陳駿飛，唐 蓉，王 暉，劉畢琴，湯回花，李 宏，史 巧*

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，云南 昆明 650223；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201）

泡菜是中國傳統(tǒng)的發(fā)酵食品之一，是將蔬菜浸泡在鹽溶液中，然后經(jīng)過乳酸發(fā)酵而成[1]。芥菜發(fā)酵后有一種特殊鮮味和香味，且含有天然的乳酸菌及其代謝產(chǎn)物，能促進(jìn)胃、腸消化功能，幫助消化，增進(jìn)食欲，深受廣大消費(fèi)者喜愛[2-3]。我國發(fā)酵芥菜的工藝較復(fù)雜，大多工業(yè)化生產(chǎn)仍然是采用高鹽自然發(fā)酵，成品品質(zhì)參差不齊，風(fēng)味質(zhì)量不穩(wěn)定[4-5]。

芥菜發(fā)酵過程中微生物的種類和數(shù)量不斷變化，主要為乳酸菌、醋酸菌和酵母菌等[6]。發(fā)酵前期以腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、魏斯氏菌（Weissellasp.）等異型發(fā)酵乳酸菌為主，與同型乳酸菌相比，它們發(fā)酵產(chǎn)酸能力相對較弱，適用于低酸泡菜發(fā)酵[7]，且能將大量有機(jī)物分解產(chǎn)生CO2、甘露醇和乙醇等含酸較少的代謝產(chǎn)物，賦予泡菜清爽的味道，提升泡菜風(fēng)味[8-9]。為了提高泡菜的感官品質(zhì)，選擇合適的異型發(fā)酵乳酸菌啟動發(fā)酵是必要的。除此之外，酵母菌也是泡菜中常見的微生物類群，廣泛存在于蔬菜發(fā)酵階段，能產(chǎn)生醇類、酯類等風(fēng)味物質(zhì)，賦予泡菜獨(dú)特的醇香和酯香等香氣成分[6，10]。特定酵母菌在較酸的環(huán)境下可更大程度的利用可發(fā)酵糖，并能代謝利用乳酸，有效防止泡菜過酸[11-14]。已有研究用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）共發(fā)酵白菜縮短了發(fā)酵周期，提高了食用安全性[15]，但對泡菜發(fā)酵菌劑的篩選主要還是集中在乳酸菌上，利用酵母菌或乳酸菌與酵母菌共發(fā)酵的研究仍較少。

本研究以分離自不同發(fā)酵蔬菜中的乳酸菌及酵母菌為研究對象，通過比較產(chǎn)酸、耐酸、耐鹽等耐受性指標(biāo)及發(fā)酵特性篩選出性能較好的異型發(fā)酵乳酸菌和酵母菌組合發(fā)酵芥菜，并對發(fā)酵過程的理化指標(biāo)進(jìn)行檢測，得到較優(yōu)的共發(fā)酵菌株組合，以期能夠應(yīng)用于泡菜工業(yè)化接種強(qiáng)化發(fā)酵，提高產(chǎn)品風(fēng)味及品質(zhì)，為高品質(zhì)泡菜的工業(yè)化生產(chǎn)菌劑提供更多的選擇。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與菌株

新鮮芥菜：云南昆明菜市場。本研究所用乳酸菌（L1～L6）及酵母（M1～M6）菌株均從云南不同發(fā)酵蔬菜樣品中分離純化所得，于-80 ℃保存，具體信息見表1。

表1 乳酸菌和酵母菌的來源及鑒定結(jié)果Table 1 Sources and identification results of lactic acid bacteria and yeasts

1.1.2 試劑

鹽酸、乳酸、氫氧化鈉、氯化鈉、乙酸鋅、酚酞、亞鐵氰化鉀、硫酸鋅、亞硝酸鈉（均為分析純）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基、孟加拉紅固體培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HR/T20MM冷凍離心機(jī)：湖南赫西儀器裝備有限公司；CJ-2S超凈工作臺：天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；WPL-125BE電熱恒溫培養(yǎng)箱：天津泰斯特設(shè)備有限公司；ZQZY-88AV全溫振蕩培養(yǎng)箱：上海知楚儀器有限公司；Multiskan GO酶標(biāo)儀：美國Thermo公司；Sartorius PB-10型pH計：上海珂淮儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 耐受性分析

