侯楠楠，謝全喜*，王俊賢，王 倩，王 梅，谷 巍

（山東寶來利來生物工程股份有限公司 山東省動物微生態(tài)制劑重點實驗室，山東 泰安 271000）

近年來我國畜牧業(yè)得到快速發(fā)展，廣大農(nóng)牧科技人員在開發(fā)利用中草藥資源、促進(jìn)農(nóng)牧業(yè)發(fā)展方面，取得了一定成果[1]。2013年，農(nóng)業(yè)部修訂的《飼料原料目錄》將115種中草藥列入飼用植物原料目錄。2020年我國規(guī)定，退出除中藥外的所有促生長類藥物飼料添加劑品種。因此，開發(fā)中草藥飼料添加劑替代抗生素成為行業(yè)研究的熱點。

我國是中藥生產(chǎn)大國，但隨著中藥材在人體及動物體上的廣泛應(yīng)用，中藥也出現(xiàn)供不應(yīng)求現(xiàn)象[2]。發(fā)酵是中藥傳統(tǒng)炮制工藝之一，工藝簡單，發(fā)酵中藥性質(zhì)穩(wěn)定，不易產(chǎn)生抗藥性，避免了原料的浪費，提高了中藥的利用率，可作為藥食同源的飼料添加劑，是防治動物疾病、替代抗生素的理想選擇[3-4]。王福剛[5]研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加5%復(fù)合益生菌培養(yǎng)物可以顯著提高肉羊生長性能、血液中免疫球蛋白含量以及抗氧化活性。史洪濤等[6]研究發(fā)現(xiàn)，口服0.2%液體發(fā)酵中藥蛋雞的過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）活性均顯著高于對照組（P＜0.05）。益生菌發(fā)酵中藥可以使益生菌和中藥協(xié)同增效，如李繼開等[7]研究發(fā)現(xiàn)，利用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）對黃芪、絞股藍(lán)、馬齒莧3種中藥構(gòu)成的組方進(jìn)行液體發(fā)酵，可顯著提高中藥粗多糖的含量。耿江蘇[8]研究發(fā)現(xiàn)，使用益生菌發(fā)酵魚腥草等中藥，可提高中藥益生菌數(shù)量至5.68×108CFU/mL。但中藥成分錯綜復(fù)雜，目前研究比較多的主要是液體發(fā)酵，關(guān)于固體發(fā)酵中藥作為飼料添加劑的報道比較少。

本研究使用3種植物乳桿菌對黃芪、甘草和益母草等復(fù)方中藥進(jìn)行固體發(fā)酵，研究其對復(fù)方中藥微生物和有效成分的影響，以期為中藥原料作為飼料添加劑提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）BLCC2-0015、BLCC2-0126和BLCC2-0410：山東寶來利來生物工程股份有限公司菌種保藏中心；黃芪、茯苓、益母草、甘草和當(dāng)歸：泰安永春堂藥店。

1.1.2 試劑

乳酸、阿魏酸、蘆丁等標(biāo)準(zhǔn)品（純度均＞98%）：上海源葉生物科技有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基MRS肉湯培養(yǎng)基、LBS培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀、InertSustain AQ-C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）：日本島津公司；AL204電子分析天平：瑞士梅特勒托利多有限公司；GL21M高速冷凍離心機(jī)：湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；CLDC271509超純水凈化系統(tǒng)（超純水儀）：重慶潺林熱能設(shè)備有限公司；PHS-3C雷磁精密酸堿度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；SB120D超聲波清洗機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 植物乳桿菌發(fā)酵液的制備

將4 ℃保存的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）BLCC2-0015、BLCC2-0126和BLCC2-0410斜面活化，轉(zhuǎn)接至裝有100 mL MRS液體培養(yǎng)基的鹽水瓶中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，活菌數(shù)均≥109CFU/mL，備用。

1.3.2 植物乳桿菌固體發(fā)酵復(fù)方中藥

選擇甘草、黃芪、茯苓、益母草和當(dāng)歸五味中藥，按質(zhì)量比4∶2∶2∶2∶1進(jìn)行充分混合。按復(fù)方中藥、麩皮和豆粕質(zhì)量比為7∶2∶1配制基料。稱取一定質(zhì)量的基料，按照基料與水比為1.0∶0.5（g∶mL）配制好發(fā)酵底物，按100 g/袋進(jìn)行裝袋，每個處理設(shè)3個平行。分別按2.0%的接種量接入培養(yǎng)好的植物乳桿菌發(fā)酵液，以不接種任何菌株的空白料為對照組，壓實后于37 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行生料厭氧發(fā)酵，分別于發(fā)酵24 h、48 h和72 h取樣，測定pH值、微生物含量、總酸含量、有機(jī)酸含量、甘草酸、粗多糖、總黃酮、阿魏酸和甘草次酸含量。

