李潮云，盧 君*，馮海燕，李國輝，唐 平，梁樹英，劉 慧，楊志平，諶良杰，王 彬，焦 琳，張 帥

（1.貴州國臺(tái)酒業(yè)集團(tuán)股份有限公司，貴州 遵義 564501；2.貴州國臺(tái)酒業(yè)集團(tuán)研究院，天津 300410）

醬香型白酒以高粱和小麥為主要原料，采用傳統(tǒng)醬香型白酒釀造工藝，因其突出的醬香和細(xì)膩口感而深受消費(fèi)者的喜愛。高溫堆積發(fā)酵是醬香型白酒生產(chǎn)釀造的重要環(huán)節(jié)，在此過程中，酒醅網(wǎng)羅環(huán)境中的眾多微生物進(jìn)行“二次發(fā)酵”，為入窖發(fā)酵提供了豐富的酶源和風(fēng)味前體物質(zhì)，特別是酵母菌，其數(shù)量和種類在堆積發(fā)酵前后有大幅增加，為后續(xù)糖化和發(fā)酵過程提供動(dòng)力[1-2]。由于成品大曲的發(fā)酵過程經(jīng)過兩次高溫階段，最高溫度能達(dá)到65 ℃左右，高溫使酵母菌數(shù)量變少導(dǎo)致其發(fā)酵力不足，然而堆積發(fā)酵能彌補(bǔ)這個(gè)缺陷[3-4]。另外，堆積發(fā)酵是在開放式環(huán)境中進(jìn)行，其過程涉及到微生物群落與理化指標(biāo)、風(fēng)味物質(zhì)之間復(fù)雜的物理和化學(xué)關(guān)系，驅(qū)動(dòng)著眾多微生物群落的演替，有利于釀酒微生物的富集，對(duì)白酒的產(chǎn)量與質(zhì)量有重要影響[5-6]。

在深化工業(yè)數(shù)字化發(fā)展的今天，白酒行業(yè)需要在傳承傳統(tǒng)釀造工藝的基礎(chǔ)上，持續(xù)賦能傳統(tǒng)行業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)，全面深化白酒現(xiàn)代化、數(shù)字化和標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)[7]?；诖?，醬香型白酒產(chǎn)業(yè)提出了守正創(chuàng)新的理念和可持續(xù)發(fā)展的道路，逐步將人工上甑、潤糧、起堆、卸料等工序轉(zhuǎn)向由機(jī)械代替[8-9]。機(jī)械化生產(chǎn)降低了人員生產(chǎn)勞動(dòng)強(qiáng)度、提高了生產(chǎn)效率，實(shí)現(xiàn)了集約用地和節(jié)能降耗，且同步提升了白酒工藝穩(wěn)定性[10]。曾立等[11]從原酒產(chǎn)質(zhì)量和白酒發(fā)酵過程對(duì)比傳統(tǒng)與半機(jī)械化生產(chǎn)之間的差異，發(fā)現(xiàn)在重要工序上進(jìn)行機(jī)械化升級(jí)，其基酒質(zhì)量不會(huì)脫離傳統(tǒng)白酒酒質(zhì)特點(diǎn)。張建等[12]研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)械化班組糟醅的理化指標(biāo)如水分、酸度、淀粉和還原糖含量和出酒率、優(yōu)質(zhì)品率與傳統(tǒng)班組無顯著性差異（P＞0.05），也不會(huì)對(duì)基酒色譜成分產(chǎn)生不利影響。然而，目前對(duì)于研究智能化和傳統(tǒng)釀造模式下醬香型白酒發(fā)酵過程中酵母菌數(shù)量及理化指標(biāo)變化規(guī)律和差異的報(bào)道較少。

本研究旨在對(duì)比智能化釀造和傳統(tǒng)釀造生產(chǎn)模式下，二輪次堆積發(fā)酵過程酒醅的溫度、酵母菌總數(shù)、酵母活菌數(shù)、水分、酸度、L-乳酸和葡萄糖含量的變化規(guī)律，為白酒智能釀造生產(chǎn)技術(shù)的改進(jìn)提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

醬香型白酒酒醅：取自某酒廠不同車間（智能化車間和傳統(tǒng)車間）二輪次堆積發(fā)酵生產(chǎn)過程。從堆積發(fā)酵0 h、6 h、12 h、18 h……至堆積結(jié)束，采用5點(diǎn)取樣法，在堆積中部約深15 cm處圍著酒醅堆子轉(zhuǎn)一周取樣，將同一發(fā)酵時(shí)間的酒醅樣品混合（500 g）。

