王 明，夏 強(qiáng)，孫楊贏，何 俊，潘道東，曹錦軒，周昌瑜

（寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江省動(dòng)物蛋白精深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江寧波 315211）

中國(guó)是畜禽產(chǎn)品生產(chǎn)大國(guó)，2022 年全國(guó)豬牛羊禽屠宰產(chǎn)量達(dá)9227 萬噸，且呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)[1]。骨架是屠宰畜禽后的主要副產(chǎn)物之一，含有人體所需的氨基酸、維生素以及礦物質(zhì)等。骨架中鈣磷比約為2:1[2]，與人體最佳吸收比例相當(dāng)，可作為天然鈣源。豬牛羊骨架有80%以上用于生產(chǎn)煲湯類食品原料[3]，而禽類骨架則被視為廢棄物大量丟棄[4]。這不僅造成資源的浪費(fèi)，而且對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染。因此，開發(fā)高值化利用禽骨的有效技術(shù)十分必要。

盡管生物兼容性與人體骨骼中鈣形態(tài)非常類似，但動(dòng)物骨中的鈣以羥基磷灰石（Hydroxyapatite，HAP）形式存在，無法被人體直接利用[5]。目前，通常采用酸解法和酶解法等方法溶出骨骼中的可溶性鈣，實(shí)現(xiàn)動(dòng)物骨架回收。酸解法是利用強(qiáng)酸破壞骨膠原中的三螺旋結(jié)構(gòu)，使HAP 裸露出來。然后，酸進(jìn)一步與羥基磷灰石作用，將骨鈣轉(zhuǎn)化為可溶性鈣[6]。但酸解法通過破壞骨膠原高級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步釋放磷酸鈣在中性或堿性條件下溶解度不高，而人體對(duì)鈣的吸收主要發(fā)生酸堿環(huán)境呈中性的小腸中，不利于人體的吸收。酶解法則是利用蛋白酶對(duì)骨膠原纖維的分解作用釋放骨鈣。然而，酶解法僅能作用于動(dòng)物骨中的膠原纖維，骨鈣的轉(zhuǎn)化效果十分有限，僅為1/6[7]，仍有大量骨膠原蛋白和以骨礦形式的鈣磷存在于骨渣中，且酶解易使酶解液產(chǎn)生苦味肽，使酶解液呈苦味，不利于后期的開發(fā)利用[8]。

生物發(fā)酵法可通過微生物發(fā)酵作用促使骨泥中鈣的釋放[9]。乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一類能夠利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌微生物，已有研究表明乳酸菌發(fā)酵得到的鈣離子含量顯著高于蛋白酶酶解得到的，并且發(fā)酵后的膠原蛋白可以被降解成小分子肽，更加有利于人體的吸收。閆凜等[8]利用植物乳桿菌發(fā)酵羊骨液發(fā)現(xiàn)鈣離子的釋放與植物乳桿菌的活菌數(shù)呈極顯著正相關(guān)。唐勇等[10]利用乳酸菌發(fā)酵豬骨顯著提升了骨架HAP 中游離鈣釋放。雞骨中蛋白質(zhì)與脂肪的含量高于豬牛羊骨而灰分更低，具有更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[11]。然而當(dāng)前研究中，乳酸菌發(fā)酵雞骨泥釋放鈣的代謝機(jī)理尚未被研究。

因此，本研究構(gòu)建了乳酸菌與雞骨泥的發(fā)酵體系，定量分析發(fā)酵產(chǎn)物中鈣釋放量及其形態(tài)分布、代謝產(chǎn)物組成及其含量變化，并通過多元統(tǒng)計(jì)和KEGG分析乳酸菌代謝通路，旨在揭示骨泥發(fā)酵過程中乳酸菌的代謝與鈣釋放的關(guān)聯(lián)途徑。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

新鮮雞骨架（骨上附少量雞肉）冷凍運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，河南大用實(shí)業(yè)有限公司；木瓜蛋白酶（2000 U/mg）、六偏磷酸鈉、溴化鉀、鹽酸、氫氧化鈉、蔗糖均為分析級(jí)，生工生物工程有限公司；甲酸、乙腈均為色譜級(jí)，美國(guó)Fisher Chemical 公司；MRS 培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；RIPA 細(xì)胞裂解液（強(qiáng)）碧云天生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水；植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarumA3，LP）、羅伊氏乳桿菌（Limosilactobacillus reuteriWQ-Y1，LR）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilusCICC6074，LA）均由浙江省動(dòng)物蛋白食品加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種庫保存。

