王 梅，謝全喜*，侯楠楠，王 倩，谷 巍

（山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司 山東省動(dòng)物微生態(tài)制劑省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安 271000）

苯乳酸（phenyllactic acid，PLA），即2-羥基-3-苯基丙酸[1]，是蜂蜜中的天然抑菌物質(zhì)，具有抑菌譜廣、熱穩(wěn)定性強(qiáng)及對(duì)動(dòng)物和人體細(xì)胞安全無(wú)毒等特點(diǎn)[2-5]。苯乳酸的制備方法分為化學(xué)合成法[6]和微生物發(fā)酵法，其中苯乳酸的化學(xué)合成操作步驟耗時(shí)，所需試劑對(duì)環(huán)境不友好，不利于工業(yè)應(yīng)用[7-8]，而微生物合成法更具生產(chǎn)性和高效性[9]。研究表明，白地霉（Geotrichum candidum）[10]、丙酸菌（Propionibacterium acnes）[11]和乳酸菌[12]等均被報(bào)道能夠合成苯乳酸，但乳酸菌由于公認(rèn)的安全性和益生性等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)乳酸菌產(chǎn)苯乳酸研究更加深入和廣泛。但苯乳酸產(chǎn)量都不高，無(wú)法實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。因此，篩選高產(chǎn)苯乳酸的益生菌，提高苯乳酸的合成量尤為重要。王立梅等[13]研究表明，在乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中添加葡萄糖和苯丙酮酸，苯乳酸產(chǎn)量可達(dá)到2.12 g/L。李芬等[14]優(yōu)化乳酸菌的發(fā)酵條件使苯乳酸的合成量由712 mg/L增加至2 930 mg/L。同時(shí)LAVERMICOCCA P等[15]研究發(fā)現(xiàn)，苯乳酸是苯丙氨酸的內(nèi)源代謝產(chǎn)物，可由乳酸菌代謝產(chǎn)生。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，代謝的第一步就是通過(guò)非特異性氨基轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)，然后將α-氨基轉(zhuǎn)移到合適的受體，進(jìn)而得到苯丙酮酸和氨基酸，最后脫氫酶催化還原苯丙酮酸為苯乳酸，由此得出，促進(jìn)苯乳酸的合成可以通過(guò)添加苯丙氨酸來(lái)實(shí)現(xiàn)。

豆粕是豆類(lèi)加工后的副產(chǎn)品，含有豐富的蛋白質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但同時(shí)也含有一些抗?fàn)I養(yǎng)因子。通過(guò)發(fā)酵，可以顯著降低或鈍化這些抗?fàn)I養(yǎng)因子，將大分子蛋白質(zhì)分解為小肽或氨基酸，提高豆粕中的蛋白質(zhì)含量。此外，發(fā)酵還可以提高豆粕中的酸溶蛋白和總酸含量，降低飼料成本[16]。然而，在發(fā)酵過(guò)程中，豆粕可能會(huì)受到一些不良微生物的污染，如大腸桿菌（Escherichia coli）和霉菌，它們可能會(huì)消耗豆粕的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而降低發(fā)酵品質(zhì)。苯乳酸作為飼料添加劑應(yīng)用于發(fā)酵飼料，改善豆粕營(yíng)養(yǎng)水平的同時(shí)提高豆粕防腐效果[17]，將成為當(dāng)下研究的新思路。

本研究通過(guò)溶鈣圈法和牛津杯法從泡菜中分離純化具有抑菌作用的乳酸菌，采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法檢測(cè)菌株發(fā)酵液中苯乳酸含量，篩選出高產(chǎn)苯乳酸的菌株，對(duì)篩選菌株進(jìn)行菌落及細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性試驗(yàn)和16S rDNA鑒定，并利用篩選菌株對(duì)豆粕進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，研究底物添加方式、底物添加量、發(fā)酵組合方式優(yōu)化對(duì)發(fā)酵豆粕中苯乳酸含量的影響，以期提高發(fā)酵豆粕中苯乳酸含量，為高產(chǎn)苯乳酸菌株應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中提供重要參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料及菌株

泡菜、去皮豆粕（無(wú)結(jié)塊，黃色，無(wú)異味，無(wú)霉變，粉碎后過(guò)0.45 mm孔徑篩）、糖蜜（粘稠，黑褐色，呈半流動(dòng)，糖蜜的甜味）：市售；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）：山東寶來(lái)利來(lái)生物工程有限公司生物工程研究院菌種資源保藏中心保藏。

