張凱強, 韓長志,2

(1.西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保護學(xué)院;2.云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點實驗室,云南 昆明 650224)

炭疽菌屬(Colletotrichum)是植物病原真菌中的一個重要類群,主要為害花卉、蔬菜、苗木和果樹等[1]。核桃(JuglansregiaL.)樹是我國重要的木本油料樹種,由炭疽菌屬真菌引起的核桃炭疽病是該樹種的常見病害。此類病菌主要侵害核桃果實,也可侵害葉片、芽和嫩梢等,侵害率高達95%以上,嚴(yán)重影響核桃產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[2]。目前已報道的核桃炭疽病菌有5種,分別為膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)、果生炭疽菌(C.fructicola)、暹羅炭疽菌(C.siamense)、尖孢炭疽菌(C.acutatum)和葡萄炭疽菌(C.viniferum),其中,膠孢炭疽菌為主要致病菌[3-7]。

碳水化合物活性酶類(carbohydrate-active enzymes, CAZymes)是植物病原真菌中的一類重要分泌蛋白,不僅參與降解寄主植物細(xì)胞壁的過程,還能促進病原真菌在寄主植物表面的附著、侵入及在寄主體內(nèi)的定殖和營養(yǎng)吸收等過程[8]。糖苷水解酶(glycoside hydrolases, GH)是CAZymes的重要組成類別,在病原真菌侵染植物過程中發(fā)揮著非常重要的作用。GH具有諸多亞家族,其數(shù)量和種類的差異會導(dǎo)致不同真菌對植物細(xì)胞壁多糖分子的降解能力不同,進而表現(xiàn)出不同的寄生特性[9]。如:GH7亞家族可用于降解纖維素[10];GH18可通過底物輔助保留機制催化氨基多糖中β-1,4糖苷鍵的生物降解[11];GH28主要參與果膠的降解過程[12]。前人對GH的研究主要集中在找尋與鑒定[13]、功能分析[14]、表達分析[15]等方面,有關(guān)植物病原真菌中GH蛋白的互作尚未見報道。

為了更好地理解核桃炭疽病菌中GH蛋白的協(xié)同作用機制,本研究基于前期所獲得的膠孢炭疽菌Cg1中的GH蛋白,通過STRING網(wǎng)絡(luò)在線分析與其相似性較高的兩個物種膠孢炭疽菌Cg-14和果生炭疽菌Nara gc5相關(guān)蛋白的互作關(guān)系,同時利用MEGA X等軟件對其遺傳關(guān)系進行分析。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

膠孢炭疽菌Cg1由本課題組長期保存。前期開展了該菌的全基因組測序工作,并利用生物信息學(xué)工具篩選出20個GH蛋白,分別將其命名為CgCAZ1-CgCAZ20,將這20條蛋白序列通過STRING網(wǎng)絡(luò)進行在線分析,發(fā)現(xiàn)有3個炭疽菌種與Cg1中的GH蛋白存在對應(yīng)關(guān)系,且每個菌種中均有19個蛋白存在互作關(guān)系,選擇同源性較高的膠孢炭疽菌Cg-14和果生炭疽菌Nara gc5中的相關(guān)蛋白進行互作關(guān)系分析。Cg-14和Nara gc5對應(yīng)的蛋白標(biāo)識符見表1。其中:Nara gc5中標(biāo)識符為L2GH97的蛋白注釋含有SUN(Sad-1、UNC84)結(jié)構(gòu)域的家族蛋白,并不含有GH保守結(jié)構(gòu)域。蛋白標(biāo)識符為L2GGX8、L2FGE9、L2FZQ3、L2FX85、L2FTC1、L2G9R4、L2GH97的對應(yīng)序列經(jīng)Blastp比對后未發(fā)現(xiàn)相關(guān)蛋白,故選擇相似度最高的蛋白進行后續(xù)分析,其相似度分別為90.62%、93.79%、86.93%、87.34%、91.88%、98.85%、87.44%,對應(yīng)ID如表1所示。

表1 不同炭疽菌中GH蛋白的基本信息1)Table 1 Basic information of GH proteins in different Colletotrichum spp.

1.2 蛋白互作分析方法

利用蛋白互作在線分析軟件STRING v11.5[16]對膠孢炭疽菌Cg-14和果生炭疽菌Nara gc5中的37個GH蛋白進行分析。

1.3 分子對接分析方法

通過UniProt數(shù)據(jù)庫[17]下載兩種炭疽菌中相互作用關(guān)系最多的相關(guān)蛋白PDB格式文件,利用GRAMM軟件[18]進行分子對接,再用Pymol軟件[19]進行可視化分析。

1.4 蛋白亞細(xì)胞定位分析方法

利用亞細(xì)胞定位分析軟件ProtComp v9.0[20]對3種炭疽菌中的57個GH蛋白開展分析。

1.5 蛋白遺傳關(guān)系分析方法

利用Clustal X[21]和MEGA X軟件[22]分別對3種炭疽菌中的57個GH蛋白進行多重比對分析和構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 GH蛋白互作情況預(yù)測

