對黑枸杞花青素提取量的影響

如圖1所示，液料比值在2.5～5 mL/g時，黑枸杞花青素含量隨溶劑用量的增大而升高，液料比值在5～ 12.5 mL/g時，花青素含量呈緩慢下降狀態(tài)，在5 mL/g時達(dá)到最高值，為5.50 mg/g。這可能是因?yàn)槿軇┨?，花青素不能全部溶出，而在溶劑到達(dá)一定的濃度后，黑枸杞花青素就會充分溶出，繼續(xù)增加溶劑，花青素含量保持一定，考慮在實(shí)際生產(chǎn)中過大的液料比值會消耗大量溶劑[14]，所以選取液料比值2.5，5和7.5 mL/g進(jìn)行下一步的響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖1 不同液料比值對黑枸杞花青素提取量的影響

2.1.2 超聲功率對黑枸杞花青素提取量的影響

如圖2所示，超聲功率在100～200 W時，花青素含量呈上升狀態(tài)。超聲功率在200～300 W范圍內(nèi)，隨著超聲功率的不斷增加，黑枸杞花青素含量呈明顯下降狀。在200 W時，花青素含量達(dá)到最高，為5.43 mg/g，可能是由于超聲功率在100～200 W時，隨著超聲功率的增加，黑枸杞粉末的內(nèi)部結(jié)構(gòu)逐步被破壞，將花青素暴露在溶劑中[15-16]。繼續(xù)增大超聲功率會使已暴露在溶劑中的花青素進(jìn)一步破壞，導(dǎo)致花青素含量下降。所以選取超聲功率150，200和250 W進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖2 超聲功率對花青素含量的影響

2.1.3 超聲時間對黑枸杞花青素提取量的影響

如圖3所示，超聲波時間在10～25 min時，隨著超聲波處理時間的增加，黑枸杞花青素的含量逐漸提高，當(dāng)超聲波時間為25 min時，黑枸杞花青素含量達(dá)到最大，為5.82 mg/g，而后隨超聲波作用時間增加，黑枸杞花青素含量呈下降趨勢，可能是由于隨著超聲波作用時間增加，黑枸杞花青素溶出量增多，到一定時間，花青素的結(jié)構(gòu)被破壞，使其含量降低。所以，選擇超聲時間20，25和30 min進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖3 超聲時間對花青素含量的影響

2.1.4 酶用量對黑枸杞花青素提取量的影響

如圖4所示，當(dāng)酶用量在0.1%～0.3%之間時，黑枸杞花青素含量隨酶用量的增加而升高，當(dāng)酶用量在0.3%時，黑枸杞花青素含量達(dá)到最大，為5.97 mg/g，之后隨著酶用量的增大，黑枸杞花青素提取含量保持一定，可能是因?yàn)楣z酶增加時，黑枸杞中果膠被溶解，花青素被釋放出來，隨著果膠酶添加量增加，花青素已充分釋放，無法獲得更多花青素[17]。因此，選取酶用量0.2%，0.3%和0.4%進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖4 酶用量對花青素含量的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 模型建立

采用Design-Expert 13進(jìn)行了響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)，并對其進(jìn)行了分析，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

通過回歸擬合，得到了該模型的二次多項(xiàng)式：

回歸模型的方差及顯著性分析見表3。由表3可看出，此模型P＜0.000 1，達(dá)到了極顯著的水平，而失擬項(xiàng)P為0.093 1（P＞0.05），沒有顯著性，這說明此模式擬合程度較好，R2=0.981 0，表明利用所建立模型對試驗(yàn)結(jié)果的擬合精度達(dá)到98.1%，且試驗(yàn)誤差小，模型具有較高的可信度。因此，可利用所建模型對黑枸杞花青素提取含量進(jìn)行分析與預(yù)測。