QM-3SP2 雙行星球磨機(jī) 南京南大儀器有限公司；Five Easy Plus 20 酸堿pH 計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SCIENTZ-IID 超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；Allegra 64R 高速冷凍臺(tái)式離心機(jī) 美國(guó)貝克曼庫爾特有限公司；噴霧干燥機(jī) 上海派勒克儀器設(shè)備有限公司；ACQUITY UHPLC 系統(tǒng) 美國(guó)沃特世公司；三重TOF 5600 MS Xevo G2-XSQ-TOF 美國(guó)沃特世公司；ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）美國(guó)沃特世公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雞骨粉的制備 參考Zuo 等[12]的方法并稍做修改：去除雞骨架上的肉、血、脂肪和骨膜后，121 ℃滅菌15 min，冷卻后重新洗凈骨頭以去除脂肪和肉。然后將磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH=7）以質(zhì)量比3:1 的比例加入骨塊中制備骨液。在骨液中加入木瓜蛋白酶（5000 U/g），50 ℃恒溫水浴中酶解4 h，煮沸10 min 使酶失活，再次清洗以去除雞骨表面的蛋白油脂等。將骨塊放入60 ℃烘箱中干燥12 h后，使用粉碎機(jī)粉碎再過200 目篩，用雙行星球磨機(jī)研磨2.5 h，其中鎬珠、骨粉與水的質(zhì)量比為10:1:3。研磨后的骨顆粒在噴霧干燥機(jī)中干燥，得到雞骨粉。

1.2.2 發(fā)酵雞骨泥及凍干樣品的制備 雞骨泥培養(yǎng)基的制備：將雞骨粉、蔗糖與水按質(zhì)量比5:7:88 混合，pH 調(diào)至6.5，121 ℃滅菌20 min 后，冷卻至室溫制備成骨泥培養(yǎng)基。

雞骨泥發(fā)酵液的制備：取活化后的LP、LR、LA 菌液3 mL 分別接種到100 mL 雞骨泥培養(yǎng)基中，空白組加3 mL 滅菌后的MRS 培養(yǎng)基記為CK，38 ℃下發(fā)酵。

發(fā)酵骨泥凍干樣品制備：取發(fā)酵完成的骨泥發(fā)酵液離心（300×g、4 ℃、5 min）后收集沉淀物，用去離子水反復(fù)洗滌三次，凍干后制成發(fā)酵骨泥樣品，-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 分別取發(fā)酵0、12、24、30、36、42、46、50 和54 h 的雞骨泥發(fā)酵液，用無菌生理鹽水梯度稀釋，選取適宜的梯度，在MRS 固體培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布，38 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)24 h，記錄活菌菌落數(shù)，單位為CFU/mL，并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 乳酸菌發(fā)酵骨泥液pH 和總酸度的測(cè)定 取5 mL 發(fā)酵過程中的雞骨泥液，使用酸堿pH 計(jì)測(cè)定pH；參考Xu 等[13]的方法對(duì)發(fā)酵液的總酸度進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 鈣的分布和含量的測(cè)定 取發(fā)酵完成的雞骨泥發(fā)酵液，離心（300×g、4 ℃、5 min）后保留上清液，得到發(fā)酵液A，-4 ℃冷藏備用。取發(fā)酵液A 經(jīng)離心（4000×g、4 ℃、20 min）后，將上清液通過0.22 μm的水相濾膜以去除菌體及其他難溶性物質(zhì)得到去菌體發(fā)酵液B。取10 mL 發(fā)酵液A 于試管中，加入細(xì)胞裂解液500 μL，混勻后在冰浴中超聲波（350 W、20 min、5 pulse）破碎，使細(xì)胞內(nèi)容物釋放到發(fā)酵液中，離心（10000×g、4 ℃、20 min）后經(jīng)過0.22 μm 水相濾膜過濾得到發(fā)酵液C，使用火焰原子吸收光譜法[14]分別測(cè)定發(fā)酵液A 中的總鈣含量ω，mg/kg；發(fā)酵液B 為乳酸菌胞外鈣含量ω1，mg/kg；發(fā)酵液C 游離態(tài)鈣含量ω2，mg/kg；計(jì)算化合態(tài)鈣含量ω3=ωω2[15]。