1.1.2 試劑

細(xì)菌脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒、堿性蛋白酶（酶活5 000 U/g）：山東隆科特酶制劑有限公司；苯丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.5%）、苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）、DL-苯乳酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98.0%）：美國(guó)Sigma公司；瓊脂（生化試劑）、葡萄糖（分析純）：山東祥瑞藥業(yè)有限公司；酵母膏、牛肉膏（均為生化試劑）：天津市英博生化試劑有限公司；蛋白胨（生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；檸檬酸銨（分析純）：上海撫生實(shí)業(yè)有限公司；硫酸鎂、硫酸錳（均為分析純）：濟(jì)南匯豐達(dá)化工有限公司；吐溫-80（生化試劑）：天津凱通化學(xué)試劑有限公司；乙酸鈉（分析純）：青島捷世康生物科技有限公司；三氟乙酸、甲醇（均為色譜純）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司。

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨1.0%、檸檬酸銨0.2%、牛肉膏1.0%、硫酸鎂0.05%、磷酸氫二鉀0.5%、酵母膏0.5%、乙酸鈉0.5%、硫酸錳0.02%、葡萄糖2.0%、吐溫-80 0.1%，pH 6.0，121 ℃滅菌20 min。MRS固體培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基中加1.5%瓊脂粉。

富集培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基中加入2.0 mg/mL的DL-3苯乳酸標(biāo)準(zhǔn)品。

初篩下層培養(yǎng)基：MRS瓊脂培養(yǎng)基中加入5.0 g/L的苯丙酮酸。

初篩上層培養(yǎng)基：MRS瓊脂培養(yǎng)基中加入30 g/L的碳酸鈣（單獨(dú)滅菌）。

發(fā)酵培養(yǎng)基：改良MRS液體培養(yǎng)基中加入5.0 g/L的苯丙酮酸。

1.2 儀器與設(shè)備

DHP-9082數(shù)顯恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DHG-9140ASD120D超聲波清洗機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；LD5-2A低速離心機(jī)：北京京立離心機(jī)有限公司；SW-CJ-2F（2）超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LC-20A HPLC儀：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)苯乳酸菌株的初篩

取少許不同來(lái)源的泡菜10 g，使用研缽搗碎后放入含有100 mL蒸餾水的滅菌三角瓶中，置于振蕩器上，振蕩30 min。取1 mL泡菜處理液接種于苯乳酸含量為2.0 mg/mL的富集培養(yǎng)基中，37 ℃富集培養(yǎng)24 h。采用常規(guī)平板梯度稀釋法進(jìn)行初篩，取0.1 mL稀釋富集菌液接入10 mL初篩下層培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下靜置培養(yǎng)24 h，再次注入初篩上層培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，篩選出溶鈣圈較大單菌落鏡檢。將革蘭氏陽(yáng)性單菌落劃線純化培養(yǎng)并重復(fù)3次，挑選單菌落轉(zhuǎn)接至斜面MRS培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，然后放入4 ℃冰箱待用。

采用牛津杯法篩選，將金黃色葡萄球菌與大腸桿菌接種于40 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的三角瓶中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，活化完成后采用無(wú)菌操作分別將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌稀釋一定的倍數(shù)，取0.1 mL菌液在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行均勻涂布，放入牛津杯，每個(gè)杯中分別注入培養(yǎng)好的初篩菌發(fā)酵液0.26 mL，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，篩選有抑菌圈的菌落，設(shè)置營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基為陰性對(duì)照。

1.3.2 高產(chǎn)苯乳酸菌株復(fù)篩

將初篩菌株接種至MRS固體斜面培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h，在無(wú)菌條件下用接種環(huán)將培養(yǎng)好的斜面接種至含3 g/L苯丙酮酸的MRS液體培養(yǎng)基中，對(duì)照組不添加苯丙酮酸，37 ℃靜置培養(yǎng)24h，取5.0mL發(fā)酵液離心（10 000 r/min、5 min），用0.22 μm濾膜將上清液經(jīng)過(guò)兩次過(guò)濾后即為待測(cè)樣品，使用高效液相色譜（HPLC）法檢測(cè)發(fā)酵液中苯乳酸含量。

