王小龍, 張夢寒,湯全英, 鄒文燕

空腸彎曲菌是一種人獸共患病病原菌,可以引起動物和人發(fā)生多種疾病。該菌廣泛存在于鳥、禽、狗、貓等動物體內,可通過污染肉、奶及未經消毒處理的水而導致感染[1]?？漳c彎曲菌是導致人類彎曲菌病的主要病原菌,其次是結腸彎曲菌[2]?？漳c彎曲菌通常定植在禽類和其它牲畜的腸道系統(tǒng)[3],禽肉被認為是人類感染的首要來源?？漳c彎曲菌的感染可引起胃腸炎,其主要臨床癥狀表現(xiàn)為腹瀉、腹痛、發(fā)燒、惡心等,大多數(shù)空腸彎曲菌感染都為自限性感染,某些特定的型別還可以導致吉蘭-巴雷綜合癥和米勒費雪癥候群[4-7]。

空彎多重耐藥的快速增長已成為公共衛(wèi)生關注的焦點。世界衛(wèi)生組織已把氟喹諾酮耐藥彎曲菌列為對人類健康威脅最大的6個高優(yōu)先級耐藥菌之一[8]。全基因組測序技術(Whole genome sequencing, WGS)在菌種鑒定,分型,進化分析和毒力及耐藥特征方面均可應用[9]。故通過瓊脂稀釋法了解蘇州市空腸彎曲菌的耐藥表型,通過全基因組測序分析蘇州市2018-2022年分離的空腸彎曲菌的耐藥基因,毒力基因,及MLST分型等分子特征,建立本地空腸彎曲菌分子分型數(shù)據(jù)庫,為空腸彎曲菌的防治和暴發(fā)溯源等提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 受測的61株空腸彎曲菌,其中53株分離自2018-2022年本市蘇州大學附屬兒童醫(yī)院、蘇州市中醫(yī)院、蘇州大學附屬第一醫(yī)院及蘇州大學附屬第二醫(yī)院等4家哨點醫(yī)院監(jiān)測點的腹瀉病人肛拭子或糞便樣本,另8株分離自本市同期食品安全風險監(jiān)測任務中的生禽肉樣本。對菌株按照年度分離順序賦予實驗室編號。藥敏質控菌株空腸彎曲菌ATCC33560購于廣東環(huán)凱公司。

1.2 主要儀器與試劑 改良CCD瓊脂(英國OXOID公司);血平板(廣東環(huán)凱公司); Campy微需氧產氣袋(日本三菱株式會社);彎曲菌藥敏板(瓊脂稀釋法,青島中創(chuàng)匯科生物公司);DNA Tissue Kit核酸提取試劑盒(德國QIAGEN GmbH公司);Qubit dsDNA BR Assay Kit試劑盒(美國Life Invitrogen公司)。

醫(yī)用恒溫培養(yǎng)箱(大連冰山松洋生物公司);VITEK DENSIMAT濁度儀(法國梅里埃公司);EZ2 Connect 全自動智能樣本提取工作站(馬來西亞QIAGEN GmbH公司);Qubit 3.0 Fluorometer熒光定量儀(美國Life Invitrogen公司);Legend Micro 17 離心機(美國Thermo公司)。

1.3 試驗及分析方法

1.3.1 藥敏試驗 將-80 ℃保存的待測菌株接種改良CCD瓊脂平板,經42 ℃培養(yǎng)48 h后,轉種血平板,用無菌棉簽分別挑取血平板上生長良好的待測菌和質控菌,使用濁度儀測量菌液濃度達到0.5麥氏單位后用無菌稀釋液再進行10倍稀釋(取100 μL的0.5麥氏單位的菌液加到900 μL 的生理鹽水中,充分混勻),將制備好的菌液(約3 μL)用八聯(lián)排無菌加樣器接種于藥敏板微孔的瓊脂表面,加樣后將藥敏板放入置有微需氧產氣袋的培養(yǎng)盒中,37 ℃培養(yǎng)48 h后肉眼觀察藥敏板上每個培養(yǎng)孔中彎曲菌的生長結果,即可得出MIC(minimum inhibitory concentration)值。