膠孢炭疽菌Cg-14中19個GH蛋白的互作關(guān)系主要有3種,即不同GH蛋白之間的互作、同一GH亞家族中不同蛋白之間的互作以及單獨的GH蛋白(不存在互作蛋白)。以T0MB41蛋白為例,該蛋白屬于GH5亞家族,其與T0KVB3、T0KW32、T0KZM4、T0KXL2、T0L6B8存在明顯的互作關(guān)系,這些蛋白分別屬于GH5、GH11、GH6、GH7、GH7亞家族;GH28亞家族中T0LSR8、T0K4J4兩個蛋白之間存在互作關(guān)系,且不與其他蛋白互作(圖1A);T0KMK0、T0K4W2、T0L1D5、T0KB15、T0KB04、T0K133、T0KIW6、T0LB39等為單獨的GH蛋白。進一步逐個對上述單獨GH蛋白與其他類蛋白的互作關(guān)系進行研究,發(fā)現(xiàn)T0KMK0、T0K4W2、T0KB15、T0KB04 4個蛋白在默認(rèn)設(shè)置下找不到交互程序,需要繼續(xù)降低設(shè)置嚴(yán)格性才能找到其互作關(guān)系。其中,T0K4W2與T0L9Q5、T0JWP1、T0K6D7、T0KZM4、T0KH50、T0LC84、T0KN70、T0L448、T0LNR6、T0K897 10個蛋白具有互作關(guān)系(圖1B)。

果生炭疽菌Nara gc5中18個GH蛋白的3種互作關(guān)系與Cg-14相同。以L2GGX8蛋白為例,該蛋白屬于GH5亞家族,其與L2FZQ3、L2G5W4、L2FMB8、L2FX67存在明顯的互作關(guān)系,這些蛋白分別屬于GH6、GH7、GH7、GH11亞家族;GH5亞家族中L2FTM4、L2FGE9兩個蛋白以及GH28亞家族中L2GAD4、L2G277兩個蛋白之間存在互作關(guān)系,且不與其他蛋白互作(圖2A)。上述結(jié)果表明,不同亞家族的GH蛋白之間存在互作關(guān)系,且同一GH亞家族中不同蛋白之間也存在互作關(guān)系。此外,存在諸多單獨的GH蛋白,主要包括L2G9R4、L2G958、L2FX85、L2FEV3、L2FWJ5、L2G7F7、L2GIN1等。進一步逐個對上述單獨GH蛋白與其他類蛋白的互作關(guān)系進行研究,發(fā)現(xiàn)L2G9R4、L2G958、L2GIN1 3個蛋白在默認(rèn)設(shè)置下找不到交互程序,需要繼續(xù)降低設(shè)置嚴(yán)格性才能找到其互作關(guān)系。其中,L2G958與L2G384、L2GCR6、L2GEJ1、L2FKE6、L2G2H7、L2GB80、L2FC38、L2GBF8、L2FXG5、L2GIN1 10個蛋白具有互作關(guān)系(圖2B)。

綜上可知,Cg-14與Nara gc5中GH蛋白的互作情況極為相似,推測Cg1中GH蛋白的互作情況與這兩種菌株相同。具體如下:與GH5存在互作關(guān)系的蛋白最多,且GH5亞家族中不同蛋白之間也存在互作關(guān)系;另外,GH5、GH6、GH7、GH11 4個GH亞家族之間均存在明顯互作關(guān)系,GH28亞家族中兩個蛋白之間互作,但不與其他GH亞家族互作;其余亞家族內(nèi)部不同蛋白之間均不存在互作關(guān)系。通過逐個對單獨GH蛋白的互作關(guān)系進行研究發(fā)現(xiàn),單獨的GH蛋白又與對應(yīng)菌株中其他類蛋白存在互作關(guān)系,且與其存在互作關(guān)系的蛋白大多為CAZymes類蛋白,多參與多糖催化、碳水化合物代謝等過程。

2.2 GH蛋白分子對接情況預(yù)測

UniProt數(shù)據(jù)庫中未包含現(xiàn)存所有蛋白的晶體結(jié)構(gòu),因此選擇Cg-14和Nara gc5兩種炭疽菌中互作關(guān)系最多的兩種蛋白T0MB41(GH5)、T0KZM4(GH6)以及L2GGX8(GH5)、L2FZQ3(GH6)進行分子對接。通過UniProt數(shù)據(jù)庫下載這4個蛋白的PDB格式文件,其晶體結(jié)構(gòu)包含高置信度和低置信度所有區(qū)域(圖3)。使用GRAMM軟件進行分子對接,再用Pymol軟件進行可視化分析。結(jié)果顯示,兩個蛋白之間均存在多個相互作用的氨基酸殘基位點(圖4),蛋白之間通過氨基酸殘基相互作用,形成可以改變其生物活性的復(fù)合體,從而產(chǎn)生協(xié)同作用。