耐酸性測試：吸取活化后的乳酸菌和酵母菌菌液（OD600nm值=1.0）以1%（V/V）的接種量分別接種于pH為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0和5.5的MRS液體培養(yǎng)基和YPD液體培養(yǎng)基中，乳酸菌于37 ℃靜置培養(yǎng)，酵母菌于30 ℃、225 r/min條件下培養(yǎng)24 h，測定菌液的OD600nm值。

耐鹽性測試：吸取活化后的乳酸菌和酵母菌菌液（OD600nm值=1.0）以1%（V/V）的接種量分別接種于NaCl含量為2%、4%、6%、8%、10%和12%的MRS液體培養(yǎng)基和YPD液體培養(yǎng)基中，乳酸菌于37 ℃靜置培養(yǎng)，酵母菌于30 ℃、225 r/min條件下培養(yǎng)24 h，測定菌液的OD600nm值。

1.3.2 乳酸菌產(chǎn)酸性能測試

吸取活化后的乳酸菌菌液（OD600nm值=1.0）以1%（V/V）的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃靜置培養(yǎng)，每4 h取樣測定總酸含量。

1.3.3 酵母菌產(chǎn)氣、產(chǎn)璞測試

產(chǎn)氣：采用杜氏小管發(fā)酵法[13]。吸取酵母菌菌液（OD600nm值=1.0）以1%（V/V）的接種量接種于YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h后，觀察杜氏小管中有無氣泡產(chǎn)生。

產(chǎn)璞：吸取活化后的酵母菌菌液（OD600nm值=1.0）以1%（V/V）的接種量接種于YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h后，觀察試管中的培養(yǎng)基表面是否產(chǎn)生白膜。

1.3.4 芥菜發(fā)酵

發(fā)酵劑制備：從-80 ℃冰箱中取出菌株，乳酸菌于MRS液體培養(yǎng)基37 ℃靜置培養(yǎng)；酵母菌于YPD液體培養(yǎng)基30 ℃、225 r/min搖床培養(yǎng)，均活化2代后生長到對數(shù)生長期，備用。將活化好的菌液于6 000 r/min離心10 min，棄去上清液，用無菌生理鹽水重復(fù)洗菌體3次，收集菌體。最后懸浮于同體積的無菌生理鹽水中，制成菌懸液作為母發(fā)酵劑。

芥菜發(fā)酵：將新鮮芥菜用清水洗干凈、切分后，用體積分?jǐn)?shù)為75%的食品級酒精浸泡10 min，用無菌水沖洗去除酒精，按芥菜與水質(zhì)量體積比2∶3（g∶L）加入泡菜水（含2%白砂糖和3%食鹽的礦泉水），接種2%的乳酸菌和2%的酵母菌，使乳酸菌終濃度＞106CFU/g泡菜，酵母菌終濃度＞105CFU/g泡菜，混合1 min后置于30 ℃恒溫發(fā)酵，以不接菌的自然發(fā)酵組（ZR）為對照，每個試驗作3個平行。

1.3.5 測定方法

pH的測定：采用pH計；總酸含量的測定：參照國標(biāo)GB 12456—2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中總酸的測定》第一法酸堿指示劑滴定法；亞硝酸鹽含量的測定：參照國標(biāo)GB 5009.33—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》第二法分光光度法?；罹鷶?shù)的測定[16]：取泡菜汁液稀釋涂布于MRS固體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)2 d后進(jìn)行乳酸菌計數(shù)；取泡菜汁液稀釋涂布于孟加拉紅固體培養(yǎng)基，30 ℃恒溫培養(yǎng)2 d后進(jìn)行酵母菌計數(shù)。

感官評定：選擇12名經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的人員，采取盲評模式分別對泡菜的色澤、質(zhì)地、香氣和滋味進(jìn)行評分，滿分為100分，去除最高分和最低分后，取平均分為發(fā)酵芥菜最后的得分。具體感官評分標(biāo)準(zhǔn)見表2[17]。

表2 泡菜的感官評價標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation criteria of paocai

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

通過Graphpad Prism8.4.3軟件繪圖；每個試驗設(shè)三個平行，使用IBM SPSS Statistics26進(jìn)行顯著性檢驗，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的耐受性及產(chǎn)酸性能分析

2.1.1 耐酸性分析

乳酸含量對乳酸菌生長活性具有較大影響，異型發(fā)酵乳酸菌可以產(chǎn)生甘露醇等風(fēng)味物質(zhì)，增加異型發(fā)酵乳酸菌的存活時間有利于提高泡菜的感官品質(zhì)[18]。6株乳酸菌的耐酸能力見圖1。