1.1.2 試劑

0.1%呂氏堿性美藍(lán)染色液（生化試劑）：上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司；酚酞、氫氧化鈉、氯化鈉、酒石酸鉀鈉、葡萄糖（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

M-100生物傳感儀：深圳市西爾曼科技有限公司；CX43電子顯微鏡：美國奧林巴斯公司；TP-A2000電子分析天平：華志電子科技有限公司；YXQ-75S11立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊有限責(zé)任公司；TGL-16臺(tái)式高速低溫冷凍離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；OGS100烘箱：美國賽默飛公司。

1.3 方法

1.3.1 二輪次堆積發(fā)酵過程中酒醅溫度的測(cè)定

從起堆開始，直至入窖，每天將手持溫度計(jì)探頭插入堆子中部15 cm深度監(jiān)測(cè)，取3個(gè)測(cè)溫點(diǎn)記錄溫度數(shù)據(jù)。

1.3.2 二輪次堆積發(fā)酵過程中酒醅酵母菌總數(shù)和酵母活菌

數(shù)的測(cè)定

采用血球板計(jì)數(shù)法[13]測(cè)定酵母菌總數(shù)，采用美藍(lán)染色法[14]測(cè)定酵母活菌數(shù)。具體步驟為：稱取10 g酒醅樣品，加入含有90 mL無菌水的錐形瓶中，振蕩15 min，取1 mL菌懸液低速離心，吸取上清液進(jìn)行顯微鏡觀察，讀取酵母細(xì)胞數(shù)。將上清液高速離心，經(jīng)美藍(lán)染色后置于顯微鏡中讀取酵母活菌數(shù)。

1.3.3 酒醅理化指標(biāo)的測(cè)定

水分：依據(jù)GB 5009.3—2016《食品中水分的測(cè)定》[15]方法（第一法）檢測(cè)；酸度：依據(jù)DB 34/T 2264—2014《固態(tài)發(fā)酵酒醅分析方法》中和滴定法[16]中酸堿滴定法檢測(cè)；L-乳酸含量和葡萄糖含量：參照馮海燕等[17]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用Origin 2019對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，采用Spearman秩相關(guān)對(duì)非正態(tài)資料進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同車間二輪次堆積發(fā)酵過程中酒醅理化及微生物指標(biāo)的變化

2.1.1 溫度與酵母菌數(shù)量的變化

冬季氣溫普遍較低，微生物代謝所產(chǎn)生的熱量更容易與外界環(huán)境交換而散失，不利于堆子的升溫。為了縮短堆積發(fā)酵的時(shí)間，生產(chǎn)班組采取移堆工藝，遵循“面翻底，底翻面，中心翻四周”的原則，充分混勻后收攏堆子，以達(dá)到快速升溫的目的[18]，但這會(huì)導(dǎo)致酒醅酸度、水分等參數(shù)的變化，從而影響微生物群落的演替[19]。傳統(tǒng)及智能化車間二輪次堆積發(fā)酵過程中酒醅酵母菌總數(shù)、酵母活菌數(shù)和溫度的變化見圖1。

圖1 傳統(tǒng)（A）及智能化（B）車間堆積發(fā)酵過程中酒醅酵母菌總數(shù)、酵母活菌數(shù)和溫度的變化Fig.1 Changes of total yeast counts,viable yeast counts and temperature of fermented grains during stacking fermentation process in traditional(A)and intelligent(B)workshops

由圖1可知，傳統(tǒng)車間從堆積開始至堆積結(jié)束入窖的堆積發(fā)酵時(shí)間為228 h，在138 h進(jìn)行移堆，智能化車間堆積發(fā)酵時(shí)間為126 h，在96 h進(jìn)行移堆。溫度是評(píng)價(jià)高溫堆積發(fā)酵進(jìn)入窖池發(fā)酵的重要指標(biāo)。由圖1A可知，傳統(tǒng)車間酒醅的溫度變化曲線呈“S”形，堆積前期和中期升溫緩慢，這與涂昌華等[20]研究堆積發(fā)酵溫度變化趨勢(shì)一致，堆積后期溫度隨堆積時(shí)間的增加而升高。由圖1B可知，智能化車間酒醅的溫度變化曲線呈“N”形，堆積前期升溫緩慢，堆積中期和后期升溫速率和降溫速率均比傳統(tǒng)車間快。