圖3 4個GH蛋白晶體結(jié)構(gòu)模型Fig.3 Crystal structure models of 4 GH proteins

A.T0MB41與T0KZM4分子對接晶體結(jié)構(gòu);B.T0MB41與T0KZM4相互作用氨基酸殘基;C.L2GGX8與L2FZQ3分子對接晶體結(jié)構(gòu); D.L2GGX8與L2FZQ3相互作用氨基酸殘基。

2.3 GH蛋白亞細(xì)胞定位情況預(yù)測

對Cg1、Cg-14、Nara gc5 3種炭疽菌中57個GH蛋白進行亞細(xì)胞定位分析,結(jié)果表明:絕大多數(shù)蛋白(54個)均定位于細(xì)胞外(分泌型);僅GH72亞家族的3個蛋白(CgCAZ18、T0K133、L2FEV3)定位于細(xì)胞質(zhì)膜,其通常在細(xì)胞壁組分的交聯(lián)中發(fā)揮作用[23]。STRING分析發(fā)現(xiàn),T0K133、L2FEV3兩個蛋白在對應(yīng)菌株GH蛋白中均無明顯互作關(guān)系。

2.4 GH蛋白遺傳關(guān)系

對Cg1、Cg-14、Nara gc5 3種炭疽菌中57條GH蛋白序列進行多重序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種炭疽菌中GH蛋白明顯分為四大類(圖5)。CgCAZ14(GH43)所在分支中蛋白數(shù)量較少,僅有3個,且GH43亞家族中3個蛋白分屬于不同分支,親緣關(guān)系較遠(yuǎn);其余3個分支中所含蛋白數(shù)量較多,分別為20、16、18個。其中:GH5中的CgCAZ1和CgCAZ3屬于同一分支,而CgCAZ2單獨在一個分支;GH7、GH11、GH28亞家族內(nèi)部的蛋白均屬于同一分支。這表明核桃炭疽病菌中GH蛋白在進化過程中總體較為穩(wěn)定,少部分蛋白產(chǎn)生了較大程度的分化。

圖5 GH蛋白的遺傳關(guān)系Fig.5 Phylogenetic relationship of GH proteins

3 討論

植物病原真菌中的分泌蛋白和CAZymes等致病因子在其生長發(fā)育及致病過程中發(fā)揮著重要作用[8]。隨著學(xué)術(shù)界對核桃炭疽病菌致病因子的不斷研究,G蛋白信號調(diào)控因子(regulators of G-protein signaling, RGS)[24]、聚酮合酶(polyketide synthase, PSK)[25]、漆酶[26]以及還原酶[27]等致病因子相關(guān)蛋白的生物信息學(xué)特性得到進一步解析。CAZymes是植物病原真菌侵染過程中突破寄主植物細(xì)胞壁的關(guān)鍵因素,主要通過其子類GH蛋白將植物多糖分解成寡糖或單糖,進而破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),突破植物表皮障礙[8]。

本研究對與Cg1相似性較高的Cg-14和Nara gc5兩個菌株中37個GH蛋白的互作關(guān)系進行分析,發(fā)現(xiàn)其互作情況極為相似,推測Cg1中GH蛋白的互作情況與這兩個菌株相同。其中,與GH5存在互作關(guān)系的蛋白最多,GH5與GH6亞家族相關(guān)蛋白之間存在的互作關(guān)系最多。GH5廣泛存在于植物病原細(xì)菌與真菌中,通常參與纖維素的水解過程,在植物病原菌侵染寄主植物過程中發(fā)揮著重要作用[28]。但GH5亞家族中不同蛋白之間的互作及其與其他亞家族蛋白的互作是否可以提高纖維素水解效率進而加速侵染過程還有待進一步研究。GH5和GH28亞家族內(nèi)部不同蛋白之間均存在互作關(guān)系,且存在多個單獨的GH蛋白不與該菌株中其他GH蛋白互作。通過逐一對單獨的GH蛋白進行分析發(fā)現(xiàn),單獨的GH蛋白均與其他多類蛋白存在互作關(guān)系,且這些蛋白大多為CAZymes類蛋白,此類蛋白主要參與多糖催化、碳水化合物代謝等過程。遺傳關(guān)系分析發(fā)現(xiàn):GH43亞家族中的3個蛋白均屬于不同分支,親緣關(guān)系較遠(yuǎn),且CgCAZ14(GH43)所在分支中僅有3個蛋白;而GH5中的CgCAZ1和CgCAZ3蛋白屬于同一分支,親緣關(guān)系較近,CgCAZ2則與其他兩個蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn);GH7、GH11、GH28亞家族內(nèi)部的蛋白均屬于同一分支,親緣關(guān)系較近。本研究預(yù)測了兩種炭疽菌Cg-14和Nara gc5中GH蛋白的互作關(guān)系和遺傳關(guān)系,而其他炭疽菌屬真菌GH蛋白是否存在類似的互作關(guān)系,以及同一GH亞家族內(nèi)不同蛋白在長期進化過程中親緣關(guān)系遠(yuǎn)近對其功能的影響還有待進一步研究;同時,這些炭疽菌在侵染核桃過程中GH蛋白如何發(fā)揮功能,以及不同GH蛋白通過何種方式進行協(xié)同作用等均有待探索。