張宇涵,李 超,王玉昊,韋雪敏,許一菲,2

大別班達(dá)病毒(Dabie bandavirus, DBV)是一種新型的布尼亞病毒,2009年由于學(xué)杰等人在中國(guó)首次發(fā)現(xiàn)并分離鑒定[1]。DBV主要通過(guò)蜱蟲(chóng)叮咬傳播給人類,引起發(fā)熱伴血小板減少綜合征(SFTS),臨床表現(xiàn)為高熱、血小板和白細(xì)胞計(jì)數(shù)減少等癥狀,并伴有中樞神經(jīng)癥狀、胃腸道癥狀等[1]。SFTS的地方性散發(fā)流行期為4-10月。2011-2021年,SFTS年平均病死率為5.11%[2]。SFTS在中國(guó)主要流行于河南、湖北、山東、浙江、遼寧等省份[3-4]。

DBV屬于Bunyavirales目,Phenuiviridae科,Bandavirus屬。DBV是單股負(fù)鏈分節(jié)段的RNA病毒,包含L、M、S 3個(gè)片段,分別編碼RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)、糖蛋白(Gp)、非結(jié)構(gòu)蛋白(NSs)和核蛋白(NP)[5]。參與病毒的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄的L基因編碼的RdRp蛋白,是最保守的蛋白,進(jìn)化速率也較慢;S基因編碼的NSs蛋白主要參與宿主的免疫調(diào)節(jié),其系統(tǒng)發(fā)育最為多樣,是保守性最低的蛋白,進(jìn)化速率也較快[6]?？筛鶕?jù)地理位置和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,將DBV劃分為主要包括中國(guó)毒株的中國(guó)譜系(C1-C5),主要包括日本和韓國(guó)毒株的日本譜系(J1-J3)[6,8]。此外,兩個(gè)潛在的亞譜系C6和J4在2017年的一項(xiàng)研究中得到了鑒定[9]。此前有研究表明,雖然中國(guó)和日本地區(qū)的DBV毒株可能源自同一祖先,但他們的親緣關(guān)系較遠(yuǎn),這暗示著很早以前,兩個(gè)地區(qū)的毒株就已開(kāi)始各自獨(dú)立進(jìn)化[8]。重配是分節(jié)段病毒特有的遺傳進(jìn)化事件,當(dāng)多株不同型別的病毒感染同一宿主時(shí),其RNA片段會(huì)進(jìn)行混合,從而產(chǎn)生新特性的病毒。重組和重配事件會(huì)對(duì)病毒的傳播力和致病性產(chǎn)生影響,是病毒進(jìn)化的潛在動(dòng)力[6,10]。選擇壓力指的是外界環(huán)境在生物進(jìn)化過(guò)程中對(duì)其進(jìn)化方向產(chǎn)生影響的作用力。病毒的進(jìn)化選擇壓力來(lái)自于宿主的免疫壓力和生態(tài)環(huán)境的變化。病毒容易通過(guò)自身的突變來(lái)逃避宿主免疫壓力或適應(yīng)新的環(huán)境,繼而發(fā)生適應(yīng)性變化,導(dǎo)致免疫防治或者藥物治療效果不佳。

本研究對(duì)截至2023年7月已發(fā)布的數(shù)據(jù)庫(kù)全部的DBV各片段全長(zhǎng)基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析、基因重組和重配分析以及選擇壓力分析,闡明DBV的基因型流行分布特征,探究DBV進(jìn)化機(jī)制的動(dòng)態(tài)變化,為DBV的預(yù)防控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源 在VIPR數(shù)據(jù)庫(kù)和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載DBV全長(zhǎng)序列(下載于2023年7月),并記錄序列分離時(shí)間、地點(diǎn),以及樣本類型。其中,L片段序列1 407條,M片段序列1 424條,S片段序列1 598條,構(gòu)建以上3個(gè)數(shù)據(jù)集。在Refseq(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/)下載毒株HB29為參考株(基因序列登錄號(hào):NC_018136.1-018138.1)。