圖1 不同pH條件下乳酸菌的生長情況Fig.1 Growth of lactic acid bacteria at different pH

由圖1可知，隨著培養(yǎng)基pH值的降低，6株乳酸菌的生長均受到不同程度的抑制，耐酸性差異較為明顯。所有菌株在pH值為5.5時OD600nm值最大，pH≤4時幾乎沒有菌株生長。其中，菌株L2和L4在不同pH條件下的生長情況趨于一致，耐酸性均較弱；菌株L5在pH值為4.5～5.5之間的OD600nm值均高于其他菌株，說明耐酸性較好。與趙山山等[19]從貴州泡菜中分離的乳酸菌耐酸性相比，本研究所用乳酸菌均為異型發(fā)酵乳酸菌，所以整體耐酸性較差。

2.1.2 耐鹽性分析

鹽含量對泡菜發(fā)酵過程中微生物數(shù)量的影響較大[20]。6株乳酸菌的耐鹽能力見圖2。由圖2可知，隨著NaCl含量的增加，6株乳酸菌的生長不同程度地受到抑制，當(dāng)NaCl含量達(dá)到10%及以上時，沒有菌株能夠生長；當(dāng)NaCl含量在2%～4%之間時，菌株L2和L4的OD600nm值隨NaCl含量變化較大，抑制較為明顯；菌株L1和L5的OD600nm值隨NaCl含量變化較小，生長能力保持了比較穩(wěn)定的趨勢，耐鹽性能較好。黃道梅等[21]研究也證明乳酸菌受鹽度影響較大，提高食鹽含量抑制了乳酸菌的生長。

圖2 不同NaCl含量下乳酸菌的生長情況Fig.2 Growth of lactic acid bacteria at different NaCl concentrations

2.1.3 產(chǎn)酸性能研究

泡菜發(fā)酵前期的乳酸菌產(chǎn)酸速度過快、產(chǎn)生的酸性物質(zhì)過多會抑制乳酸菌自身及共發(fā)酵酵母菌的生長、繁殖[22]。因此，考察6株乳酸菌的產(chǎn)酸性能，結(jié)果見圖3。

圖3 不同乳酸菌的產(chǎn)酸情況Fig.3 Acid production of different lactic acid bacteria

由圖3可知，6株乳酸菌在生長代謝期間的總酸含量均處于增長趨勢，菌株L1、L2和L3的總酸含量增加較快，菌株L4、L5和L6的總酸含量增加較慢。其中，菌株L2的產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，培養(yǎng)24 h時的總酸含量達(dá)到（24.58±0.08）g/L；菌株L4的產(chǎn)酸能力最弱，培養(yǎng)24 h的總酸含量僅為（7.60±0.05）g/L。

綜上，菌株L5在pH 4.5和4%NaCl含量下耐受性較好且24 h產(chǎn)酸量較少，所以選擇菌株L5進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.2 酵母菌的耐受性及發(fā)酵性能分析

2.2.1 耐酸性分析

真菌群落受酸度影響較大，大多數(shù)真菌的耐酸性較差[20]，為得到適合作為蔬菜發(fā)酵劑的優(yōu)良酵母菌，以耐酸作為酵母菌的初步篩選指標(biāo)之一。6株酵母菌株的耐酸性見圖4。由圖4可知，當(dāng)pH為5.5時，所有菌株生長良好，隨著pH值降低，菌株的生長均受到抑制；當(dāng)pH為4.0時，菌株M1、M2、M3和M4生長良好，菌株M5、M6受抑制較明顯；當(dāng)pH為3.5時，菌株M5、M6則不能生長，菌株M1耐酸性最好。

圖4 不同pH下酵母菌的生長情況Fig.4 Growth of yeasts at different pH

2.2.2 耐鹽性分析

6株酵母菌的耐鹽性測定結(jié)果見圖5。由圖5可知，菌株M3、M5和M6在NaCl含量為6%時生長能力明顯下降，當(dāng)NaCl含量增大到10%時不能生長；菌株M1、M2和M4在NaCl含量在2%～6%時生長較好，NaCl含量增大到8%時生長能力下降明顯，當(dāng)NaCl含量增大到12%時不能生長。結(jié)果表明，菌株M1、M2和M4的耐鹽性相對較好。

