呂紫欣, 張?chǎng)谓? 薛少華, 金艷冬, 陳林熙, 黃喜榮, 羅國(guó)清, 蒙 寧, 陳 瑤, 戴愛(ài)玲,4

(1.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,福建 福州 350002;2.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,福建 龍巖 364012; 3.三明市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,福建 三明365001;4.福建省生豬疫病防控工程技術(shù)研究 中心/福建省家畜傳染病防治與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 龍巖 364012)

豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的重要病毒性疫病之一,臨床上主要導(dǎo)致妊娠母豬繁殖障礙以及其他階段的豬群,尤其是仔豬出現(xiàn)呼吸障礙等癥狀[1]。PRRSV屬于套式病毒目,是一種極易發(fā)生變異和重組的有囊膜的單股正鏈RNA病毒,包括至少10個(gè)開(kāi)放閱讀框(open reading frame, ORF)。其中,ORF5基因編碼的GP5蛋白是PRRSV中最易變異的結(jié)構(gòu)蛋白之一,通常作為PRRSV變異的主要依據(jù),大量研究表明ORF5基因也可作為PRRSV基因組分型的重要依據(jù)[2-4]。

分子流行病學(xué)研究顯示,我國(guó)流行的PRRSV可分為4個(gè)譜系:譜系8(JXA1-like株、CH-1a-like株)、譜系5(VR2332-like株、BJ-4-like株)、譜系3(GM2-like株、QYYZ-like株)、譜系1(NADC30-like株、NADC34-like株)[5]。近年來(lái),PRRSV在我國(guó)的流行變異情況愈加復(fù)雜[6],2006年我國(guó)暴發(fā)由HP-PRRSV株引起的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征,2012年起我國(guó)陸續(xù)出現(xiàn)與NADC30-like株同源性較高的PRRSV,如NADC31-like株、QYYZ-like株、NADC34-like株[7]。NADC30-like株自2016年已超過(guò)HP-PRRSV株成為我國(guó)當(dāng)前主要的流行毒株[8],給我國(guó)豬繁殖與呼吸綜合征的防控帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)。

為調(diào)查閩粵贛地區(qū)PRRSV的分子流行動(dòng)態(tài),本研究收集了2020—2022年閩粵贛地區(qū)1 475份發(fā)病豬組織和血清樣品,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)對(duì)樣品中的PRRSV進(jìn)行了病原檢測(cè),對(duì)陽(yáng)性樣品ORF5基因進(jìn)行了擴(kuò)增、測(cè)序、序列比對(duì)及遺傳進(jìn)化分析。本研究旨在了解閩粵贛地區(qū)PRRSV的流行趨勢(shì)和變異情況,對(duì)測(cè)序得到的62株P(guān)RRSVORF5基因開(kāi)展遺傳進(jìn)化及分子流行病學(xué)分析,為閩粵贛地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征的科學(xué)防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料樣品來(lái)源 1 475份發(fā)病豬的組織樣品(扁桃體、淋巴結(jié)、肺臟、脾臟、腎臟,n=397份)和血清樣品(n=1 078份),分別采自福建龍巖、泉州、漳州,廣東汕頭、梅州,江西贛州。樣品信息如表1所示。所有組織和血清樣品均由龍巖學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究所保存于-80 ℃。

表1 樣品來(lái)源信息Table 1 Information of sample source

1.1.2 試劑 反轉(zhuǎn)錄試劑、熒光定量PCR試劑和2×Phanta Flash Master Mix均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)文獻(xiàn)[9]的方法合成PRRSV qRT-PCR檢測(cè)引物和探針。根據(jù)NCBI上的不同基因型PRRSV全基因組序列利用Oligo7軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增ORF5基因的特異性引物(上游引物序列:5′-GCRACGTTTTAGCCTGTCTT-3′;下游引物序列:3′-TGGCGTRTAKGTRATRGARAA-5′),預(yù)期引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為750 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 組織和血清樣品中PRRSV的qRT-PCR檢測(cè)

從發(fā)病豬的扁桃體、淋巴結(jié)、肺臟、脾臟、腎臟等組織和血清樣品中分別提取病毒總RNA,采用諾唯贊反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以獲得cDNA,獲得的cDNA置于-80 ℃下保存,采用qRT-PCR檢測(cè)cDNA。反應(yīng)程序:55 ℃逆轉(zhuǎn)錄5 min;95 ℃預(yù)變性30 s;循環(huán)反應(yīng)包括95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s,共設(shè)置45個(gè)循環(huán)。

