黃思琦, 張麒功, 葉澤霖, 覃興化, 汪其雙, 林協(xié)全, 鄭智位, 林文鋒, 鄒小興

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院,福建 福州 350002;2.自然生物資源保育利用福建省高校工程研究中心, 福建 福州 350002;3.福建省德化葛坑國有林場,福建 德化 362509)

禿杉(Taiwaniaflousiana)為柏科(Cupressaceae)臺灣杉屬(Taiwania)多年生喬木。其樹干筆直,生長迅速,木紋美觀,質(zhì)地適中,木質(zhì)優(yōu)良,易于加工,是優(yōu)秀的用材樹種和景觀樹種,具有較高的經(jīng)濟(jì)、觀賞價值[1]。由于長期的亂砍濫伐和繁育技術(shù)問題,其自然分布十分稀少[2]。在我國西南地區(qū),禿杉結(jié)果較晚,約需29年才能收獲種子[3]。然而,在閩南地區(qū)的生產(chǎn)實(shí)踐中,約31年的禿杉人工林均未見結(jié)果,這極大增加了利用有性繁殖進(jìn)行良種繁育的難度與成本。因此,開展禿杉無性快速繁育的研究十分必要。

嫁接是植物無性繁殖中常用的一種方法,廣泛應(yīng)用于良種保存、快速繁殖和提高產(chǎn)量等方面,能有效減少由性狀分離導(dǎo)致的優(yōu)良性狀丟失[4-5]。砧穗之間的親和性是影響嫁接苗成活率、生長狀況和產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。本砧嫁接使用與接穗同種的植株作為砧木,具有高度親和性。然而,由于閩南地區(qū)的禿杉無法結(jié)果,在生產(chǎn)實(shí)踐中獲取適用于本砧的砧木的難度和成本較高,需要從其他種類中選擇適用于禿杉嫁接的砧木,即異砧嫁接。如何選擇親和性高的異種砧木,成為提高禿杉嫁接成功率的研究重點(diǎn)。目前,異砧嫁接的砧木篩選主要從生長和生理層面進(jìn)行,例如:使用福建山櫻花和櫻桃作為飛寒櫻的砧木進(jìn)行嫁接[6],篩選出具有較高成活率、抽梢率、新梢基徑和長度的福建山櫻花作為優(yōu)良砧木;對于杜鵑紅山茶,可選擇高州油茶、廣寧紅花油茶、岑溪軟枝油茶和普通油茶作為潛在砧木,通過比較分析嫁接死亡率、嫁接苗葉片代謝產(chǎn)物含量、抗氧化酶活性和光合色素含量,篩選出具有良好親和性的高州油茶作為優(yōu)良砧木[7]。

生長和生理指標(biāo)容易受到環(huán)境因素干擾,且存在多種不確定因素。使用穩(wěn)定且不易受環(huán)境影響的指標(biāo)可以更準(zhǔn)確地篩選與接穗親緣關(guān)系相近的異種砧木。隨著生物信息學(xué)的發(fā)展,高通量測序手段和基因?qū)用娴姆治鲋饾u被應(yīng)用于物種親緣關(guān)系的研究。葉綠體基因組因其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、相對保守等特點(diǎn),常作為物種進(jìn)化與遺傳鑒定方面的重要依據(jù)[8-9]。Junko et al[10]對25種柏科植物的葉綠體基因matK、chlL、trnL、trnF之間的基因間區(qū)與trnL的1個內(nèi)含子進(jìn)行測序,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,進(jìn)一步明確各屬間的關(guān)系。Liu et al[11]通過轉(zhuǎn)錄組測序,探究柏科植物各屬的進(jìn)化關(guān)系和親緣關(guān)系。密碼子是指mRNA上的三聯(lián)體核苷酸殘基序列,每個三聯(lián)體密碼子對應(yīng)一個氨基酸[12]。在生物進(jìn)化過程中,自然界中許多物種存在某一種或幾種特定的密碼子使用頻率高于其同義密碼子的現(xiàn)象,即密碼子使用偏性,又稱密碼子偏好性[13]。不同物種的密碼子具有不同的使用偏好性。有研究表明,親緣關(guān)系較近的物種通常具有相似的密碼子使用偏好性[14]。因此,從葉綠體基因組及密碼子偏好性角度對禿杉砧木進(jìn)行篩選,相較于生長和生理角度的篩選更為準(zhǔn)確,從而為禿杉無性繁育研究和規(guī)?；a(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)使用禿杉與4種待選為砧木的柏科植物,即水杉(Metasequoiaglyptostroboides)、杉木(Cunninghamialanceolata)、福建柏(Fokieniahodginsii)和日本柳杉(Cryptomeriajaponica)的葉綠體基因組,篩選出蛋白編碼序列(coding sequence, CDS),并結(jié)合密碼子偏好性進(jìn)行分析,研究密碼子偏好性形成的主要因素和使用規(guī)律,以找出與禿杉共有最優(yōu)密碼子最多的物種。隨后,基于葉綠體基因組密碼子的相對同義密碼子使用度(relative synonymous codon usage, RSCU)、全基因組序列和CDS序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,為禿杉最優(yōu)砧木的選擇以及嫁接砧木方法的可行性研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 序列數(shù)據(jù)獲取與篩選

從NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載5種柏科植物的葉綠體基因組全序列。為減少分析誤差,分別篩選出符合以下條件的CDS序列:(1) 剔除重復(fù)序列;(2) 確保序列堿基數(shù)為3的倍數(shù);(3) 確保序列長度≥300 bp;(4) 每條序列均擁有起始密碼子(ATG)與終止密碼子(TAG、TGA、TAA),且序列中間無終止密碼子[15]。經(jīng)過篩選后,所得的5種柏科植物葉綠體基因組序列信息如表1所示。

表1 5種柏科植物葉綠體基因組序列信息Table 1 Information of chloroplast genome of 5 Cupressaceae plants

1.2 序列數(shù)據(jù)分析方法

對篩選出的5種柏科植物的葉綠體基因組CDS序列進(jìn)行分析[16]。通過在線分析軟件CUSP分別統(tǒng)計各物種CDS序列的密碼子總GC含量(GCall)與第1、2、3位GC含量(GC1、GC2、GC3);使用分析軟件CodonW得到各基因的有效密碼子數(shù)(effective number of codon, ENC)、RSCU、同義密碼子第3位GC含量(GC3s)以及密碼子第3位A、T、C、G含量(A3、T3、C3、G3)。

在中性繪圖分析[17]中,以GC3為橫坐標(biāo)、GC1與GC2的平均值GC12為縱坐標(biāo)構(gòu)建平面直角坐標(biāo)系,將每個基因?qū)?yīng)至坐標(biāo)系中得到散點(diǎn)圖,并繪制回歸曲線。若散點(diǎn)沿坐標(biāo)軸對角線分布,說明堿基突變是造成密碼子偏好性的主要因素;反之則以自然選擇影響為主。

在ENC-plot繪圖分析[18]中,以GC3s為橫坐標(biāo)、ENC為縱坐標(biāo)構(gòu)建平面直角坐標(biāo)系,ENC=2+GC3s+29/[GC3s2+(1-GC3s)2]為標(biāo)準(zhǔn)曲線。將基因定位至坐標(biāo)系中得到散點(diǎn)圖。若散點(diǎn)沿標(biāo)準(zhǔn)曲線分布,表明該基因密碼子偏好性主要受堿基突變影響;若偏離標(biāo)準(zhǔn)曲線,表明主要受自然選擇影響。

在PR2-plot繪圖分析[19]中,以G3/(G3+C3)為橫坐標(biāo)、A3/(A3+T3)為縱坐標(biāo)構(gòu)建平面直角坐標(biāo)系,并繪制二維散點(diǎn)圖。以A=T、C=G為中心,根據(jù)基因落點(diǎn)位置判斷A與T、C與G的使用頻率。

在最優(yōu)密碼子分析[20]中,RSCU>1為高頻密碼子。將各序列按ENC進(jìn)行升序排列,ENC較高的5個序列作為低表達(dá)基因庫,較低的5個序列作為高表達(dá)基因庫,進(jìn)行RSCU分析并作差,所得ΔRSCU≥0.08為高表達(dá)優(yōu)越密碼子。同時符合高頻密碼子和高表達(dá)優(yōu)越密碼子即為最優(yōu)密碼子。