圖5 不同NaCl含量下酵母菌的生長情況Fig.5 Growth of yeasts at different NaCl concentrations

2.2.3 發(fā)酵性能分析

一些酵母菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)氣、產(chǎn)璞不僅會影響產(chǎn)品的外觀，也會破壞發(fā)酵蔬菜質(zhì)地，從而影響發(fā)酵產(chǎn)品口感[13]。因此，對6株酵母菌的產(chǎn)氣、產(chǎn)璞情況進(jìn)行測定，結(jié)果見表3。由表3可知，菌株M5產(chǎn)氣嚴(yán)重且少量產(chǎn)璞，菌株M3少量產(chǎn)氣不產(chǎn)璞，菌株M1、M2、M4和M6既不產(chǎn)氣也不產(chǎn)璞。

表3 酵母菌的產(chǎn)氣/產(chǎn)璞能力Table 3 Gas producing and film producing capacity of yeast

綜上，菌株M1、M2和M4在pH 4.0和4%NaCl含量下耐受性較好且不產(chǎn)氣、不產(chǎn)璞，所以選擇菌株M1、M2、M4分別與菌株L5進(jìn)行組合發(fā)酵芥菜。

2.3 乳酸菌與酵母菌共發(fā)酵芥菜組合篩選

2.3.1 pH和總酸含量的變化

pH值和總酸含量是泡菜發(fā)酵程度的兩個重要指標(biāo)，對微生物生長和代謝產(chǎn)物形成具有重要影響[23]。一般認(rèn)為低酸發(fā)酵蔬菜總酸含量（以乳酸計）低于0.3 g/100 g，味道微酸、脆嫩、清香，且含有豐富的活性乳酸菌[7]。芥菜發(fā)酵過程中pH和總酸含量的變化見圖6。

圖6 芥菜發(fā)酵過程中pH（A）及總酸含量（B）的變化Fig.6 Changes in pH(A)and total acid(B)during mustard fermentation

由圖6可知，在發(fā)酵0～3 d，各組pH均急速下降，發(fā)酵第5天開始趨于穩(wěn)定，發(fā)酵結(jié)束時沒有顯著差異（P＞0.05）。整個發(fā)酵過程中各組的總酸含量均逐漸增加，自然發(fā)酵組總酸含量最低，但一直處于上升趨勢，發(fā)酵并未完成。菌株L5和M1共發(fā)酵芥菜第4天時總酸含量最高[（1.84±0.03）g/kg]，發(fā)酵6～10 d增加較為緩慢，發(fā)酵結(jié)束時總酸含量低于其他接菌發(fā)酵組，僅為（2.30±0.03）g/kg。與李文青等[24]用腸膜明串珠菌單獨(dú)發(fā)酵的泡菜（發(fā)酵9 d總酸含量超6 g/kg）相比，本研究添加酵母菌發(fā)酵所得的泡菜總酸含量較低，均達(dá)到低酸泡菜標(biāo)準(zhǔn)[7]。

2.3.2 活菌數(shù)的變化

乳酸菌數(shù)量的增加會使pH值降低和總酸含量增加，同時乳酸菌的生長隨著產(chǎn)酸量的增加而受到抑制[25]。各組芥菜發(fā)酵過程中乳酸菌及酵母菌活菌數(shù)的變化見圖7。

圖7 芥菜發(fā)酵過程中乳酸菌（A）及酵母菌（B）活菌數(shù)的變化Fig.7 Changes in viable count of lactic acid bacteria(A)and yeast(B)during mustard fermentation

由圖7A可知，整個發(fā)酵過程中，乳酸菌活菌數(shù)均呈先增加后減少的趨勢，接菌發(fā)酵組均在發(fā)酵第4天時達(dá)到最高，其中菌株L5和M2共發(fā)酵組的乳酸菌活菌數(shù)最高，為（7.59±0.08）lg（CFU/mL），自然發(fā)酵組在第6天時乳酸菌活菌數(shù)最高達(dá)（7.86±0.03）lg（CFU/mL）；發(fā)酵結(jié)束時菌株L5和M1共發(fā)酵組的乳酸菌活菌數(shù)[（5.71±0.02）lg（CFU/mL）]顯著低于其他三組（P＜0.05），可能是因為酵母菌在泡菜中生長代謝與乳酸菌競爭營養(yǎng)成分，一定程度上抑制了乳酸菌的生長。