1.2 方法

1.2.1 系統(tǒng)發(fā)育分析 對(duì)3個(gè)數(shù)據(jù)集的序列分別進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。使用MAFFT軟件進(jìn)行多序列比對(duì),使用Iqtree軟件以最大似然法分別構(gòu)建基于L、M、S片段的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(bootstraP=1000)[11],并利用R軟件包ggtree對(duì)獲得的最大似然樹(shù)進(jìn)行可視化和修飾[12]。

1.2.2 重組和重配分析 本研究運(yùn)用RDP4(Recombination Detection Program4)軟件對(duì)1.1提及的3個(gè)數(shù)據(jù)集包含的所有序列中的重組事件進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)RDP4內(nèi)置的7種算法(RDP[13]、Bootscan[14]、himaera[15]、Seq[16]、GENECONV[17]、Lard、SiScan)檢測(cè),序列被4種以上方法檢測(cè)為重組陽(yáng)性且P< 0.05時(shí),即被認(rèn)為是潛在重組事件。

基于L、M、S 3個(gè)片段的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果,在含有DBV全長(zhǎng)基因組的1 025株毒株中,篩選含有不同基因型的節(jié)段的潛在重配毒株。

1.2.3 選擇壓力分析 使用Bioedit進(jìn)行L、M、S片段的核苷酸和氨基酸同源性分析,使用Mega11.0軟件的Pairwise distance功能,選擇p-distance模型,分別計(jì)算3個(gè)片段的遺傳距離區(qū)間。

使用Mega11.0軟件的Nei-Gojobori method(No.of Differences)模型分別計(jì)算L、M、S 3個(gè)片段的dN和dS的值。當(dāng)dN/dS> 1時(shí),認(rèn)為發(fā)生正向選擇作用;當(dāng)dN/dS< 1時(shí),認(rèn)為發(fā)生負(fù)向選擇作用。

2 結(jié) 果

2.1 DBV系統(tǒng)發(fā)育分析 L、M、S 3個(gè)片段的進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示,DBV可分為9種基因型別:C1-C6和J1-J3。L、M片段比S片段多出C6型。3個(gè)片段中屬于C2、C4型的序列數(shù)量最多,C2、C3型涵蓋的地域范圍最廣,J1、J2型包含的宿主類型最豐富。中國(guó)的DBV序列主要分布在C譜系,其中河南省和湖北省的優(yōu)勢(shì)基因型是C2,其次是C4型,山東省的優(yōu)勢(shì)基因型為C3型。日本、韓國(guó)的DBV序列以J譜系為主,且優(yōu)勢(shì)基因型均為J1型。同時(shí),J1型的浙江部分毒株和日本毒株在同一個(gè)支系,J2型的河南部分毒株和韓國(guó)毒株在同一支系。

注:ABC分別代表系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)的L、M、S片段。

2.2 DBV重組和重配結(jié)果 經(jīng)RDP4軟件篩選后,在本研究數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)88株毒株中存在98個(gè)潛在重組事件(表1),L、M、S片段分別發(fā)現(xiàn)49、41、28個(gè)重組事件。其中,L片段的重組率最高,為3.48%(49/1 407),M片段的重組率為2.88%(41/1 424),S片段重組率最低,為1.75%(28/1 598)。毒株2011YXX9的3個(gè)片段均發(fā)生了重組,另有11株毒株的兩個(gè)片段發(fā)生了重組,如毒株13-China_Henan-275、毒株HNXY_31、毒株NB32/CHN/2013等。此外,在10株毒株中發(fā)現(xiàn)了存在多次重組事件的節(jié)段,例如毒株2011YSC60、毒株HB2012-171、毒株2011YXX9等。上述結(jié)果表明L片段發(fā)生重組的概率較高,S片段發(fā)生重組的概率較低。人類樣本發(fā)生重組事件的數(shù)量較多(74/88),蜱蟲(chóng)和家畜樣本較少(10/88)。L、M、S片段中,人類宿主檢測(cè)到重組的概率分別為2.5%、2.9%、1.8%,動(dòng)物(蜱蟲(chóng)和家畜)宿主檢測(cè)到重組的概率分別為5.9%、3.0%、5.1%。在非人類宿主中檢測(cè)到重組事件的比例高于人類宿主,且相較之前的研究(各片段均0.99%)[18]有所增加。