1.2.6 發(fā)酵骨泥的能量色散光譜（Energy Dispersive Spectroscopy，EDS）表征 利用能量色散光譜儀對(duì)發(fā)酵骨泥凍干樣品進(jìn)行點(diǎn)掃。取每個(gè)樣品的不同位置測(cè)量鈣和磷含量，計(jì)算平均鈣磷比率和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.7 發(fā)酵骨泥的傅里葉變換紅外光譜（Fourier Transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）表征 取發(fā)酵骨泥凍干樣品與KBr 按1:50 的比例混合研磨，壓成薄膜，并在波長(zhǎng)為4000～400 cm-1范圍之間進(jìn)行傅里葉紅外光譜掃描。

1.2.8 發(fā)酵骨泥的X-射線衍射（X-ray diffractometer，XRD）表征 采用X 射線衍射儀測(cè)定發(fā)酵骨泥凍干樣品的相對(duì)結(jié)晶度。測(cè)試條件為電壓40 kV，管流20 mA，掃描區(qū)域20°～36°，掃描速度為2°/min。

1.2.9 發(fā)酵骨泥產(chǎn)物質(zhì)譜分析 樣品的前處理[16]：取10 mL 骨泥發(fā)酵液，離心（4000×g、4 ℃、5 min）后收集上清液并通過0.22 μm 濾膜。取5 mL 上述濾液于EP 管中，加入20 μL 內(nèi)標(biāo)（1000 ng/mL 水楊酸溶液）混勻后，轉(zhuǎn)移至LC 進(jìn)樣小瓶，進(jìn)行LC-MS/MS 分析。

液相色譜和質(zhì)譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱；柱溫為45 ℃；流速為0.4 mL/min；流動(dòng)相為0.1%甲酸（A）和含0.1%甲酸的乙腈（B）的混合物。色譜梯度程序：0～2 min（A:B=98:2）、2～4 min（A:B=75:25）、4～7.5 min（A:B=40:60）、7.5～9.5 min（A:B=10:90）、9.5～12.7 min（A:B=1:99）、12.7～16 min（A:B=98:2）；掃描范圍為50～1000 m/z。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用IBM SPSS 軟件包（Version 25.0）對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05 差異顯著，P＜0.01 差異極顯著。質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)使用Progenesis QI（Version 2.3）處理并對(duì)比代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫（HMDB，https://www.hmdb.ca/）和Chemspider 數(shù)據(jù)庫（https://www.chemspider.com/）進(jìn)行匹配獲得代謝物信息。通過聚類分析和PCA 分析確定差異代謝物。查找通路數(shù)據(jù)庫（https://www.metaboanalyst.ca/）、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，https://www.kegg.jp/）數(shù)據(jù)庫確定差異代謝富集的代謝通路。

2 結(jié)果與分析

2.1 骨泥中菌落生長(zhǎng)曲線、pH 及總酸變化

生長(zhǎng)曲線反映了細(xì)菌數(shù)量、生長(zhǎng)狀況和代謝情況。如圖1A 所示，LP、LR 和LA 的活菌數(shù)在0～12 h 呈對(duì)數(shù)型增長(zhǎng)，12 h 后趨于平穩(wěn)，生長(zhǎng)速度放緩，進(jìn)入穩(wěn)定期；LA 組和LR 組的活菌數(shù)在12～30 h保持相對(duì)穩(wěn)定，發(fā)酵30 h 后逐漸下降，而LP 組的活菌數(shù)在12～50 h 保持相對(duì)穩(wěn)定，發(fā)酵50 h 后逐漸下降。在三個(gè)接菌處理組中，LA 處理組在發(fā)酵24、30、36 h 時(shí)活菌數(shù)量極顯著高于LP 和LR 處理組（P＜0.01），在發(fā)酵30 h 時(shí)，LP、LR 和LA 活菌數(shù)均達(dá)到最大值，分別為22.7、28.5 和33.2×107CFU/mL；而在整個(gè)發(fā)酵過程中LP處理組的活菌數(shù)極顯著低于LA 和LR 處理組（P＜0.01）。發(fā)酵過程的pH 和總酸能反映乳酸菌的產(chǎn)酸能力以及菌體耐受能力變化。如圖1B 所示，雞骨泥發(fā)酵液初始pH 約為6.1，在0～30 h 的發(fā)酵期間，3 個(gè)接菌處理組在發(fā)酵過程中pH 均下降，30 h 后逐漸穩(wěn)定；在發(fā)酵第30 h 時(shí)LA 組、LP 組、LR 組的pH 分別為4.43、4.68 和4.67，LA 組pH 最低說明LA 產(chǎn)酸能力最強(qiáng)。如圖1C 所示，3 個(gè)接菌處理組的發(fā)酵液初始總酸含量為0.81 g/L，在0～30 h 內(nèi)，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，總酸含量迅速增加，30 h 后逐漸穩(wěn)定；發(fā)酵30 h 時(shí)，LA、LP 和LR 處理組的總酸含量分別為5.60、3.76 和3.75 g/L，其中LA 組的總酸含量顯著高于LP 組和LR 組（P＜0.05）。以上結(jié)果說明三株乳酸菌均能較好的利用骨泥進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖并產(chǎn)生酸類物質(zhì)，且嗜酸乳桿菌在骨泥中的生長(zhǎng)繁殖能力和產(chǎn)酸能力優(yōu)于羅伊氏乳桿菌和植物乳桿菌。