表3 回歸模型的方差及顯著性分析結(jié)果

由表3還可看出：模型中一次項(xiàng)B、D，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2，交互項(xiàng)AB、BC、CD對黑枸杞花青素含量影響極顯著（P＜0.01）；交互項(xiàng)AB、BD對黑枸杞花青素含量的影響顯著（P＜0.05）；從F值的大小來看，各個因素對黑枸杞花青素提取含量的作用大小是D（酶用量）＞B（超聲功率）＞C（超聲時間）＞A（液料比值）。

2.2.2 響應(yīng)面曲線結(jié)果

各因素間交互作用的響應(yīng)面曲線結(jié)果如圖5所示，響應(yīng)面曲線的陡度可以很好地反映對花青素提取量的影響，坡度越陡，二者間的交互作用越強(qiáng)；坡度越緩，交互作用對花青素提取率的影響越小。由圖5可知，響應(yīng)曲面的陡度次序?yàn)镃D＞AB＞BC＞AD＞BD＞AC，與表3方差分析結(jié)果一致。

圖5 各因素對花青素提取量交互作用響應(yīng)曲面圖

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

利用Design Expert 13對回歸方程進(jìn)行分析可知，黑枸杞花青素最佳提取工藝條件為液料比值4.979 2 mL/g、超聲功率185.679 W、超聲時間25.508 3 min、酶用量0.333 652%。以此工藝條件為基礎(chǔ)，黑枸杞花青素含量的預(yù)測值為7.075 77 mg/g?？紤]到實(shí)際操作的可行性，將上述最佳工藝條件修正為液料比值5 mL/g、超聲功率200 W、超聲時間25 min、酶用量0.3%。進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，黑枸杞花青素含量的平均值為7.0±0.325 mg/g，與理論預(yù)測差1.07%，結(jié)果表明，利用此模型優(yōu)選出的最優(yōu)提取條件具有穩(wěn)定、可靠性，對生產(chǎn)實(shí)踐有一定的指導(dǎo)意義。

2.3 黑枸杞花青素抗氧化活性

2.3.1 清除DPPH自由基能力

如圖6所示，黑枸杞花青素和VC溶液對DPPH自由基的清除率都隨著濃度的增加而逐漸增強(qiáng)。黑枸杞花青素濃度為0.30 mg/mL時，其對DPPH自由基的清除率達(dá)到81.83%。同時從圖6可以看出黑枸杞花青素清除DPPH的能力明顯高于同濃度的VC溶液。

圖6 不同濃度的黑枸杞花青素對DPPH自由基清除率

2.3.2 清除ABTS自由基能力

如圖7所示，黑枸杞花青素及VC溶液對ABTS自由基清除作用隨著其濃度的升高呈逐步升高的趨勢。黑枸杞花青素濃度為0.30 mg/mL時，其抗ABTS自由基清除能力可達(dá)67.82%。黑枸杞花青素清除ABTS的能力整體略高于同濃度的VC溶液，且同濃度的黑枸杞花青素清除DPPH自由基能力高于清除ABTS自由基能力。

圖7 不同濃度的黑枸杞花青素對ABTS自由基清除率

3 結(jié)論

以黑枸杞為原料，利用酶促、超聲波技術(shù)提取花青素，通過單因素試驗(yàn)、響應(yīng)面法優(yōu)化得到最佳提取工藝：液料比值5 mL/g、超聲功率200 W、超聲時間25 min、酶用量0.3%。在此條件下，黑枸杞花青素含量的平均值為7.03±0.325 mg/g?？寡趸囼?yàn)結(jié)果表明黑枸杞花青素具有較強(qiáng)的抗ABTS和DPPH自由基活性。結(jié)果表明，酶促及超聲波技術(shù)提取黑枸杞花青素具有顯著協(xié)同作用，可以明顯增加花青素的提取量，縮短提取時間?；谝陨涎芯浚阼坭交ㄇ嗨鼐哂休^好的抗氧化活性，為黑枸杞花青素資源的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供一定的試驗(yàn)依據(jù)。