由圖1亦可知，兩種車間酒醅酵母菌總數(shù)和酵母活菌數(shù)均在106～107CFU/g波動(dòng)變化。傳統(tǒng)車間堆積初期酒醅酵母菌總數(shù)和酵母活菌數(shù)均在107數(shù)量級(jí)；堆積中期升溫緩慢，酵母菌總數(shù)和酵母活菌數(shù)不斷增加，酵母菌生長(zhǎng)旺盛，這為入窖發(fā)酵提供了酵母數(shù)量保障[21]；堆積后期溫度逐漸升高，酵母菌總數(shù)和酵母活菌數(shù)減少，入窖（228 h）時(shí)酵母菌數(shù)量維持在106數(shù)量級(jí)，這可能是由于溫度升高后氧氣減少和發(fā)酵不均衡等因素使酵母菌生長(zhǎng)受限。智能化車間堆積初期酒醅酵母菌總數(shù)和酵母活菌數(shù)均在106數(shù)量級(jí)；堆積中期酵母菌總數(shù)、酵母活菌數(shù)隨著堆積溫度的上升而增加，其數(shù)量基本維持在107數(shù)量級(jí)；堆積后期在84 h時(shí)酵母菌總數(shù)、酵母活菌數(shù)隨著溫度的上升而迅速增長(zhǎng)，隨后溫度超過35 ℃時(shí)又迅速下降至106數(shù)量級(jí)，此時(shí)不耐高溫的酵母菌開始衰亡，96 h移堆后酵母菌總數(shù)和酵母活菌數(shù)隨溫度的升高而增加，入窖（126 h）時(shí)酵母菌數(shù)量在107數(shù)量級(jí)。

2.1.2 酸度和L-乳酸含量的變化

酸度不僅能影響白酒的風(fēng)味，還能調(diào)控微生物的生長(zhǎng)代謝。適宜的酸度有助于入窖發(fā)酵的酒醅糖化和發(fā)酵，也能夠抑制雜菌的生長(zhǎng)[22]。在堆積發(fā)酵后期，酒醅中乳酸桿菌占主導(dǎo)地位，乳酸只由乳酸菌產(chǎn)生[17]，因此測(cè)定L-乳酸含量一定程度上能體現(xiàn)乳酸菌的生長(zhǎng)狀態(tài)[23]。兩個(gè)車間二輪次堆積發(fā)酵過程中酒醅酸度和L-乳酸含量變化見圖2。

圖2 傳統(tǒng)和智能化車間二輪次堆積發(fā)酵過程中酒醅酸度和L-乳酸含量的變化Fig.2 Changes of acidity and L-lactic acid contents in fermented grains during stacking fermentation process of the second rounds in traditional and intelligent workshops

由圖2可知，傳統(tǒng)車間二輪次堆積發(fā)酵過程中酒醅酸度呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化的趨勢(shì)。堆積前期酵母菌、細(xì)菌和霉菌等生酸微生物生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生有機(jī)酸[24]，酸度有所增加，然而隨著堆積溫度上升抑制了生酸微生物的代謝，酸度有所降低。移堆后有機(jī)酸在酯類等風(fēng)味物質(zhì)的合成過程以及生酸微生物的代謝過程中被消耗[19]，酸度從移堆時(shí)的2.17 mL/g下降至入窖（228h）時(shí)的1.51mL/g。智能化車間堆積前期酒醅的酸度變化較為平穩(wěn)，在54 h時(shí)酸度明顯下降至0.63 mL/g。堆積后期酒醅溶氧量增加，霉菌等微生物生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)生的酸性蛋白酶開始分解蛋白質(zhì)，產(chǎn)生各種氨基酸類物質(zhì)使酸度增加[25]，發(fā)酵至114 h時(shí)酸度開始下降，在入窖（126 h）時(shí)酸度為0.87 mL/g。