1.3.3 高效液相色譜分析

標(biāo)準(zhǔn)溶液制備：精確稱(chēng)取0.205 8 gDL-3苯乳酸標(biāo)準(zhǔn)品并用超純水溶解定容到100 mL，獲得質(zhì)量濃度為2.048 g/L的苯乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)過(guò)稀釋獲得0.128 g/L、0.256 g/L、0.512 g/L、1.024 g/L、2.048 g/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

HPLC色譜條件：采用InertSustain AQ-C18色譜柱（5 μm，4.6×250 mm），柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。流動(dòng)相A：0.05%三氟乙酸水溶液，流動(dòng)相B：0.05%三氟乙酸甲醇溶液，0～15 min從40%B增加至80%B，15～16 min維持在80%B，為16～18 min從80%B下降至40%B。

定性、定量分析：采用保留時(shí)間定性；將上述各濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)樣分析后，以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)建立苯乳酸標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y=2.151e-8X-0.109 2（相關(guān)系數(shù)R2=0.995 5），再根據(jù)樣品的峰面積自動(dòng)計(jì)算出樣品中苯乳酸的含量。

1.3.4 固態(tài)發(fā)酵豆粕產(chǎn)苯乳酸菌株的篩選

精確稱(chēng)量200 g的國(guó)產(chǎn)去皮豆粕，加入0.15%苯丙酮酸，以料水比1∶0.45（g∶mL）加水，裝料量200 g/袋并壓實(shí)。菌株組為將經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的篩選菌株種子液分別以2%的接種量接種?？瞻捉M為不接種任何菌株，對(duì)照組為接種菌株但不添加任何底物。每組設(shè)3個(gè)平行，均置于37 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行厭氧固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵72 h取樣測(cè)定發(fā)酵樣品中苯乳酸含量。

1.3.5 菌株的鑒定

（1）形態(tài)學(xué)觀察

選擇產(chǎn)苯乳酸效果較好的菌株的純培養(yǎng)物接種于MRS瓊脂培養(yǎng)基平皿中，30 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落形態(tài)。采用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

（2）生理生化特性試驗(yàn)

參照《常見(jiàn)細(xì)菌真菌鑒定手冊(cè)》和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[18]的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，使用生化鑒定管對(duì)分離的菌株進(jìn)行生理生化特征分析。

（3）分子生物學(xué)鑒定

采用試劑盒提取菌體DNA，并對(duì)其進(jìn)行16S rDNA序列擴(kuò)增。所用引物為通用引物：1492r（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'），27f（5'-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3'）。PCR擴(kuò)增體系（50 μL）為：Mixture 25 μL（含TaqDNA聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）、MgCl2、反應(yīng)緩沖液），上下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，超純水21 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，25個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物送北京博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果提交至美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）同源性搜索，與NCBI16SrDNA數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，得到與待測(cè)物種序列相似性最大的同源序列。采用Mega 6.0中的鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.6 苯乳酸產(chǎn)生菌固態(tài)發(fā)酵豆粕對(duì)苯乳酸含量的影響（1）苯丙酮酸添加方式的選擇

精確稱(chēng)量200 g的國(guó)產(chǎn)去皮豆粕，以料水比為1∶0.45（g∶mL）加水，裝料量為200 g/袋并壓實(shí)。將經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的高產(chǎn)苯乳酸菌株種子液37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，以2%（V/V）的接種量進(jìn)行接種?？瞻捉M為不接種菌株；對(duì)照組為種子液和固態(tài)發(fā)酵時(shí)均不添加苯丙酮酸；試驗(yàn)組1為種子液中不添加苯丙酮酸，固態(tài)發(fā)酵時(shí)添加0.15%苯丙酮酸；試驗(yàn)組2為種子液中添加3 g/L苯丙酮酸，固態(tài)發(fā)酵時(shí)不添加苯丙酮酸。每組設(shè)3個(gè)平行，均置于37 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)厭氧固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵72 h取樣測(cè)定發(fā)酵物料中苯乳酸含量。