圖1 乳酸菌的生長(zhǎng)曲線（A）以及發(fā)酵過程中pH（B）和總酸（C）的變化Fig.1 Growth curve of lactic acid bacteria (A),and the changes in pH (B) and total acid (C) during bone paste fermentation

骨中含有豐富的礦物質(zhì)和膠原蛋白，為乳酸菌的生長(zhǎng)和繁殖提供了必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[17]；而蔗糖可為乳酸菌提供能量[18]。在本研究中，三株乳酸菌的最大活菌數(shù)均超過了108CFU/mL，說明乳酸菌能夠利用骨泥中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖并呈現(xiàn)良好的產(chǎn)酸能力和耐酸性。在發(fā)酵過程中，乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的代謝物也會(huì)影響乳酸菌的活力；隨著發(fā)酵的進(jìn)行，底物逐漸消耗、代謝產(chǎn)物不斷積累、總酸含量升高、pH下降，從而使得乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖受到抑制，發(fā)酵逐漸進(jìn)入后期階段[19]。在發(fā)酵期間，三個(gè)處理組的pH 逐漸降低、總酸含量不斷上升；在30 h 時(shí)，pH 和總酸含量趨于穩(wěn)定，且活菌數(shù)達(dá)到最大值，因此，以30 h 作為發(fā)酵終點(diǎn)，進(jìn)行后續(xù)理化指標(biāo)分析。

2.2 骨泥液中鈣分布、鈣形態(tài)以及鈣磷比分析

三株乳酸菌發(fā)酵骨泥的鈣分布如圖2A 所示，發(fā)酵完成時(shí)（30 h），LP、LR 和LA 處理組的總鈣含量都顯著高于CK 組（P＜0.05）。與CK 組相比，LR 組、LP 組和LA 組總鈣含量分別從CK 組中181.33 mg/kg上升至1176.67、1310.00 和1916.67 mg/kg。在LA組和LR 組中，去除骨泥中乳酸菌菌體后，總鈣含量顯著下降（P＜0.05），說明這兩株乳酸菌具有一定的富集鈣的能力。骨泥發(fā)酵液中不同形態(tài)的鈣含量如圖2B 所示，三個(gè)處理組的游離鈣含量均顯著高于CK 組（P＜0.05）；CK 組中游離鈣含量為25.37 mg/kg，LR 組、LP 組和LA 組游離鈣含量分別是CK 組的40.60 倍、50.19 倍和74.62 倍。相比較于CK 組，LR組中化合態(tài)的鈣含量無顯著差異，而LA 組和LP 組的化合態(tài)鈣含量低于CK 組（P＜0.05）。在3 個(gè)處理組中，游離鈣含量均顯著高于化合態(tài)鈣含量（P＜0.05），說明游離鈣是骨泥發(fā)酵液中主要存在形態(tài)，其中LA 組中游離鈣含量（1893.33 mg/kg）顯著高于其他處理組。發(fā)酵骨泥鈣磷比如圖2C 所示，相比于CK 組（2.10±0.11），LA（1.68±0.17）和LR（1.82±0.19）組的鈣磷比值顯著降低（P＜0.05），這可能是由于乳酸菌的發(fā)酵使得骨泥中化合態(tài)的鈣轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x鈣。這些結(jié)果表明，經(jīng)過乳酸菌的發(fā)酵，溶液中的游離鈣濃度顯著升高，且嗜酸乳桿菌鈣釋放能力最強(qiáng)。