傳統(tǒng)車間酒醅的L-乳酸含量與酸度變化趨勢(shì)基本一致。堆積前期隨著水汽揮發(fā)，酒醅中乳酸等揮發(fā)性有機(jī)酸含量不斷下降，同時(shí)乳酸菌生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生乳酸，導(dǎo)致L-乳酸含量呈現(xiàn)出波動(dòng)性變化趨勢(shì)。堆積后期L-乳酸含量呈下降趨勢(shì)，至入窖（228 h）時(shí)L-乳酸含量下降至3.73 mg/g，比堆積初期下降了0.87 mg/g。智能化車間酒醅的L-乳酸含量整體呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化的趨勢(shì)，堆積前期L-乳酸含量變化較為平穩(wěn)，堆積84 h時(shí)其含量下降至3.50 mg/g，堆積96 h時(shí)L-乳酸含量又增加至4.86 mg/g，造成其含量明顯波動(dòng)的原因可能是72～84 h堆子升溫過快，揮發(fā)性有機(jī)酸受熱分解，L-乳酸含量下降，隨后84～90 h溫度又迅速下降使其含量開始增加。移堆后L-乳酸含量持續(xù)下降，在入窖（126 h）時(shí)L-乳酸含量為3.60 mg/g。

2.1.3 水分和葡萄糖含量的變化

傳統(tǒng)車間和智能化車間二輪次堆積發(fā)酵過程中酒醅水分和葡萄糖含量的變化見圖3。水分維持在合理范圍內(nèi)有利于堆積發(fā)酵和窖內(nèi)發(fā)酵。由圖3可知，傳統(tǒng)車間酒醅的水分含量在36%～43%波動(dòng)。堆積前期堆子松散，隨著水汽蒸發(fā)，水分自然流失。隨著堆積時(shí)間的增加，微生物的生長(zhǎng)繁殖代謝過程以及淀粉的降解過程產(chǎn)生水分，水分含量呈上升趨勢(shì)，同時(shí)微生物繁殖代謝產(chǎn)生的熱量也會(huì)使水分降低[26-27]。移堆后酒醅充分接觸氧氣，促進(jìn)了微生物的生長(zhǎng)繁殖和酒醅中淀粉的降解，水分含量不斷增加。智能化車間酒醅中水分含量在37%～43%波動(dòng)，其含量在整個(gè)堆積階段變化幅度較小。堆積前期也因水汽蒸發(fā)導(dǎo)致水分含量降低，水分含量隨著微生物的發(fā)酵過程、淀粉的降解過程的變化而變化。與傳統(tǒng)車間不同的是，移堆工藝并未對(duì)智能化車間堆積過程酒醅水分含量產(chǎn)生明顯影響。總之，兩種車間水分含量變化主要與溫度和微生物發(fā)酵情況有關(guān)。

圖3 傳統(tǒng)和智能化車間二輪次堆積發(fā)酵過程中酒醅水分（a，b）和葡萄糖含量（c，d）的變化Fig.3 Changes of moisture (a,b) and glucose contents (c,d) in fermented grains during stacking fermentation process of the second rounds in traditional and intelligent workshops

葡萄糖作為一種能源物質(zhì)可以直接被酒醅中微生物所利用[28]，同時(shí)酒醅中淀粉被微生物分解產(chǎn)生葡萄糖。傳統(tǒng)車間堆積過程中葡萄糖含量整體呈先上升后降低的趨勢(shì)。堆積前期呈上升趨勢(shì)，葡萄糖含量從堆積0 h 的5.75 mg/g上升至堆積138 h的19.23 mg/g，移堆后增大了與酒醅的空氣接觸面積，微生物生長(zhǎng)旺盛從而消耗大量葡萄糖，其含量呈下降趨勢(shì)，入窖（228 h）時(shí)葡萄糖含量下降至9.26 mg/g。智能化車間葡萄糖含量在堆積前期隨著堆積時(shí)間增加而增加，從堆積0 h的10.22 mg/g增加至72 h的18.05 mg/g，但在堆積后期受堆積升溫速率、移堆工藝共同影響下呈“兩次降低，兩次升高”的趨勢(shì)，至堆積終點(diǎn)（126 h）時(shí)葡萄糖含量為11.13 mg/g。

2.2 不同車間二輪次堆積發(fā)酵過程中酒醅微生物及理化指標(biāo)之間相關(guān)性分析

有研究發(fā)現(xiàn)，醬香型白酒二輪次堆積發(fā)酵過程中酒醅理化因子與微生物群落之間關(guān)系密切[29]。因此，采用Spearman相關(guān)性分析堆積時(shí)間、溫度、酵母菌總數(shù)、酵母活菌數(shù)、水分、酸度、葡萄糖和L-乳酸之間的相關(guān)關(guān)系，結(jié)果見圖4。