1.4 PRRSV ORF5基因的擴(kuò)增、克隆、測(cè)序

以“1.3”中獲得的循環(huán)域值(Ct)較低的PRRSV cDNA為模板,使用ORF5上下游引物對(duì)PRRSV陽(yáng)性病料進(jìn)行單項(xiàng)PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系(25 μL):12.5 μL 2×TaqMaster Mix、2 μL引物對(duì)、2 μL樣品cDNA、8.5 μL ddH2O。反應(yīng)程序:95 ℃ 5 min;循環(huán)反應(yīng)包括95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,共35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后取6.0 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),采用凝膠成像儀觀察結(jié)果。對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化,克隆于pMD19-T載體中,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞上,培養(yǎng)16～24 h后,挑取單克隆菌落經(jīng)鑒定為陽(yáng)性后送至廣州睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 PRRSV ORF5的遺傳進(jìn)化分析

應(yīng)用DNAStar軟件包中的MegAlign軟件對(duì)獲得的62條PRRSV與GenBank上已發(fā)表的2020—2022年閩粵贛地區(qū)18條PRRSV和127條PRRSV國(guó)內(nèi)外參考株的ORF5基因序列(參考毒株信息如表2所示)進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列比對(duì)分析,并應(yīng)用Mega 11.0軟件中的最大似然法構(gòu)建PRRSVORF5基因遺傳進(jìn)化樹(shù)。

表2 參考毒株信息Table 2 Information of reference strains

2 結(jié)果與分析

2.1 組織和血清樣品中PRRSV的qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果

應(yīng)用qRT-PCR對(duì)來(lái)自閩粵贛地區(qū)的1 475份組織和血清樣本cDNA進(jìn)行病原檢測(cè)。結(jié)果顯示:2020、2021、2022年P(guān)RRSV的陽(yáng)性率分別為24.23%(95/392)、27.69%(162/585)、18.07%(90/498);福建龍巖、泉州、漳州,廣東汕頭、梅州,江西贛州陽(yáng)性率分別為23.20%(220/948)、11.36%(10/88)、31.11%(42/135)、24.50%(37/151)、22.73%(15/66)、26.44%(23/87);血清與組織樣本陽(yáng)性率分別為21.42%(231/1 078)、29.21%(116/397)。表明PRRSV廣泛流行于不同地區(qū),其中,漳州地區(qū)感染PRRSV的情況最為嚴(yán)重,陽(yáng)性率高達(dá)31.11%(42/135)。

2.2 PRRSV OFR5基因的RT-PCR擴(kuò)增與鑒定

挑選86份來(lái)自不同豬場(chǎng)的PRRSV陽(yáng)性樣品,對(duì)其ORF5基因進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序,經(jīng)NCBI比對(duì)驗(yàn)證,成功獲得了62株P(guān)RRSVORF5基因序列。MegAlign軟件分析顯示,80株P(guān)RRSVORF5基因間核苷酸序列同源性為81.2%～100%,氨基酸序列同源性為78.6%～100%。80株P(guān)RRSVORF5基因序列與NADC30-like株、NADC34-like株等為代表的譜系1毒株間的核苷酸序列同源性為82.1%～95.0%,氨基酸序列同源性為81.6%～95.5%;與GM2-like株、QYYZ-like株等為代表的譜系3毒株間的核苷酸序列同源性為81.1%～94.5%,氨基酸序列同源性為80.1%～95.5%;與VR2332-like株、BJ-4-like株等為代表的譜系5毒株間的核苷酸序列同源性為82.1%～99.8%,氨基酸序列同源性為78.1%～98.5%;與JXA1-like株、CH-1a-like株等為代表的譜系8毒株間的核苷酸序列同源性為82.4%～95.0%,氨基酸序列同源性為80.1%～99.0%。