1.3.3 檢測方法

pH值：準(zhǔn)確稱取10.00 g樣品加入90 mL滅菌后的生理鹽水中，攪拌均勻后靜置10 min用玻璃電極pHS-3C型pH計測定。

微生物含量：準(zhǔn)確稱取10.00 g樣品加入90 mL帶有玻璃珠的無菌生理鹽水中，振蕩均勻，采用10倍梯度稀釋法稀釋，取適當(dāng)稀釋度的樣品分別涂布于LBS培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基和伊紅美蘭培養(yǎng)基中，分別于37 ℃、30 ℃和37 ℃培養(yǎng)48 h、48 h和24 h。乳桿菌參照GB 4789.35—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗乳酸菌檢驗》進(jìn)行菌落計數(shù)；霉菌參照GB 4789.15—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗霉菌和酵母計數(shù)》進(jìn)行菌落計數(shù)；大腸桿菌（Escherichia coli）參照GB 4789.38—2012《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗大腸埃希氏菌計數(shù)》進(jìn)行菌落計數(shù)。根據(jù)菌落數(shù)計算發(fā)酵中藥中乳桿菌、霉菌和大腸桿菌的活菌數(shù)，結(jié)果用CFU/g表示。

總酸含量：參照國標(biāo)GB/T 12456—2021《食品中總酸的測定》，采用酸堿滴定法測定。

有機(jī)酸含量：參照國標(biāo)GB 5009.157—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中有機(jī)酸的測定》，采用高效液相色譜法測定。

粗多糖含量：參照牛曉方等[9]的方法，以葡萄糖質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.010 3x-0.002 3（相關(guān)系數(shù)R2=0.999），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算粗多糖含量。

總黃酮含量：參照GB/T 20574—2006《蜂膠中總黃酮含量的測定方法分光光度比色法》檢測，以蘆丁對照品的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=13x-0.000 6（相關(guān)系數(shù)R2=0.996 7），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算總黃酮含量。

甘草酸、甘草次酸含量：參照SN/T3854—2014《出口食品中天然甜味劑甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、甘草酸、甘草次酸的測定高效液相色譜法》測定。阿魏酸含量：參照團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/SHRH025—2019《化妝品中阿魏酸含量的測定》測定。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2016軟件進(jìn)行初步處理后，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用One-way ANOVA進(jìn)行方差分析，最小顯著差別（least significant difference，LSD）法進(jìn)行組間多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌發(fā)酵對復(fù)方中藥pH值和微生物數(shù)量的影響

植物乳桿菌發(fā)酵對復(fù)方中藥pH值和微生物數(shù)量的影響見表1。由表1可知，與對照組相比，實驗組均可顯著降低發(fā)酵復(fù)方中藥pH值（P＜0.05），發(fā)酵72 h時均降至4.50以下，實驗組間差異不顯著（P＞0.05）。實驗組均可顯著提高發(fā)酵復(fù)方中藥的乳桿菌數(shù)量（P＜0.05），發(fā)酵24h、48h和72h時，實驗組的乳桿菌數(shù)量均可達(dá)到109CFU/g。發(fā)酵過程中，對照組大腸桿菌活菌數(shù)呈增加趨勢，發(fā)酵72 h時達(dá)到（1.13±0.20）×103CFU/g，而實驗組均未檢出大腸桿菌；對照組霉菌活菌數(shù)呈增加趨勢，發(fā)酵72 h時達(dá)到（5.61±0.23）×103CFU/g，而植物乳桿菌BLCC2-0015發(fā)酵復(fù)方中藥的霉菌活菌數(shù)呈下降趨勢，發(fā)酵72 h時低于100 CFU/g，植物乳桿菌BLCC2-0126和BLCC2-0410發(fā)酵復(fù)方中藥均未檢出霉菌。結(jié)果表明，植物乳桿菌發(fā)酵可提高復(fù)方中藥的乳桿菌活菌數(shù)，降低大腸桿菌及霉菌活菌數(shù)，且植物乳桿菌BLCC2-0126效果最好，其次為植物乳桿菌BLCC2-0410。耿江蘇[8]研究證實，使用益生菌發(fā)酵魚腥草等中藥，可提高中藥益生菌數(shù)量至5.68×108CFU/mL，4 ℃保存一個月后活菌數(shù)為4.80×108CFU/mL，顯微鏡檢查無雜菌污染，與本試驗結(jié)果一致。

表1 植物乳桿菌發(fā)酵對復(fù)方中藥pH值和微生物數(shù)量的影響Table 1 Effects of Lactobacillus plantarum fermentation on pH and microbial number of compound Chinese medicine