表1 DBV發(fā)生重組的毒株統(tǒng)計(jì)

根據(jù)L、M、S三個(gè)片段的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果,在148株重配株中發(fā)現(xiàn)了36種重配基因型(圖2),其中20種類型已被先前的研究報(bào)道過(guò)[6-9]。主要的重配類型為C4C4C2 (32/148)、J2J3J3 (16/148)和C2C1C2(10/148)。絕大部分重配毒株發(fā)現(xiàn)于人源樣本(133/148),有9株來(lái)源于家畜(5/148)、蜱蟲(chóng)(3/148)和小型哺乳動(dòng)物(1/148),此外還有5株來(lái)源于實(shí)驗(yàn)室宿主。同時(shí),大部分動(dòng)物宿主來(lái)源的重配株均來(lái)自日本(3/9)。

圖2 DBV 36種重配株的組合圖Fig.2 Genetic constellation of the 36 potential DBV reassortants

同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)24株同時(shí)發(fā)生重組和重配的毒株(表1)。其中有兩株毒株(SFTSV/Dog/1/Thailand/2022、TNB1590)分離自動(dòng)物宿主。

2.3 DBV基因同源性及遺傳距離分析 DBV毒株間表現(xiàn)出較高的同源性,L、M、S片段的核苷酸同源性分別為94.8%～99.9%,91.8%～99.9%,88.8%～99.9%;RdRp基因、Gp基因、NS基因、NP基因的氨基酸同源性分別為97.9%～100%,92.7%～100%,79.6%～99.6%,86.9%～100%(表2)。

表2 DBV基因核苷酸和氨基酸同源性結(jié)果

DBV 3個(gè)基因的總體遺傳距離分別為0.005、0.015和0.047,L片段的遺傳距離區(qū)間為0.00～0.02,M片段的遺傳距離區(qū)間為0.00～0.06,S片段的遺傳距離區(qū)間為0.00～0.11(表3)。

表3 DBV毒株遺傳進(jìn)化距離分析結(jié)果

結(jié)果表明S片段的核苷酸和氨基酸同源性均低于L、M片段,與其他兩者相比,遺傳距離也較大。

2.4 DBV選擇壓力分析 通過(guò)Mega 11.0軟件對(duì)DBV編碼的4個(gè)蛋白進(jìn)行了全局dN/dS分析(如表4所示),結(jié)果顯示,4個(gè)蛋白的dN/dS值均小于1,表明在進(jìn)化過(guò)程中,4個(gè)蛋白均受到負(fù)選擇壓力的作用。而與L基因、M基因和NP蛋白相比,NS蛋白的dN/dS值最高為0.18。

表4 DBV蛋白的dN/dS比值結(jié)果

3 討 論

由DBV感染引發(fā)的SFTS是我國(guó)目前急需解決的公共衛(wèi)生問(wèn)題,它是一種易誘發(fā)多種臨床病癥且病死率較高的蜱媒傳染病,目前尚無(wú)獲得臨床批準(zhǔn)的SFTS特效抗病毒藥物,支持治療是SFTS患者的主要臨床治療方式[19-21]。自最初發(fā)現(xiàn)以來(lái),DBV已在中國(guó)、日本[22]、韓國(guó)[23]等超過(guò)25個(gè)國(guó)家被發(fā)現(xiàn),在美國(guó)[24]和澳大利亞[25]也相繼發(fā)現(xiàn)了一些新白蛉病毒與DBV存在著密切進(jìn)化關(guān)系。2017年,DBV被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為十大最受關(guān)注的病原之一[26]。該研究通過(guò)測(cè)定公共數(shù)據(jù)庫(kù)的全部DBV基因組序列,對(duì)DBV的遺傳進(jìn)化從全序角度進(jìn)行了深入系統(tǒng)的研究。