2.3 PRRSV ORF5基因遺傳進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

為進(jìn)一步分析閩粵贛地區(qū)PRRSV主要流行毒株的變異情況,利用Mega 11.0軟件對(duì)80株P(guān)RRSVORF5基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。結(jié)果(圖1)顯示,80株P(guān)RRSV均屬于美洲型,且分布在譜系1、3、5、8上。其中:40株P(guān)RRSV分布在譜系1上,與NADC30-like株屬于同一分支;12株P(guān)RRSV分布在譜系3上,與QYYZ-like株屬于同一分支;7株P(guān)RRSV分布在譜系5上,與VR2332-like株屬于同一分支;21株P(guān)RRSV分布在譜系8上,與JXA1-like株屬于同一分支。表明閩粵贛地區(qū)2020—2022年的流行毒株以譜系1為主。

●為本研究所擴(kuò)增的PRRSV ORF5基因。

2016年以來(lái)以NADC30-like株為代表的譜系1在檢出數(shù)量上已明顯超過(guò)以HP-PRRSV株為代表的譜系8,表明NADC30-like株已取代HP-PRRSV株成為我國(guó)主要的流行毒株[8]。福建省多個(gè)地區(qū)還相繼報(bào)道該亞型新出現(xiàn)的分支NADC34-like株[10],同時(shí)有研究表明NADC34-like株具備與NADC30-Like株類似的在我國(guó)流行的條件,因此需要加大監(jiān)測(cè)力度[11]。

2.4 PRRSV ORF5基因編碼的氨基酸序列

對(duì)閩粵贛地區(qū)的80株P(guān)RRSVORF5基因進(jìn)行氨基酸序列比對(duì),結(jié)果(圖2)顯示,ORF5基因編碼200個(gè)氨基酸,沒(méi)有氨基酸的插入與缺失。GP5蛋白的氨基酸序列突變主要集中在信號(hào)肽區(qū)(第1～31氨基酸殘基處)和高變區(qū)(第32～35、57～61氨基酸殘基處),在第62～120、130～160氨基酸殘基處相對(duì)保守。有研究發(fā)現(xiàn),第13、151氨基酸位點(diǎn)為推導(dǎo)的潛在毒力相關(guān)位點(diǎn)[12]。譜系8中僅有部分毒株在2個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了突變,其中,1株發(fā)生了R13Q的突變,7株發(fā)生了第151位點(diǎn)的變異,1株發(fā)生了R151T的突變,2株發(fā)生了R151G的突變,3株發(fā)生了R151I的突變,其余15株保持了與CH-1a、JXA1等強(qiáng)毒株一致的序列特征。譜系3中有12株P(guān)RRSV在中和表位區(qū)發(fā)生了L39S的變異,譜系8中有20株P(guān)RRSV發(fā)生了L39I的變異。PRRSV疫苗株和野毒株可根據(jù)GP5蛋白上的第137位氨基酸進(jìn)行區(qū)分[12],譜系5中PRRSV GP5蛋白第137位氨基酸與疫苗株Resp PRRSV MLV一樣均為A,表明處于譜系5的7株P(guān)RRSV可能都來(lái)源于疫苗株。

圖2 PRRSV GP5蛋白氨基酸序列的比對(duì)Fig.2 Amino acid sequence alignment of PRRSV GP5 protein

3 討論

PRRSV在我國(guó)持續(xù)性大規(guī)模暴發(fā)并導(dǎo)致豬群的高死亡率[5]。1996年郭寶清等[13]首次在國(guó)內(nèi)暴發(fā)的繁殖與呼吸綜合征豬群流產(chǎn)胎兒中分離到PRRSV,確認(rèn)我國(guó)豬群存在PRRSV感染。2006年HP-PRRSV株對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大危害,因PRRSV基因組不斷發(fā)生變異,自2016年起NADC30-like株逐漸替代HP-PRRSV株成為我國(guó)的主要優(yōu)勢(shì)毒株[7]。當(dāng)前國(guó)內(nèi)流行的PRRSV基因型種類復(fù)雜,一豬場(chǎng)可存在多種基因型PRRSV毒株,加劇了各基因型PRRSV毒株之間的重組變異情況,給豬繁殖與呼吸綜合征的防控帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)。因此實(shí)時(shí)了解PRRSV流行株分子變異情況十分必要。