（2）苯丙酮酸添加量的選擇

精確稱(chēng)量200 g的國(guó)產(chǎn)去皮豆粕，在豆粕中分別加入苯丙酮酸，加入量為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%，以料水比為1∶0.45（g∶mL）加水，裝料量200 g/袋并壓實(shí)。將經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的R69種子液以2%的接種量進(jìn)行接種?？瞻捉M為不接種任何菌株的原料，對(duì)照組為接種菌株但不添加苯丙酮酸。每組設(shè)3個(gè)平行，均置于37 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行厭氧固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵72 h取樣測(cè)定發(fā)酵料中苯乳酸含量。

（3）不同基質(zhì)發(fā)酵豆粕對(duì)苯乳酸含量的影響

精確稱(chēng)量200 g的國(guó)產(chǎn)去皮豆粕，以料水比為1∶0.45（g∶mL）加水，裝料量200 g/袋，壓實(shí)。將經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的篩選菌株種子液以2%的接種量對(duì)試驗(yàn)1組、2組、3組和4組進(jìn)行接種，其中試驗(yàn)1組不添加其他物質(zhì)，試驗(yàn)2組按豆粕的0.15%加入苯丙酮酸，試驗(yàn)3組按豆粕的1.0%和3.0%分別加入中性蛋白酶和糖蜜，試驗(yàn)4組按豆粕的0.15%、1.0%和3.0%分別加入苯丙酮酸、中性蛋白酶和糖蜜。空白組不接種菌株，每組設(shè)3個(gè)平行，均置于37 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行厭氧固態(tài)發(fā)酵72 h，測(cè)定發(fā)酵料苯乳酸含量。

1.3.7 微生物指標(biāo)的測(cè)定

分別按照國(guó)標(biāo)GB 4789.15—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)》及GB 4789.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》檢測(cè)霉菌和大腸桿菌。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010進(jìn)行初步處理后，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（analysisofvariance，ANOVA），結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)苯乳酸菌株的分離與篩選

2.1.1 泡菜樣品中產(chǎn)苯乳酸菌株的分離篩選

經(jīng)過(guò)初篩及復(fù)篩，得到48株具有明顯溶鈣圈的菌株，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑菌作用的乳酸菌8株，分別為菌株R15、R21、R69、R92、R111、R112、R126和R410，其中菌株R69的碳酸鈣溶解圈及其對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的抑菌圈見(jiàn)圖1。

圖1 菌株R69的碳酸鈣溶解圈（a）及對(duì)大腸桿菌（b）和金黃色葡萄球菌（c）的抑菌圈Fig.1 Calcium carbonate dissolution ring(a)of strain R69,and inhibition zone on Escherichia coli(b)and Staphylococcus aureus(c)

采用HPLC法對(duì)8株具有抑菌作用的乳酸菌培養(yǎng)24 h的發(fā)酵液中的苯乳酸含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 8株乳酸菌培養(yǎng)24 h后發(fā)酵液中的苯乳酸含量Table 1 Phenyllactic acid contents in fermentation broth of 8 strains of lactic acid bacteria cultured for 24 h

由表1可知，初篩獲得的8株乳酸菌都可以產(chǎn)生苯乳酸，但產(chǎn)量較低；添加苯丙酮酸時(shí)苯乳酸產(chǎn)量提高，菌株R21、R69和R410培養(yǎng)24 h時(shí)發(fā)酵液中苯乳酸含量分別為0.943 mg/mL、1.248 mg/mL、1.111 mg/mL，高于其他菌株。MAGNUSSON J等[19]從酸面團(tuán)中分離到植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）21B，其苯乳酸產(chǎn)量為56 mg/L。齊世華等[20]研究表明，植物乳桿菌Lp45在與酸乳發(fā)酵劑一起發(fā)酵酸乳時(shí)，能夠展現(xiàn)出良好的生物保鮮效果。微生物發(fā)酵法已經(jīng)成為目前制備苯乳酸的一種有效方法，但不同菌株的產(chǎn)苯乳酸能力不同。另外，利用微生物轉(zhuǎn)化前體合成苯乳酸，通過(guò)添加外源的前體物質(zhì)，也可以增加苯乳酸的產(chǎn)量。因此，選擇優(yōu)良的菌株和合適的前體物質(zhì)成為研究的重要方向。張莉力等[21]從24株益生菌中篩選到7株苯乳酸產(chǎn)量＞60 mg/L的菌株，其中一株乳酸菌P421的苯乳酸產(chǎn)量甚至可達(dá)80.5 mg/L。李明華等[22]研究了L.plantarum靜息細(xì)胞合成苯乳酸，通過(guò)添加苯丙酮酸對(duì)苯乳酸的生物合成途徑進(jìn)行了優(yōu)化，苯乳酸產(chǎn)量達(dá)到1.68 g/L。因此，選取菌株R21、R69和R410這3株菌進(jìn)行后續(xù)分析。