所用瓊脂稀釋法彎曲菌藥敏板上包被有7類11種不同濃度抗生素的MH瓊脂(含5%脫纖維羊血),可檢測每種抗生素的MIC值。11種抗生素具體為:紅霉素(ERY)、阿奇霉素(AZI)、萘啶酸(NAL)、環(huán)丙沙星(CIP)、慶大霉素(GEN)、鏈霉素(STR)、氯霉素(CHL)、氟苯尼考(FLO)、四環(huán)素(TET)、泰利霉素(TEL)及克林霉素(CLI)。結果參考2021年美國臨床與實驗室標準化協(xié)會CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute)和美國國家抗生素耐藥檢測NARMS(National Antimicrobial Resistance Monitoring)推薦的耐藥標準進行判定。對三類及三類以上抗生素耐藥者為多重耐藥。

1.3.2 基因組DNA的提取 用接種環(huán)刮取血平板上轉種培養(yǎng)后的新鮮培養(yǎng)物一滿環(huán),置于DNA Tissue Kit核酸提取試劑盒配備的G2 Digestion buffer中重懸,然后使用該提取試劑盒按程序經EZ2 Connect 全自動智能樣本提取工作站提取核酸。用Qubit dsDNA BR Assay Kit試劑,對提取的核酸用Qubit 3.0 Fluorometer熒光定量儀測定其DNA濃度。

1.3.3 測序分析 將61株空腸彎曲菌提取好的基因組DNA送蘇州金唯智生物科技有限公司進行測序。將測序獲得的原始序列(Raw reads)在CLC Genomics Workbench 21.0.4軟件上用Trimming模塊去除adapter及低質量數(shù)據(jù), 然后進行從頭拼裝(De Novo Assembly), 對組裝后的contigs用菌株編號命名。

毒力基因分析基于毒力因子數(shù)據(jù)庫(virulence factors database, VFDB)。耐藥基因的查找采用CLC Genomics Workbench 21.0.4軟件Find Resistance with Nucleotide DB功能,基于CARD數(shù)據(jù)庫和ResFinder數(shù)據(jù)庫。根據(jù)空腸彎曲菌MLST(Multi-locus sequence typing)數(shù)據(jù)庫(https://pubmlst.org/organisms/campylobacter-jejunicoli)確定菌株的ST型別。用Excel 2010進行結果統(tǒng)計和數(shù)據(jù)分析。利用BioNumerics v8.1軟件進行菌株毒力基因聚類圖的繪制。利用CLC Genomics Workbench 21.0.4軟件構建SNP(single nucleotide polymorphisms)系統(tǒng)發(fā)育樹,參考菌株ATCC 33560(GenBank ID:CP019838.1),采用最大似然法。圖形的注釋及美化采用ChiPlot工具[10]。統(tǒng)計學分析采用SPSS 27.0軟件,檢驗水準為α=0.05。

2 結 果

2.1 藥敏試驗及耐藥基因分析 藥敏試驗結果顯示,61株菌對11種抗生素耐藥率排前3位分別是萘啶酸,四環(huán)素和環(huán)丙沙星,耐藥率分別為90.2%,88.5%和73.8%,對紅霉素100.0%敏感,對其余抗生素均有不同程度耐藥。多重耐藥(multi-drug resistance, MDR)率達到41.0%,有多達9種多重耐藥模式,以四環(huán)素類+喹諾酮與氟喹諾酮類+氯霉素類為最常見多重耐藥模式,占多重耐藥的44.0%。耐藥情況最嚴重的菌株對9種抗生素耐藥涵蓋了測試的7個類別。食源性的8株空腸彎曲菌,對萘啶酸和環(huán)丙沙星100.0%耐藥,多重耐藥比例達到了62.5%,與病例來源菌株的多重耐藥率(37.7%)相比無統(tǒng)計學差異(χ2=0.887,P=0.346>0.05)。詳見表1。

表1 61株空腸彎曲菌對11種抗生素藥敏試驗結果

耐藥基因分析結果顯示,61株菌共檢出5類18種耐藥基因。其中cmeA,cmeC,cmeR攜帶率均為100.0%,其次是tetO,攜帶率為98.4%,攜帶率最低的為aph(2″)-If,攜帶率為1.6%。有6.6%的菌株攜帶了全部5類耐藥基因。詳見圖1。

圖1 61株空腸彎曲菌耐藥基因分布熱圖Fig.1 Distribution map of drug resistance genes in 61 Campylobacter jejuni strains