2.2 植物乳桿菌發(fā)酵對復(fù)方中藥總酸和機(jī)酸含量的影響

植物乳桿菌發(fā)酵對復(fù)方中藥總酸及有機(jī)酸含量的影響分別見表2和表3。

表2 植物乳桿菌發(fā)酵對復(fù)方中藥總酸含量的影響Table 2 Effects of Lactobacillus plantarum fermentation on total acid contents of compound Chinese medicine g/kg

表3 植物乳桿菌發(fā)酵對復(fù)方中藥有機(jī)酸含量的影響Table 3 Effect of Lactobacillus plantarum fermentation on organic acid contents of compound Chinese medicine g/kg

由表2可知，與對照組相比，實驗組均可顯著提高總酸含量（P＜0.05），其中，植物乳桿菌BLCC2-0410發(fā)酵復(fù)方中藥中總酸含量最高，其次為植物乳桿菌BLCC2-0126發(fā)酵復(fù)方中藥，且均顯著高于植物乳桿菌BLCC2-0015發(fā)酵復(fù)方中藥（P＜0.05）。植物乳桿菌BLCC2-0410發(fā)酵復(fù)方中藥72 h時總酸含量達(dá)到（27.82±1.22）g/kg。結(jié)果表明，植物乳桿菌發(fā)酵可以顯著提高復(fù)方中藥中的總酸含量，且植物乳桿菌BLCC2-0410提高效果最好，其次為BLCC2-0126。亓秀曄等[10]研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌發(fā)酵豬全價料，總酸含量可達(dá)到20.68 g/kg，與本試驗結(jié)果一致。

有機(jī)酸是乳酸菌發(fā)酵飼料提高飼料風(fēng)味的重要指標(biāo)，能夠改善中藥氣味和口感辛辣刺鼻等動物適口性的問題，其含量的多少與發(fā)酵程度密切相關(guān)[11]。吳錦蘭等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在乳酸菌LB-1-23接種量2.6%、pH值5.5、發(fā)酵溫度32 ℃條件下發(fā)酵30 h，乳酸產(chǎn)量達(dá)到12.74 g/L。由表3可知，與對照組相比，實驗組可顯著提高乳酸和蘋果酸含量（P＜0.05），降低乙酸、草酸和琥珀酸含量，對酒石酸和檸檬酸影響不顯著（P＞0.05）。這與王芮東等[13]的研究結(jié)果一致，發(fā)酵過程中乳桿菌繁殖利用乙酸、草酸等產(chǎn)生更多的乳酸、蘋果酸，導(dǎo)致乳酸、蘋果酸含量升高。乳酸、蘋果酸的增加可以提高中藥的酸香味，乙酸、草酸的降低可以減少中藥的刺鼻味[11]。其中，植物乳桿菌BLCC2-0410發(fā)酵效果最好，發(fā)酵復(fù)方中藥72 h時，乳酸、蘋果酸含量分別達(dá)到（19.25±0.15）g/kg、（4.06±0.18）g/kg，乙酸、草酸分別降低至（3.70±0.13）g/kg、（1.28±0.07）g/kg。

2.3 植物乳桿菌發(fā)酵對復(fù)方中藥粗多糖和總黃酮含量的影響

植物乳桿菌發(fā)酵對復(fù)方中藥粗多糖及總黃酮含量的影響分別見表4和表5。

表4 植物乳桿菌發(fā)酵對復(fù)方中藥粗多糖含量的影響Table 4 Effect of Lactobacillus plantarum fermentation on crude polysaccharide contents of compound Chinese medicine%

表5 植物乳桿菌發(fā)酵對復(fù)方中藥總黃酮含量的影響Table 5 Effect of Lactobacillus plantarum fermentation on total flavonoid contents of compound Chinese medicine%

粗多糖對氧自由基和羥自由基都有很好的清除作用，是一種天然抗氧化劑[14]。由表4可知，與對照組相比，實驗組均可顯著提高粗多糖含量（P＜0.05），且以植物乳桿菌BLCC2-0410發(fā)酵復(fù)方中藥的粗多糖含量最高，發(fā)酵72 h時達(dá)到（5.83±0.15）%。分析原因主要是微生物代謝過程中會分泌大量纖維素酶、蛋白酶、果膠酶、淀粉酶等胞外酶，可以使細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞破裂，中藥成分溶出，提高中藥有效成分得率，隨著處理時間的延長，溶出的多糖不斷積累[15]。唐鑫等[16]研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌CCFM8661發(fā)酵天山雪蓮粗多糖可達(dá)1.29 g/L。