在聚類樹與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建[18]中,根據(jù)5種柏科植物的葉綠體基因組密碼子RSCU,使用SPSS進(jìn)行聚類分析,并構(gòu)建聚類樹。基于葉綠體基因組全序列以及CDS序列,應(yīng)用MAFFT構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 密碼子組成

禿杉、水杉、杉木、福建柏、日本柳杉的葉綠體基因組密碼子的GCall分別為36.60%、37.33%、37.16%、36.75%、36.87%,密碼子不同位置的GC含量均低于50%,且都呈現(xiàn)出GC1>GC2>GC3的趨勢,即A/T含量高于G/C,同時多以A/T結(jié)尾(表2)。

表2 5種柏科植物葉綠體基因組CDS序列密碼子參數(shù)特征Table 2 CDS codon parameters of chloroplast genome of 5 Cupressaceae plants

ENC是反映密碼子偏好性強(qiáng)弱的指標(biāo),該值越大,該物種的密碼子偏好性越弱,反之越強(qiáng)。Wu et al[21]的研究結(jié)果表明,ENC≤35時,物種基因密碼子偏好性較強(qiáng)。由表2可得,禿杉、水杉、杉木、福建柏、日本柳杉的CDS序列密碼子ENC分別為28.70～54.60、30.41～60.39、30.92～54.14、34.31～53.00、33.49～57.14,平均值分別為45.62、46.77、45.94、46.44、46.83,可見,絕大多數(shù)CDS序列的ENC高于35,表明其密碼子偏好性較弱。

2.2 中性繪圖分析

所有基因均落于坐標(biāo)軸對角線的上方,未沿對角線分布(圖1)。其中,杉木的GC12與GC3呈負(fù)相關(guān),禿杉、水杉、福建柏和日本柳杉均呈正相關(guān);回歸系數(shù)為-0.009 7～0.292 7,均無顯著相關(guān)性?？沙醪脚卸ㄟ@5個物種的CDS密碼子偏好性形成因素均以自然選擇為主。

“紅線”為密碼子散點(diǎn)回歸曲線。A.禿杉;B.水杉;C.杉木;D.福建柏;E.日本柳杉。

2.3 ENC-plot繪圖分析

5種柏科植物的葉綠體基因組的ENC-plot圖結(jié)構(gòu)相似(圖2),多數(shù)基因離標(biāo)準(zhǔn)曲線都具有一定距離,少部分基因沿標(biāo)準(zhǔn)曲線分布?？梢?自然選擇是影響多數(shù)基因密碼子偏好性形成的主要因素,同時其也受到堿基突變的影響。

A.禿杉;B.水杉;C.杉木;D.福建柏;E.日本柳杉。

2.4 PR2-plot繪圖分析

5種柏科植物的葉綠體基因分布均不規(guī)律(圖3),其中,禿杉、水杉、杉木與日本柳杉的葉綠體基因在右下區(qū)域分布較多,福建柏則在左下區(qū)域分布較多。由此可見,這5種柏科植物葉綠體基因組密碼子偏好性的形成源于堿基突變和自然選擇共同作用。

A.禿杉;B.水杉;C.杉木;D.福建柏;E.日本柳杉。

2.5 最優(yōu)密碼子分析

根據(jù)相對同義密碼子分析結(jié)果(圖4),5種柏科植物葉綠體基因組共有的高頻密碼子有29個。而最優(yōu)密碼子分析結(jié)果(圖5)顯示,禿杉、水杉、日本柳杉、杉木、福建柏的最優(yōu)密碼子分別為19、17、11、13、18個。其中,密碼子AAA、CCA、GCU同時為禿杉、水杉、杉木、福建柏的最優(yōu)密碼子;而UUA、GUA、CAU、CAA、GAU、UCU、CCU、ACU、UGU、AGA、AGU、GGU為這5種柏科植物中3種共有的最優(yōu)密碼子,共12個,其中4個以A結(jié)尾,8個以U結(jié)尾,沒有以G/C結(jié)尾的密碼子。此外,禿杉分別與水杉、杉木、福建柏、日本柳杉共有9、7、11、7個最優(yōu)密碼子。