圖2 乳酸菌發(fā)酵骨泥液中的鈣分布（A）、鈣形態(tài)（B）及發(fā)酵骨泥鈣磷比（C）Fig.2 Calcium distribution (A),calcium morphology (B) and calcium-phosphorus ratio (C) of fermented bone paste

乳酸菌可通過發(fā)酵作用分解骨泥來釋放游離鈣[20]。本研究中，各處理組的總鈣含量和游離鈣含量在發(fā)酵完成時(shí)均顯著高于CK 組（P＜0.05），其中LA 組總鈣含量和游離鈣含量最高，分別為對(duì)照組的10.57 倍和74.62 倍，其主要原因可能是LA 產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，能分解更多HAP[21]。此外，相比于CK 組，LP 組和LA 組在發(fā)酵完成時(shí)的化合態(tài)的鈣顯著下降（P＜0.05），可能是因?yàn)楣悄嘀谢蠎B(tài)的鈣等經(jīng)過發(fā)酵轉(zhuǎn)化為游離鈣[9]。鈣磷比結(jié)果表明，LP、LR 和LA 組骨泥樣品表面的Ca/P 比值由CK 組的2.10 分別下降至1.93、1.82 和1.68，這進(jìn)一步表明了發(fā)酵使得骨粉中的磷酸鈣轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x鈣。綜上所述，雞骨泥液中鈣的相對(duì)含量降低，而游離鈣含量增高，說明乳酸菌通過產(chǎn)酸使雞骨中的HAP 分解，使得鈣釋放到骨泥發(fā)酵液中。

2.3 傅里葉紅外光譜與X 射線衍射圖譜分析

傅里葉紅外光譜可以作為識(shí)別雞骨泥中化學(xué)鍵和官能團(tuán)特征變化的工具[22]。紅外光譜如圖3A 所示，與CK 組相比，LA 組、LR 組和LP 組在3379、2926 和1050 cm-1波段處的特征帶峰強(qiáng)度減弱，在1109 cm-1波段出現(xiàn)新吸收峰，其中LA 組在1645 cm-1特征峰紅移至1593 cm-1處，這可能是由于發(fā)酵使得雞骨泥的官能團(tuán)發(fā)生了改變[23]。圖3B為處理組和對(duì)照組骨泥樣品的X 射線衍射圖譜，對(duì)比JCPDS 卡號(hào)09-0432 可知，所有的樣品中HAP 都以無定型態(tài)形式存在。相比于CK 組，在衍射角2θ=23.8°（米勒指數(shù)111），LA 組衍射峰度降低，LP 組與LR 組特征峰分別藍(lán)移至23.4°和23.2°處；LA 組在衍射角2θ=25.8°（002）和2θ=32.0°（211）處較CK 組的衍射峰變小、變寬。這些結(jié)果表明乳酸菌發(fā)酵使得雞骨泥發(fā)生了化學(xué)結(jié)構(gòu)變化。

紅外光譜中，在3379、2926 和1050 cm-1波段處的吸收峰分別與O-H、P-O 和PO43-有關(guān)。本研究中，相比于CK 組，處理組位于3379 cm-1峰強(qiáng)度減弱可能歸因于乳酸菌發(fā)酵使得骨中結(jié)合水減少[24]；2926 和1050 cm-1波段吸收強(qiáng)度減弱可能由于乳酸菌發(fā)酵作用使得HAP 分解從而促進(jìn)鈣的釋放；位于1109 cm-1處的特征峰與P=O 有關(guān)，三組實(shí)驗(yàn)組在此處產(chǎn)生新的峰值，可能是由于HAP 在分解過程中產(chǎn)生了新的含磷化合物。位于1600～1700 cm-1處的特征峰主要由C=O（酰胺I 帶）的拉伸振動(dòng)產(chǎn)生，這與蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化有關(guān)[25]，與LR 和LP 相比，LA 組在1645 cm-1發(fā)生紅移現(xiàn)象，這可能是發(fā)酵酶解作用使得雞骨膠原蛋白分解，促進(jìn)了羥基磷灰石進(jìn)一步分解，從而釋放更多離子鈣。X 射線衍射中，峰型的尖銳程度可反映HAP 結(jié)晶度大小[26]。圖3B中，整個(gè)光譜較粗糙，未出現(xiàn)完整的晶形結(jié)構(gòu)，說明發(fā)酵底物呈無定形態(tài)[27]。衍射角2θ=23.8°處，相比于CK 組，LA 組峰度值降低、LP 組和LR 組在衍射峰發(fā)生藍(lán)移，說明由于乳酸菌發(fā)酵使HAP 分解，晶相純度降低，即發(fā)酵產(chǎn)生的酸中大量質(zhì)子置換出了鈣，衍射峰減弱；與其他三組相比，LA 組在2θ=25.8 與2θ=32.0 處的衍射峰降低，說明LA 組骨鈣中HAP晶相變化最大，推測(cè)LA 組發(fā)酵作用釋放出更多可溶性鈣。Sharma 等[28]將二氧化鈦摻雜純度較高的HAP后發(fā)現(xiàn)，HAP 中的鈣被鈦取代純度降低，其XRD 圖譜也發(fā)生衍射峰偏移，峰值變低。以上結(jié)果表明，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，骨泥中化合物的官能團(tuán)發(fā)生改變，HAP 晶相結(jié)晶度降低，鈣的化學(xué)形態(tài)發(fā)生改變，發(fā)酵體系中游離鈣含量增大。