2.2 毒力基因分析 61株空腸彎曲菌共檢出97種毒力基因,涉及粘附、入侵、動力、外毒素、免疫調節(jié)5個功能模塊。所有菌株毒力基因攜帶數(shù)量均在57種以上,最多的達到88種。5大功能模塊中以免疫調節(jié)模塊檢出毒力基因數(shù)量最多,占83.5%。有47種毒力基因在所有菌株中都有檢出,其中包括粘附模塊的cadF、jlpA、PEB1,入侵模塊的ciaB、ciaC,外毒素模塊的cdtB、cdtC,免疫調劑模塊的gmhA、mhB、hldD、hldE、waaC、waaF以及動力模塊的34種毒力基因如flaC、flaD、flaG等。詳見圖2。

注:白色方塊為未檢測,彩色方塊為檢出。動力模塊的flaC、flaD、flaG、flgB、flgC、flgD、flgE、flgF、flgG、flgH、flgI、flgK、flhA、flhB、flhF、flhG、fliA、fliD、fliE、fliF、fliG、fliH、fliI、fliL、fliM、fliN、fliP、fliQ、fliR、fliS、fliY、motA、motB、pflA等34種基因攜帶率均為100.0%,未在上圖列出。

注:MDR為Multiple drug resistance縮寫,CCs為clonal complexes縮寫,ST為sequence type縮寫,雙短線“- -”表示未鑒定出CC型。

2.3 分子分型分析 61株空腸彎曲菌共檢出42個ST型,總體呈現(xiàn)高度多樣性。比例最高的ST型為ST464,占比9.8%,其次是ST6500,占比8.2%。62株菌包含12個克隆群,其中CC21占比最高,為19.7%,其次為CC464,占比14.8%,有14株菌未能通過PubMLST數(shù)據(jù)庫鑒定出克隆群。25株多重耐藥菌,涵蓋了22個ST型。小于14歲的病例樣本共計19株,涉及14個ST型別,多重耐藥率為42.1%,14～60歲的病例樣本共計30株,涉及25個ST型別,多重耐藥率為40.0%,大于60歲的病例樣本為4株,涉及4個ST型別,多重耐藥率為0.0%。食源性樣本共8株,涉及8個ST型別,多重耐藥率為62.5%。不同來源的菌株型別較為分散,無明顯的聚類特征。但同一ST型或CC型的菌株聚類在一起或是很臨近的位置。

3 討 論

空腸彎曲菌在很多國家都是腸炎和腹瀉的主要致病因素之一。彎曲菌的耐藥率在世界范圍內都在增長[11-12]。WHO將氟喹諾酮耐藥彎曲菌列為研究和開發(fā)新抗生素的優(yōu)先對象,優(yōu)先級別為高級[8]。本研究中61株空腸彎曲菌對氟喹諾酮類抗生素CIP的耐藥率達到73.8%,呈現(xiàn)出較高的耐藥性。與Zhang D等報道的北京地區(qū)的醫(yī)院分離株的CIP耐藥率相近[12]。大環(huán)內酯類抗生素是目前臨床推薦治療彎曲菌感染的一線用藥[13]。本研究中菌株對紅霉素完全敏感,但對阿奇霉素有19.7%的耐藥率。之前北京、溫州、上海地區(qū)的空腸彎曲菌分離株對ERY和AZI均有較低水平的耐藥,對紅霉素的耐藥率均在5.0%以下,雖然比例不高但提示已有耐藥菌株存在[12-14]。本研究共發(fā)現(xiàn)了9種多重耐藥模式,多重耐藥率達到了41.0%。以四環(huán)素類+喹諾酮與氟喹諾酮類+氯霉素類為最常見的多重耐藥模式,占總菌株的比例為18.0%,與Zhang P等報道的最常見的多重耐藥模式相同,檢出率也較為接近[15]。本研究中耐藥基因與耐藥表型之間呈現(xiàn)一定相關性,但兩者并非完全一致。菌株對有的抗生素表現(xiàn)為表型耐藥率低于耐藥基因攜帶率,比如四環(huán)素類的表型耐藥率為88.5%,耐藥基因攜帶率為98.4%,可能與部分菌株相關耐藥基因未表達有關[16]。菌株對另外有些抗生素表現(xiàn)為表型耐藥率高于耐藥基因攜帶率,比如沒有發(fā)現(xiàn)林可酰胺類抗生素相應的耐藥基因卻有11.5%的菌株對CLI耐藥。這種情況可能有兩種原因。一是沒有耐藥數(shù)據(jù)庫涵蓋了全部的耐藥基因,每個數(shù)據(jù)庫都有自己的特點和局限性。二是與細菌復雜的耐藥機制有關。細菌在個體層面主要有4種耐藥機制:減少細胞內抗生素的濃度(降低滲透性和提升抗生素的外排);抗生素靶點的修飾或改變;抗生素的修飾或破壞;避開抗生素靶向的代謝途徑[17]。本文的研究對象為革蘭氏陰性菌,有研究表明革蘭氏陰性菌的細胞膜的通透性在低速生長或穩(wěn)定期的細菌耐藥方面發(fā)揮主要作用[18]。對藥物靶點的修飾也能改變細菌的耐藥性[19]。這些耐藥機制都是本研究所沒有的涉及的。值得肯定的是,隨著各項研究的深入開展和耐藥數(shù)據(jù)庫的不斷擴展,耐藥表型與基于基因分析的耐藥推測之間將會有越來越高的一致性。