圖4 5種柏科植物的RSCUFig.4 Relative synonymous codon usage of 5 Cupressaceae plants

2.6 系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)RSCU的聚類分析結(jié)果,水杉、杉木、日本柳杉和禿杉被歸為同一類群,其中,水杉、杉木和日本柳杉形成一小類,而福建柏則獨(dú)立成一支(圖6A)。這表明水杉、杉木和日本柳杉在密碼子偏好性形成模式上相似,而禿杉略有不同。根據(jù)葉綠體基因組全序列分析結(jié)果,杉木與禿杉的親緣關(guān)系最近,與福建柏、日本柳杉和水杉次之(圖6B);根據(jù)葉綠體基因組CDS序列分析結(jié)果,杉木與禿杉的親緣關(guān)系最為接近,與日本柳杉和水杉次之,而福建柏與其他樹種的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)(圖6C)。

3 討論與結(jié)論

本研究對5種柏科植物的葉綠體基因組及密碼子偏好性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明,這5種植物的葉綠體基因組密碼子偏好性呈現(xiàn)為GC3>GC2>GC1,即更偏好以A/T結(jié)尾。同義密碼子的使用度分析也支持這一結(jié)果。此外,ENC大于35,說明使用偏好性較弱。中性繪圖分析、ENC-plot分析和PR2-plot分析的結(jié)果非常接近,表明密碼子偏好性的形成源于自然選擇和堿基突變共同作用。這些結(jié)果表明,由于葉綠體基因組在進(jìn)化過程中具有相對穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和較低的重組率,同一科、屬的植物物種的密碼子偏好性及形成因素具有一致性。這與3種木蓮屬植物[16]、12種薔薇科植物[17]、5種冰草屬植物[22]、3種含笑屬植物[23]的研究結(jié)果相似。

通過建立高、低表達(dá)基因庫進(jìn)行最優(yōu)密碼子分析,發(fā)現(xiàn)AAA、CCA和GCU是禿杉、水杉、杉木與福建柏這4種植物的共有最優(yōu)密碼子。與禿杉的最優(yōu)密碼子進(jìn)行對比,福建柏?fù)碛凶疃嗟墓灿凶顑?yōu)密碼子,共有11個,水杉為9個,日本柳杉和杉木為7個。這4種植物與禿杉共有的最優(yōu)密碼子數(shù)量差異較小,進(jìn)一步證明了親緣關(guān)系較近的同一科植物的葉綠體基因組密碼子使用偏好性的相似性,鞏固了該分析方法的可行性。

基于葉綠體基因組全序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹、基于葉綠體基因組CDS序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹和RSCU的聚類分析結(jié)果(D=5)均顯示,禿杉與杉木的親緣關(guān)系最為接近,與福建柏的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。然而,葉綠體全基因組序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果與RSCU的聚類分析結(jié)果略有不同,推測原因可能是全基因組中存在較多具有差異性的非編碼序列。因此,可以得出結(jié)論,杉木與禿杉的親緣關(guān)系較水杉、福建柏和日本柳杉更為接近。

嫁接是植物無性繁殖技術(shù)的重要組成部分。選擇與接穗親和性高的砧木可以有效提升嫁接成功率,保留優(yōu)良性狀并快速繁育良種,提高生產(chǎn)效益。此外,這種方法還能解決由于種子缺失導(dǎo)致的實(shí)生砧木缺失問題。因此,選擇高親和力的異種砧木的方法正在不斷優(yōu)化。近年來,隨著生物信息學(xué)的發(fā)展,通過基因組分析物種間的親緣關(guān)系可為生產(chǎn)實(shí)踐提供重要參考。本研究通過對5種柏科植物的葉綠體基因組和密碼子偏好性進(jìn)行分析,并建立系統(tǒng)發(fā)育樹驗(yàn)證了該分析方法的較高準(zhǔn)確性。這可為優(yōu)化砧穗親和性選擇方法提供新的理論依據(jù),有助于推廣基因組層面分析的應(yīng)用,并促進(jìn)珍稀植物禿杉的無性繁育研究。此外,該研究為以杉木作為禿杉的優(yōu)良異種砧木提供了理論基礎(chǔ),也有益于禿杉資源的可持續(xù)利用。在實(shí)際生產(chǎn)中,杉木作為禿杉異砧嫁接的砧木,是否優(yōu)于其他柏科植物種類,需要進(jìn)一步研究。