本研究驗(yàn)證了絕大多數(shù)DBV型別的分布具有地域性,在DBV的兩大譜系中,C譜系主要包括中國(guó)毒株,J譜系主要包括韓國(guó)和日本毒株[27]。小部分毒株的基因型存在跨地域分布,Yun Y等將中日韓間的DBV基因型分布與候鳥(niǎo)遷徙路線結(jié)合分析,認(rèn)為候鳥(niǎo)可能在DBV的跨地域傳播中發(fā)揮著重要作用[6,28]。

本研究進(jìn)一步證實(shí)了先前研究報(bào)道過(guò)的重組情況[28-29],并在人類宿主與動(dòng)物宿主分離出的DBV毒株中均發(fā)現(xiàn)重組的現(xiàn)象,且動(dòng)物宿主的重組率高于人類宿主。大部分重組DBV毒株是來(lái)自人源樣本,而小部分動(dòng)物宿主來(lái)源的毒株也作為親本序列促進(jìn)或參與了重組的發(fā)生,說(shuō)明動(dòng)物宿主也提供了進(jìn)行重組的場(chǎng)所。在蜱蟲(chóng)、狗、貓、刺猬等不同動(dòng)物宿主來(lái)源的毒株中都發(fā)現(xiàn)DBV重組現(xiàn)象,并且近年來(lái)動(dòng)物宿主發(fā)生重組的比例在增加,這表明DBV可以發(fā)生廣泛的跨物種傳播和感染。本研究發(fā)現(xiàn)了16種未被報(bào)道過(guò)的重配型別,提示DBV的毒力和流行傳播能力正在發(fā)生改變,此發(fā)現(xiàn)對(duì)疾病的控制具有重要意義。重配事件所涉及的不同的地域,表明DBV可能在不同的地域之間進(jìn)行遷移。蜱蟲(chóng)曾被認(rèn)為可能是適合DBV重配株的來(lái)源[26],本研究中重配株的宿主多樣性提示,除蜱蟲(chóng)外,家畜或伴侶動(dòng)物也可能會(huì)加強(qiáng)DBV重配現(xiàn)象的產(chǎn)生。越來(lái)越多的動(dòng)物宿主如狗、貓、牛等參與DBV的重組、重配事件中,使其進(jìn)化機(jī)制的豐富度不斷提高,這對(duì)DBV疫苗的設(shè)計(jì)和SFTS的預(yù)防產(chǎn)生了更大的挑戰(zhàn)。

基因組全編碼區(qū)的選擇壓力分析對(duì)其疫苗和藥物的開(kāi)發(fā)具有較大的指導(dǎo)意義。本研究結(jié)果表明影響DBV進(jìn)化的主要選擇壓力是負(fù)選擇壓力,這一結(jié)論與以往的研究一致[30]。4個(gè)基因的dN/dS值均小于1,其中NS基因的dN/dS值高于其他3個(gè)基因,這可能與NS基因編碼的蛋白有關(guān)。NSs能夠通過(guò)拮抗干擾素而影響毒力,進(jìn)而幫助病毒逃避宿主的抗病毒反應(yīng),從而參與宿主的免疫調(diào)節(jié)[9]。NSs為保守性最低的蛋白,其進(jìn)化速率也較快。相比于其他兩個(gè)片段,NS基因較低的同源性和較遠(yuǎn)的平均遺傳距離進(jìn)一步驗(yàn)證了NSs基因片段具有較高突變能力。由于蛋白中的氨基酸變化可能影響其功能,進(jìn)而影響DBV的感染性和致病力[6],基因型特異性的突變位點(diǎn)是否存在還需要進(jìn)一步被探索。

利益沖突：無(wú)

引用本文格式：張宇涵,李超,王玉昊,等.大別班達(dá)病毒的遺傳進(jìn)化機(jī)制研究[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2024,40(2):171-178. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2024.00.027