圖4 傳統(tǒng)（A）及智能化（B）車間二輪次堆積發(fā)酵過程中酒醅微生物及理化指標(biāo)之間的相關(guān)性分析結(jié)果Fig.4 Correlation analysis results between microorganism and physicochemical indexes of fermented grains during stacking fermentation process of the second rounds in traditional (A) and intelligent (B) workshops

由圖4A可知，傳統(tǒng)車間堆積時(shí)間與溫度、水分之間呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；溫度與水分呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；酵母菌總數(shù)與酵母活菌數(shù)呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；葡萄糖與酸度、L-乳酸呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；然而酸度與L-乳酸呈正相關(guān)性但不顯著（P＞0.05）。由圖4B可知，智能化車間堆積時(shí)間與溫度、酵母菌總數(shù)、酵母活菌數(shù)、水分呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與L-乳酸呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；溫度與酵母菌總數(shù)、酵母活菌數(shù)和水分呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與L-乳酸呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；酵母菌總數(shù)與酵母活菌數(shù)之間呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），且兩者均與L-乳酸呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；水分與葡萄糖、L-乳酸呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；酸度與其他7個(gè)指標(biāo)均無顯著相關(guān)性（P＞0.05）；葡萄糖與L-乳酸呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。

綜上所述，傳統(tǒng)和智能化車間在二輪次堆積發(fā)酵時(shí)隨著堆積時(shí)間的增加，溫度和水分含量也隨之增加，說明堆積過程的溫度和水分含量，是判斷堆積發(fā)酵是否結(jié)束的重要參考指標(biāo)，這與生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)一致。兩種車間葡萄糖含量和L-乳酸含量間、酵母菌總數(shù)和酵母活菌數(shù)間均呈現(xiàn)顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），說明在堆積發(fā)酵過程中能影響微生物群落演替的指標(biāo)也是綜合判斷堆積發(fā)酵是否結(jié)束的參考指標(biāo)。因此，在堆積期間需要結(jié)合前期輪次實(shí)際情況控制好起堆溫度，保障前期逐步糊化和酒醅疏松溶氧，同時(shí)密切關(guān)注酒醅水分、發(fā)酵溫度和微生物群落的演替情況。

3 結(jié)論

本研究對(duì)比分析智能化與傳統(tǒng)釀造車間在二輪次堆積過程中酒醅理化指標(biāo)與酵母菌數(shù)量的變化差異，發(fā)現(xiàn)兩種車間酒醅的溫度隨堆積時(shí)間增加而逐漸升高，移堆后溫度呈先下降后升高的趨勢(shì)，傳統(tǒng)車間酒醅溫度變化呈“S”形曲線，而智能化車間則呈“N”形曲線；堆積期間，兩種車間酒醅酵母菌總數(shù)和酵母活菌數(shù)受溫度影響，在106～107CFU/g范圍內(nèi)呈現(xiàn)波動(dòng)性變化，當(dāng)溫度達(dá)到35 ℃時(shí)，傳統(tǒng)車間酵母菌總數(shù)和酵母活菌數(shù)呈下降趨勢(shì)，而智能化車間則呈上升趨勢(shì)；兩種車間酒醅的水分隨堆積時(shí)間的增加整體呈波動(dòng)性上升趨勢(shì)，酸度、L-乳酸和葡萄糖含量整體呈現(xiàn)先增加后降低的波動(dòng)性變化。值得關(guān)注的是，移堆工藝會(huì)對(duì)二輪次堆積過程中的酒醅理化因子和酵母菌群落變化產(chǎn)生影響。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，溫度和水分均與堆積時(shí)間呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），這兩項(xiàng)指標(biāo)可作為判斷發(fā)酵進(jìn)程的重要依據(jù)。此外，葡萄糖含量和L-乳酸含量間、酵母菌總數(shù)和酵母活菌數(shù)間均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。二輪次堆積發(fā)酵的好壞直接關(guān)系到三輪次的基酒質(zhì)量，因此需要按照實(shí)際生產(chǎn)要求，合理控制好起堆溫度，保障前期逐步糊化與酒醅的疏松溶氧，密切關(guān)注理化指標(biāo)和微生物群落的演替情況。然而，堆積發(fā)酵是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，后續(xù)將深入研究在智能化釀造與傳統(tǒng)釀造模式下，全年堆積發(fā)酵、入窖發(fā)酵過程中理化指標(biāo)和關(guān)鍵釀酒微生物的影響，進(jìn)一步解析白酒智能釀造生產(chǎn)中關(guān)鍵指標(biāo)和微生物的變化規(guī)律。