2.1.2 固態(tài)發(fā)酵豆粕產(chǎn)苯乳酸含量檢測(cè)

不同菌株對(duì)固態(tài)發(fā)酵豆粕產(chǎn)苯乳酸的影響見(jiàn)表2。

表2 不同菌株對(duì)固態(tài)發(fā)酵豆粕產(chǎn)苯乳酸的影響Table 2 Effects of solid-state fermentation of soybean meal by different strains on phenyllactic acid production

由表2可知，在豆粕中添加苯丙酮酸時(shí)，菌株R69固態(tài)發(fā)酵豆粕72 h苯乳酸含量最高，為425.70 mg/kg。STROOM K等[23]從草青貯飼料中分離出一株抗真菌的L.plantarumMi LAB393，苯乳酸的合成能力為94 mg/L。在本研究中，被試菌株均能提高苯乳酸產(chǎn)量，其中菌株R69發(fā)酵豆粕產(chǎn)苯乳酸含量最高，因此，選擇菌株R69進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 菌株R69的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察

菌株R69的形態(tài)學(xué)特征見(jiàn)圖2。由圖2可知，菌株R69在30 ℃培養(yǎng)48 h后，培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)光滑、凸起、濕潤(rùn)、白色、易挑。顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)呈桿狀，單個(gè)、成對(duì)或短鏈排列，從菌落形態(tài)和菌體形態(tài)初步判斷為乳桿菌屬（Lactobacillus）。

圖2 菌株R69的菌落（A）及細(xì)胞（B）形態(tài)Fig.2 Colony (A) and cell (B) morphology of strain R69

2.2.2 生理生化特性試驗(yàn)

菌株R69的生理生化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，菌株R69明膠液化試驗(yàn)、過(guò)氧化氫反應(yīng)、淀粉水解、產(chǎn)生吲哚試驗(yàn)等試驗(yàn)結(jié)果均呈現(xiàn)陰性，不能利用木糖，其他結(jié)果均呈陽(yáng)性，根據(jù)結(jié)果可初步判斷為乳桿菌屬。

表3 菌株R69的生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Physiological and biochemical test results of strain R69

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定

將測(cè)序序列提交至NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，采用MEGA6.0對(duì)同源性較高的序列進(jìn)行分析，采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，菌株R69與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）AJ965482.1聚于同一支，最大序列相似度為99%，因此，菌株R69被鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

圖3 基于16S rDNA基因序列菌株R69的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of strain R69 based on 16S rDNA gene sequence

2.3 苯乳酸產(chǎn)生菌R69固態(tài)發(fā)酵豆粕對(duì)苯乳酸含量的影響

2.3.1 苯丙酮酸添加方式的選擇

苯丙酮酸添加方式對(duì)菌株R69固態(tài)發(fā)酵豆粕產(chǎn)苯乳酸的影響見(jiàn)表4。

表4 苯丙酮酸添加方式對(duì)發(fā)酵豆粕產(chǎn)苯乳酸的影響Table 4 Effect of pyruvate addition mothod on phenyllactic acid content in fermented soybean meal

由表4可知，苯乳酸產(chǎn)量試驗(yàn)1組（固態(tài)發(fā)酵時(shí)添加苯丙酮酸）＞試驗(yàn)2組（發(fā)酵液中添加苯丙酮酸）＞對(duì)照組（未添加苯丙酮酸），且差異顯著（P＜0.05）。WU W Y等[24]對(duì)植物乳桿菌的發(fā)酵條件和生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，優(yōu)化后的樣品產(chǎn)苯乳酸的能力是優(yōu)化前的7.61～13.26倍。本研究中，菌株R69在發(fā)酵豆粕中添加苯丙酮酸比在發(fā)酵液中添加苯丙酮酸提高了44.60%，說(shuō)明固態(tài)發(fā)酵時(shí)直接添加苯丙酮酸產(chǎn)苯乳酸能力優(yōu)于發(fā)酵液中添加苯丙酮酸（P＜0.05）。因此，選擇在固態(tài)發(fā)酵中直接添加苯丙酮酸進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3.2 苯丙酮酸添加量的選擇