本研究對(duì)2020—2022年閩粵贛地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)的1 475份病料樣品進(jìn)行PRRSV病原檢測(cè),共檢測(cè)出347份PRRSV陽(yáng)性樣品,陽(yáng)性率為23.5%,表明閩粵贛地區(qū)均能檢測(cè)到PRRSV,雖在檢出率上有所差異,但能說(shuō)明各地區(qū)感染PRRSV已十分普遍;縱向觀察顯示,PRRSV陽(yáng)性率從2021年的27.69%下降至2022年的18.07%,其大幅度下降可能與中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部取消豬瘟病毒疫苗和PRRSV疫苗強(qiáng)制免疫計(jì)劃有關(guān),從而促使養(yǎng)殖場(chǎng)更加注重科學(xué)免疫以降低疫病對(duì)豬只的感染風(fēng)險(xiǎn);從分布地區(qū)上發(fā)現(xiàn),漳州市PRRSV陽(yáng)性率占比最高,提示應(yīng)對(duì)該地區(qū)加強(qiáng)豬繁殖與呼吸綜合征的防控,以降低疫病帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失。自1996年P(guān)RRSV首次在我國(guó)報(bào)道后,迅速傳播至各個(gè)省份,對(duì)全國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。如:李文忠等[14]報(bào)道,2021—2022年天津地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)疑似發(fā)病豬PRRSV陽(yáng)性樣品檢出率為37.3%;吳瑕等[15]報(bào)道,2017—2020年江西省PRRSV陽(yáng)性率為42.55%;高明艷等[16]報(bào)道,2021年河北省部分地區(qū)PRRSV陽(yáng)性率為48.39%。經(jīng)調(diào)查,近年來(lái)全國(guó)各地PRRSV陽(yáng)性率仍處于較高水平,且PRRSV極易變異的特性給我國(guó)豬繁殖與呼吸綜合征的防控帶來(lái)了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。

基于PRRSV表面的主要囊膜蛋白GP5存在遺傳多樣性的特點(diǎn),本研究對(duì)閩粵贛地區(qū)所檢出的陽(yáng)性PRRSV樣品ORF5基因進(jìn)行擴(kuò)增及遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果顯示,閩粵贛地區(qū)PRRSV存在譜系1、3、5、8的混合流行,其中以NADC30-like株和NADC34-like株為代表的譜系1占比最高,為50.00%。80株P(guān)RRSVORF5基因間的核苷酸和氨基酸序列同源性分別為81.3%～100%、78.6%～100%;與譜系1毒株間的核苷酸序列同源性為82.1%～95.0%,氨基酸序列同源性為81.6%～95.5%。研究發(fā)現(xiàn),2016—2018年P(guān)RRSV NADC30-like株已成為我國(guó)華北和西南地區(qū)的主要流行毒株(分別占比52.83%[17]、70.3%[18])。此結(jié)果與本研究結(jié)果高度一致,表明目前NADC30-like株仍然是我國(guó)PRRSV的優(yōu)勢(shì)流行株,因此亟需加強(qiáng)NADC30-like株的防控。

PRRSV疫苗株和野毒株可根據(jù)GP5蛋白的第137位氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行區(qū)分,而強(qiáng)、弱毒株可根據(jù)第13、151位氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行區(qū)分[12]。本研究對(duì)80株P(guān)RRSVORF5基因進(jìn)行氨基酸序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)63株P(guān)RRSVORF5基因編碼的第137位氨基酸位點(diǎn)均為S,與CH-1a-like株、JXA1-like株、NADC30-like株、GM2-like株相同;譜系5中7株P(guān)RRSVORF5基因編碼的第137位氨基酸位點(diǎn)與疫苗株Resp PRRSV MLV一樣均為A,表明其可能為疫苗株;譜系8中大部分毒株保持了強(qiáng)毒株的序列特征。此外,本研究還發(fā)現(xiàn)33株P(guān)RRSV存在L39I/L39S的變異,這一突變可能會(huì)影響GP5蛋白的免疫原性從而大幅提高病毒逃避疫苗免疫誘導(dǎo)中和作用的概率,進(jìn)而降低疫苗免疫保護(hù)的效率[15,19],給豬繁殖與呼吸綜合征的綜合防控帶來(lái)困難。因此,只有實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和掌握PRRSV的變異情況及流行動(dòng)態(tài),才能有效預(yù)防豬繁殖與呼吸綜合征疫情的發(fā)生。