有研究表明，總黃酮具有非常強的抗氧化以及消除自由基的作用[17]。由表5可知，與對照組相比，發(fā)酵24 h時，植物乳桿菌BLCC2-0126和BLCC2-0410發(fā)酵復(fù)方中藥總黃酮含量顯著升高（P＜0.05），分別提高12.13%和13.67%?？傸S酮含量的增加，從結(jié)構(gòu)上增加了活性O(shè)H基團(tuán)，減少空間位阻，可以提高中藥的抗氧化活性[17]。隨發(fā)酵時間延長，植物乳桿菌發(fā)酵復(fù)方中藥總黃酮含量均呈下降趨勢，發(fā)酵48 h時，植物乳桿菌BLCC2-0126發(fā)酵復(fù)方中藥中總黃酮含量顯著低于對照組（P＜0.05），這可能是因為營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，植物乳桿菌分泌多種糖苷酶分解黃酮糖苷類物質(zhì)作為能源物質(zhì)消耗[2]。

2.4 植物乳桿菌發(fā)酵對復(fù)方中藥阿魏酸、甘草酸及甘草次酸含量的影響

2.4.1 植物乳桿菌發(fā)酵對復(fù)方中藥阿魏酸含量的影響

阿魏酸是一種安全環(huán)保的天然抗菌劑，能夠有效抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌[18]。植物乳桿菌發(fā)酵復(fù)方中藥對阿魏酸含量的影響見表6。

由表6可知，與對照組相比，實驗組均可顯著提高阿魏酸含量（P＜0.05），且植物乳桿菌BLCC2-0126和BLCC2-0410發(fā)酵復(fù)方中藥的阿魏酸含量顯著高于植物乳桿菌BLCC2-0015（P＜0.05）。發(fā)酵24 h、48 h和72 h時均以植物乳桿菌BLCC2-0410發(fā)酵復(fù)方中藥時阿魏酸含量最高，分別比對照組高211%、212%和289%，且隨發(fā)酵時間的延長呈增加趨勢。分析原因可能是，在植物細(xì)胞中阿魏酸通過苷鍵或酯鍵與纖維素等相連接，益生菌發(fā)酵可以產(chǎn)阿魏酸酯酶，水解阿魏酸與纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等相互作用的酯鍵，破壞細(xì)胞壁的致密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)釋放出阿魏酸，使得阿魏酸含量升高[19-20]。結(jié)果表明，植物乳桿菌發(fā)酵可以提高復(fù)方中藥中阿魏酸的含量，這與尹志娜等[21-22]的研究結(jié)果一致。

2.4.2 植物乳桿菌發(fā)酵對復(fù)方中藥甘草酸及甘草次酸含量的影響

植物乳桿菌發(fā)酵對復(fù)方中藥甘草酸和甘草次酸含量的影響見表7。甘草次酸具有抗炎、抗病毒和提高機(jī)體免疫力等作用[23]。由表7可知，與對照組相比，實驗組甘草酸含量顯著降低（P＜0.05），甘草次酸含量顯著升高（P＜0.05），其中，植物乳桿菌BLCC2-0410發(fā)酵復(fù)方中藥72 h時甘草次酸含量最高為517.9 mg/kg，比對照組高135.09%。分析原因可能是植物乳桿菌發(fā)酵復(fù)方中藥產(chǎn)生甘草酸水解酶，水解甘草酸產(chǎn)生甘草次酸[24]。呂麗靜等[25]研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）與植物乳桿菌發(fā)酵甘草藥渣，甘草苷和甘草酸含量有所下降；樊梅娜等[26]研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌NBL-B3003發(fā)酵甘草24 h，甘草酸含量較未發(fā)酵降低90.44%。本研究中植物乳桿菌發(fā)酵甘草后甘草酸含量下降，推測亦可能是由于植物乳桿菌促進(jìn)了甘草酸的生物轉(zhuǎn)化引起的。同時已有研究表明，在體內(nèi)甘草酸轉(zhuǎn)化成甘草次酸后才發(fā)揮藥理作用，包括解毒、抑制肝纖維化、抗炎和抗腫瘤等[27]。

3 結(jié)論

采用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）BLCC2-0015、BLCC2-0126和BLCC2-0410固體發(fā)酵復(fù)方中藥（黃芪、甘草和益母草等）后，可降低復(fù)方中藥的pH值；提高乳桿菌活菌數(shù)，抑制大腸桿菌（Escherichia coli）及霉菌的生長；提高總酸、乳酸、蘋果酸、粗多糖、阿魏酸及甘草次酸的含量。其中，植物乳桿菌BLCC2-0410發(fā)酵效果最好，發(fā)酵72 h時，復(fù)方中藥的pH為4.32，乳桿菌活菌數(shù)為4.53×109CFU/g，大腸桿菌及霉菌未檢出；總酸、乳酸、蘋果酸、粗多糖、阿魏酸和甘草次酸含量均顯著升高（P＜0.05），分別為27.82 g/kg、19.25 g/kg、4.06 g/kg、5.83%、42.00 mg/kg和517.9 mg/kg。