2.4 主成分分析（PCA）、聚類熱圖分析以及代謝通路分析

采用LC-MS/MS 對(duì)發(fā)酵骨泥中的小分子物質(zhì)進(jìn)行分析，共鑒定到37 種發(fā)酵代謝物。主成分（PCA）分析這些代謝物在不同處理間的特征發(fā)現(xiàn)，如圖4A 可知PCA 共產(chǎn)生三個(gè)有效主成分，其中第一主成分（PC1）、第二主成分（PC2）和第三主成分（PC3）特征值分別為25.61、7.65 和1.93，方差貢獻(xiàn)率分別為69.2%、20.7%和5.2%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為95.13%，表明前3 個(gè)主成分有效區(qū)分了不同處理組間發(fā)酵骨泥代謝物的特征；PCA 圖顯示，LP、LA、LR 組與CK 組完全分開，說明各處理組中代謝物的組成或含量與CK 組存在顯著差異。分析貢獻(xiàn)PCA模型前三個(gè)主成分的貢獻(xiàn)因子發(fā)現(xiàn)丙酮酸（Pyruvate）、CDP、核糖核酸（Riboxin）、5'-CMP 和木酮糖（L-Xylulose）是PC1 的重要貢獻(xiàn)因子；胸苷（Thymidine）、瓜氨酸（Citrulline）、脫氧肌苷（Deoxyinosine）、絲氨酸（L-Serine）、天冬氨酸（LAspartic Acid）、5-羥基-L-色氨 酸（5-Hydroxy-Ltryptophan）、精氨酸（L-Arginine）、精氨酸磷酸鹽（LArginine phosphate）、胞苷（Cytidine）和乳酸（Lactic acid）是PC2 的重要貢獻(xiàn)因子；甲?；?5-羥基犬尿胺（Formyl-5-hydroxykynurenamine）、L-甲?；虬彼幔↙-Formylkynurenine）、蔗糖（Sucrose）、dTMP 和乳清酸核苷（Orotidine）是PC3 的重要貢獻(xiàn)因子。為了更清楚地呈現(xiàn)這些貢獻(xiàn)因子在不同處理組間的差異變化，貢獻(xiàn)主成分分析中前三個(gè)主成分的代謝物的聚類熱圖如圖4B 所示，CK 組的樣本聚集為一大類，三個(gè)處理組的樣本聚集為另一大類，這與主成分分析的結(jié)果一致。相比于CK 組，三個(gè)處理組中木酮糖和蔗糖的含量顯著下降（P＜0.05），而丙酮酸和乳酸的含量顯著增加（P＜0.05）；相比于CK 組，三個(gè)處理組中游離氨基酸及衍生物如絲氨酸和5-羥基-L-色氨酸顯著增加，而精氨酸、精氨酸磷酸鹽、5'-CMP、dTMP和乳清酸核苷等顯著下降（P＜0.05）。PCA 分析和聚類熱圖分析共同表明，有機(jī)酸、游離氨基酸、糖類物質(zhì)和核苷類物質(zhì)是影響乳酸菌發(fā)酵骨泥重要代謝物。

圖4 發(fā)酵雞骨泥的代謝產(chǎn)物主成分分析（A）和聚類熱圖分析（B）Fig.4 Principle component analysis (A) and cluster analysis (B) of metabolites of fermented bone paste