由圖7B可知，菌株L5和M1共發(fā)酵組的酵母菌活菌數(shù)呈先增加后減少的趨勢，發(fā)酵第2天時酵母活菌數(shù)最多，為（5.33±0.01）lg（CFU/mL），隨后開始下降，發(fā)酵結(jié)束時酵母活菌數(shù)為（2.41±0.06）lg（CFU/mL）；其他兩個接菌發(fā)酵組的酵母菌活菌數(shù)變化趨于一致，隨著發(fā)酵時間急劇下降，發(fā)酵4～10 d均未檢測到酵母活菌；自然發(fā)酵組整個發(fā)酵過程均未檢測到酵母活菌。發(fā)酵過程中微生物的多樣性、生長和存活取決于對食物生化和物理條件的耐受和反應(yīng)，以及在食物微環(huán)境中適應(yīng)和生存的能力[26-27]。酵母菌M2和M4在培養(yǎng)基中耐酸性較好，但在泡菜中耐酸性較差可能是因為泡菜水中的營養(yǎng)成分沒有培養(yǎng)基豐富，且乳酸菌生長代謝產(chǎn)生的物質(zhì)對其也會有一定的抑制作用。

2.3.3 亞硝酸鹽含量的變化

由圖8可知，各組“亞硝峰”都出現(xiàn)在發(fā)酵第2天，其中自然發(fā)酵組最高為（6.30±0.04）mg/kg，菌株L5和M1共發(fā)酵組含量最低為（2.26±0.04）mg/kg，整個發(fā)酵過程的亞硝酸鹽含量均遠(yuǎn)低于GB 2762—2017《中國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》中規(guī)定的腌漬蔬菜亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)（不超過20 mg/kg）；菌株L5和M1共發(fā)酵組發(fā)酵結(jié)束時的亞硝酸鹽含量僅為（1.35±0.02）mg/kg，顯著低于自然發(fā)酵和菌株L5和M2共發(fā)酵組（P＜0.05），但與菌株L5和M4共發(fā)酵組無顯著差異（P＞0.05），安全性較高。本研究發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量均很低，可能是因為對芥菜進(jìn)行了減菌處理，且乳酸菌發(fā)酵快速酸化，抑制了有害菌的生長代謝和亞硝酸鹽的產(chǎn)生[28-29]。

圖8 芥菜發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量的變化Fig.8 Changes in nitrite content during mustard fermentation

2.3.4 感官評分的變化

酵母菌發(fā)酵蔬菜可以產(chǎn)生有機(jī)酸、醇類、酯類、氨基酸類等物質(zhì)，而且生成的醇類還可以與有機(jī)酸形成酯類，共同增加泡菜的風(fēng)味[30]。泡菜發(fā)酵10 d后進(jìn)行感官評定，結(jié)果見表4。由表4可知，自然發(fā)酵組芥菜未發(fā)酵成熟，色澤偏綠，無泡菜香味且有生澀味，總體評分較低，感官評分為（61.17±2.34）分；菌株L5和M1共發(fā)酵芥菜的顏色透亮、有光澤，有獨(dú)特的壇香味，香氣濃郁且純正，脆度高，品質(zhì)均一；色澤（22.08±0.86）分、質(zhì)地（21.75±0.83）分、香味（20.08±0.76）分、滋味評分（21.08±1.11）分和總評分（85.00±2.12）分均顯著高于其他3組（P＜0.05），可能是因為菌株M1在泡菜水中存活的時間較長，所以產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)更多。

表4 自然發(fā)酵及不同菌株組合發(fā)酵芥菜的感官評分Table 4 Sensory scores of natural fermentation and different strains combination fermentation of mustard

3 結(jié)論

本研究運(yùn)用不同泡菜來源的6株異型發(fā)酵乳酸菌（L1～L6）和6株酵母菌（M1～M6），通過耐鹽、耐酸、產(chǎn)酸等性能篩選出在pH 4.5和4%鹽濃度耐受性較好且24 h產(chǎn)酸量較少[（10.44±0.01）g/L]的腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）L5；以及在pH 4.0和4%鹽濃度耐受性較好且不產(chǎn)氣、不產(chǎn)璞的少孢哈薩克斯坦酵母（Kazachstania exigua）M1、庫德里阿茲威畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）M2和二孢接合酵母（Zygosaccharomyces bisporus）M4。將菌株L5與M1共發(fā)酵芥菜的總酸[（2.30±0.03）g/kg]和亞硝酸鹽含量[（1.35±0.02）mg/kg]更低，乳酸菌活菌數(shù)[（5.71±0.02）lg（CFU/mL）]更少，也存在一定的酵母活菌；感官評分[（85.00±2.12）分]最高。本研究初步證明了不同酵母菌菌株對發(fā)酵過程產(chǎn)生影響，提示選用適合的乳酸菌和酵母菌組合對生產(chǎn)低酸泡菜具有重要意義，為人工接種發(fā)酵低鹽低酸泡菜菌劑的選擇提供了參考依據(jù)。