苯丙酮酸添加量對(duì)菌株固態(tài)發(fā)酵豆粕產(chǎn)苯乳酸含量的影響見(jiàn)表5。

表5 苯丙酮酸添加量對(duì)發(fā)酵豆粕產(chǎn)苯乳酸的影響Table 5 Effect of phenylpyruvate addition on phenyllactic acid content in fermented soybean meal

由表5可知，與不添加苯丙酮酸的對(duì)照相比，添加0.05%、0.10%和0.15%的苯丙酮酸時(shí)，苯乳酸含量顯著增加（P＜0.05），分別是不添加苯丙酮酸的對(duì)照的1.11倍、1.42倍和1.92倍；添加0.20%苯丙酮酸時(shí)，苯乳酸產(chǎn)量下降，苯乳酸合成量不再隨苯丙酮酸的增加而增加。其原因是苯乳酸含量提高是由于酶促反應(yīng)的結(jié)果，使苯丙酮酸在轉(zhuǎn)氨酶和羥基酸脫氫酶的作用下進(jìn)一步生成苯乳酸[25]，提高幅度下降可能是由于脫氫酶數(shù)量有限，苯丙酮酸的脫氫反應(yīng)受到限制，轉(zhuǎn)化率下降。結(jié)果表明，固態(tài)發(fā)酵豆粕時(shí)，底物苯丙酮酸添加量為0.15%，發(fā)酵72 h苯乳酸含量達(dá)到396.91 mg/kg。因此，選擇苯丙酮酸最適添加量為0.15%進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3.3 不同基質(zhì)發(fā)酵豆粕對(duì)苯乳酸產(chǎn)量的影響

不同基質(zhì)發(fā)酵豆粕對(duì)苯乳酸含量的影響見(jiàn)表6。

表6 不同基質(zhì)對(duì)發(fā)酵豆粕產(chǎn)苯乳酸的影響Table 6 Effects of different substrates on the production of phenyllactic acid from fermented soybean meal

由表6可知，與空白對(duì)照組相比，菌液?jiǎn)为?dú)發(fā)酵豆粕（試驗(yàn)1組）可以顯著提高苯乳酸含量（P＜0.05），高達(dá)218.60 mg/kg，是空白對(duì)照組的14.28倍；以苯丙酮酸為底物時(shí)（試驗(yàn)2組）苯乳酸含量高達(dá)426.03 mg/kg，是試驗(yàn)1組的1.95倍，差異顯著（P＜0.05）；與試驗(yàn)1組相比，添加中性蛋白酶和糖蜜（試驗(yàn)3組）苯乳酸含量顯著提高（P＜0.05），高達(dá)513.89 mg/kg，是試驗(yàn)1組苯乳酸含量的2.35倍；試驗(yàn)4組額外添加苯丙酮酸、中性蛋白酶和糖蜜時(shí)苯乳酸產(chǎn)量最高，高達(dá)624.49 mg/kg。分析原因可能與發(fā)酵豆粕中額外添加的碳源參與了苯乳酸合成反應(yīng)有關(guān)。乳酸菌屬于化能異養(yǎng)型微生物，其營(yíng)養(yǎng)要求復(fù)雜，碳源為菌體提供組成細(xì)胞物質(zhì)或代謝產(chǎn)物中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，李興峰等[26]在研究碳源對(duì)乳酸菌合成苯乳酸的影響時(shí)研究表明，添加葡萄糖可提高苯乳酸的產(chǎn)量，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

3 結(jié)論

通過(guò)溶鈣圈法和牛津杯法從泡菜中分離到一株高產(chǎn)苯乳酸的植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）R69，液體發(fā)酵24 h時(shí)，其苯乳酸產(chǎn)量為1.248 mg/mL，添加苯丙酮酸時(shí)，固態(tài)發(fā)酵豆粕72 h，苯乳酸產(chǎn)量可達(dá)425.70 mg/kg，菌株R69固態(tài)發(fā)酵豆粕時(shí)，添加0.2%蛋白酶、3%糖蜜和0.15%苯丙酮酸可提高苯乳酸含量，苯乳酸的含量達(dá)到624.49 mg/kg。