為了進(jìn)一步了解發(fā)酵骨泥中關(guān)鍵代謝物與乳酸菌的生物活性和發(fā)酵性能的關(guān)系，將關(guān)鍵代謝產(chǎn)物與乳酸菌的活菌數(shù)、pH、總酸度值以及游離鈣含量進(jìn)行相關(guān)性分析（r＞0.5 或＜-0.5，P＜0.05）。如圖5 所示，有機(jī)酸（丙酮酸和乳酸）、核苷類物質(zhì)（核糖核酸、脫氧肌苷、CDP 和胞苷）和氨基酸（絲氨酸、瓜氨酸）等與活菌數(shù)呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），糖類（蔗糖和木酮糖）、核苷類物質(zhì)（5'-CMP、dTMP 和乳清酸核苷）和氨基酸（精氨酸）等與活菌數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)P＜0.05）；有機(jī)酸（乳酸和丙酮酸）、核苷類物質(zhì)（核糖核酸、脫氧肌苷、CDP 和胞苷）和氨基酸（絲氨酸、瓜氨酸）等與游離鈣含量呈顯著正相關(guān)P＜0.05），糖類（乳酸和丙酮酸）、核苷類物質(zhì)（5'-CMP 和乳清酸核苷）和氨基酸（精氨酸）等與鈣釋放量呈顯著負(fù)相關(guān)P＜0.05）。這表明三株菌可以利用糖類物質(zhì)發(fā)酵骨泥促進(jìn)酸類物質(zhì)的產(chǎn)生，從而促進(jìn)游離鈣的釋放。

圖5 差異代謝物與主要生理指標(biāo)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 Network diagram of the relationship between differential metabolites and key physiological indicators

將上述差異代謝物導(dǎo)入至KEGG 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配，獲取發(fā)酵過程中關(guān)鍵代謝物參與的代謝通路信息，進(jìn)而評(píng)估關(guān)鍵代謝物的來源及其對(duì)鈣釋放的影響。如圖6 所示，通過通路影響因子＞0.08 和P＜0.05對(duì)代謝通路進(jìn)行篩選發(fā)現(xiàn)，三個(gè)處理組（LA、LR、LP）的差異代謝物所富集到的代謝通路相似，主要有嘧啶代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、糖酵解、丙酮酸代謝、?；撬岷痛闻；撬岽x和TCA 循環(huán)。這些富集的代謝通路表明，三個(gè)處理組的差異代謝物主要與菌體生長(zhǎng)代謝有關(guān)。

圖6 植物乳桿菌組（A）、羅伊氏乳桿菌組（B）、嗜酸乳桿菌組（C）發(fā)酵雞骨泥代謝通路Fig.6 Metabolic pathways of fermented chicken bone paste by Lactobacillus plantarum group (A),Lactobacillus reuteri group (B),Lactobacillus acidophilus group (C)

乳酸菌利用蔗糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖和果糖，再通過糖酵解將葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸，繼而通過丙酮酸途徑合成乳酸[29]，乳酸菌也可將木酮糖通過丙酮酸等途徑轉(zhuǎn)化為乳酸[30]。蔗糖和木酮糖含量與活菌數(shù)呈負(fù)相關(guān)，而丙酮酸和乳酸含量與活菌數(shù)呈正相關(guān)，說明乳酸菌利用蔗糖和木酮糖作為碳源，通過糖酵解途徑和丙酮酸途徑等代謝途徑產(chǎn)生丙酮酸和乳酸等有機(jī)酸。熊濤等[31]在發(fā)酵泡菜時(shí)發(fā)現(xiàn)乳酸菌可通過異型乳酸發(fā)酵將蔗糖轉(zhuǎn)化為乳酸。劉洋[32]發(fā)現(xiàn)利用木酮糖代替蔗糖作為碳源發(fā)酵牛乳后產(chǎn)生大量乳酸。因此，乳酸菌可以將糖類物質(zhì)經(jīng)過糖酵解和丙酮酸途徑轉(zhuǎn)化為乳酸。