本研究中的空腸彎曲菌株所檢出的動力相關基因多達41種。對空腸彎曲菌來說動力是必須的毒力因子,細菌通過運動達到腸窩的粘液層[20]。cdtABC編碼CDT(Cytolethal distending toxin) ,能夠通過影響腸隱窩細胞的分裂和分化明顯的促進腹瀉的發(fā)生。61株菌中有一株菌缺少cdtA基因但攜帶cdtB及cdtC基因,其它菌株均有攜帶cdtA、cdtB及cdtC基因。之前有報道從危及生命的腹瀉病例中分離的空腸彎曲菌具有高的CDT檢出率[21-23]。本研究中檢出了LOS (Lipooligosaccharide) 的表達基因多達17種,分別為Cj1135、Cj1136、Cj1137c、Cj1138、cstIII、htrB、neuA1、neuB1、neuC1、waaV、wlaN、gmhA、gmhB、hldD、hldE、waaC、waaF,其中gmhA、gmhB、hldD、hldE、waaC、waaF的攜帶率為100.0%。之前有研究顯示LOS與吉蘭-巴雷綜合征有關[7]。

61株菌共檢出12個CC型,其中CC21為優(yōu)勢型別,與北京地區(qū)的臨床分離株優(yōu)勢型別相同[12]。61株菌共檢出42個ST型別,呈現(xiàn)高度多態(tài)性,之前報道的北京、上海地區(qū)的臨床分離株MLST分型也呈現(xiàn)出了高度多態(tài)性[12, 14]。本研究菌株優(yōu)勢型別為ST464和ST6500占比分別為9.8%和8.2%。兩種優(yōu)勢型別都在多個年份檢出,具有一定的持續(xù)性,并且均為病例樣本。同一ST型別的菌株往往聚類在一起,但ST464型中的菌株2020210和ST7469型中的菌株2020218在WGS聚類分析中更為接近,兩者都是2020年8月在蘇州市兒童醫(yī)院腹瀉病例中分離出來的菌株而且都屬于CC464克隆群。同一ST型的菌株在遺傳進化上不一定比不同ST型的菌株更為接近,因為空腸彎曲菌的ST型僅參考7個管家基因的序列,不能代表整個基因組的差異情況。Lavin A等報道WGS在暴發(fā)事件的調查中比脈沖場凝膠電泳(Pulsed-field gene electrophoresis,PFGE)和MLST分型具有更高的分辨率和更好的與現(xiàn)場流行病學資料的契合度[24]。

本研究顯示蘇州市空腸彎曲菌的MLST型別多樣,菌株普遍攜帶較多的毒力基因,部分耐藥基因檢出率高,呈現(xiàn)較高的多重耐藥性,暫未發(fā)現(xiàn)紅霉素耐藥菌株,可繼續(xù)加強監(jiān)測。

利益沖突：無

引用本文格式：王小龍, 張夢寒,湯全英,等.蘇州市空腸彎曲菌耐藥與分子特征分析[J].中國人獸共患病學報,2024,40(2):116-122. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2024.00.018