有機(jī)酸對(duì)動(dòng)物骨骼中HAP 分解的機(jī)制主要包括：氫離子促進(jìn)溶解（酸解）；配體控制的溶解（通過有機(jī)酸與磷灰石復(fù)合，從而打破金屬氧鍵）[33-35]。代謝物中，丙酮酸作為乳酸的前體物質(zhì)，可通過糖酵解途徑和TCA 循環(huán)經(jīng)乳酸脫氫酶（LDH）轉(zhuǎn)化為乳酸。在發(fā)酵完成時(shí)，乳酸菌代謝產(chǎn)生乳酸和丙酮酸與活菌數(shù)和鈣釋放量呈正相關(guān)，說明有機(jī)酸可能是鈣離子含量增高的關(guān)鍵性物質(zhì)。其中三組乳酸菌發(fā)酵前后乳酸含量發(fā)生顯著變化，LP、LA 和LR 組中的乳酸含量分別是CK 組中的16.18、45.27、16.50 倍，說明乳酸是影響鈣離子釋放最重要的酸性物質(zhì)。唐勇等[9]利用乳酸菌發(fā)酵豬骨后發(fā)現(xiàn)，豬骨發(fā)酵液中乳酸含量與游離鈣呈正相關(guān)。陳黎洪等[35]利用干酪乳桿菌CICC20296 菌株產(chǎn)生的乳酸可使骨泥中Ca2+濃度由0.10 mg/g 增加至10.12 mg/g。這說明乳酸菌在發(fā)酵雞骨泥過程中，通過糖酵解、TCA 等途徑產(chǎn)生乳酸，從而促進(jìn)骨中HAP 分解并釋放出游離鈣。

核苷類物質(zhì)和氨基酸在維持生物細(xì)胞正常生命活動(dòng)中不可或缺。核苷類物質(zhì)廣泛存在于乳酸菌中，如5'-CMP、dTMP 和胞苷主要通過參與嘧啶代謝和嘌呤代謝途徑影響DNA 和RNA 的合成[36]。氨基酸不僅作為蛋白質(zhì)的組成單位，可以維持乳酸菌生命活動(dòng)，也可通過酶轉(zhuǎn)化為乳酸。乳酸菌可利用脫氨酶、脫羧酶將絲氨酸和瓜氨酸等轉(zhuǎn)化為丙酮酸，丙酮酸繼而進(jìn)入TCA 循環(huán)產(chǎn)生乳酸，促進(jìn)鈣的釋放[37]。因此，核苷類物質(zhì)和氨基酸類物質(zhì)不僅可以維持菌株正常的生長(zhǎng)繁殖過程，也可以為有機(jī)酸的產(chǎn)生提供前體物質(zhì)。綜上，三株乳酸菌通過糖酵解途徑降解發(fā)酵骨泥中的糖類，并通過TCA 循環(huán)產(chǎn)生有機(jī)酸，從而提升雞骨泥液中游離鈣的含量。這可能是LA 組游離鈣和有機(jī)酸含量最高的重要原因。

3 結(jié)論

嗜酸乳桿菌、羅伊氏乳桿菌和植物乳桿菌均能較好的利用骨泥進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖并產(chǎn)生大量的酸類物質(zhì)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，嗜酸乳桿菌發(fā)酵組的總酸含量顯著高于其他處理組（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，羅伊氏乳桿菌發(fā)酵組、植物乳桿菌發(fā)酵組和嗜酸乳桿菌發(fā)酵組總鈣含量分別從對(duì)照組的181.33 mg/kg 增加至1176.67、1310.00 和1916.67 mg/kg；游離鈣含量分別是對(duì)照組的40.60 倍、50.19 倍和74.62 倍，且嗜酸乳桿菌發(fā)酵組的游離鈣含量顯著高于羅伊氏乳桿菌和植物乳桿菌發(fā)酵組（P＜0.05），這表明乳酸菌發(fā)酵顯著增加了骨泥中鈣的釋放。紅外光譜和X 衍射結(jié)果表明，發(fā)酵骨泥中HAP 主要以無定型形態(tài)存在，與對(duì)照組相比，羅伊氏乳桿菌發(fā)酵組、植物乳桿菌發(fā)酵組和嗜酸乳桿菌發(fā)酵組中HAP 的特征峰在2926 和1050 cm-1處的強(qiáng)度明顯降低。經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，骨泥中共鑒定出37 種代謝物，乳酸、丙酮酸、蔗糖等是其關(guān)鍵代謝物。嘧啶代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、糖酵解、丙酮酸代謝、?；撬岽x和TCA 循環(huán)是影響乳酸菌生長(zhǎng)代謝及參與鈣釋放的關(guān)鍵通路。本文探究了乳酸菌發(fā)酵影響鈣釋放的關(guān)鍵代謝途徑，為利用生物發(fā)酵法制備補(bǔ)鈣劑進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。