陸 婷,蔣 總,蘭維婭,唐 芳

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué),貴陽(yáng) 550002;2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科,貴陽(yáng) 550003)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種自身免疫性骨關(guān)節(jié)疾病,以慢性炎癥、滑膜細(xì)胞異常增生為特征,可引起關(guān)節(jié)炎癥和骨破壞,導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能受限[1]。在RA的發(fā)展過(guò)程中,許多不同的信號(hào)通路發(fā)揮著重要作用。因此,對(duì)RA病理機(jī)制的深入研究有助于有效的抗類風(fēng)濕藥物的開發(fā)。糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase-3,GSK-3)是一種能誘導(dǎo)和終止炎癥的激酶,廣泛存在于各種炎癥細(xì)胞中,參與多種信號(hào)通路的調(diào)節(jié)[2]。雖然RA的發(fā)病機(jī)制尚不清楚,但研究證實(shí)RA患者自身免疫活躍,炎癥趨化因子異常刺激,促使炎癥因子水平升高而加快RA病情進(jìn)展,而促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生主要依賴于GSK-3的活性,RA中觀察到的炎癥因子與各種促炎介質(zhì)和轉(zhuǎn)錄因子已被證明與GSK-3密切相關(guān)[3]。同時(shí)也有較多信號(hào)通路被異常激活或抑制,其涉及多種蛋白的異常表達(dá),而GSK-3就是比較重要的一種,所以RA的治療可能側(cè)重于減少免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)[4]。GSK-3β在RA中研究較充分,因此本文總結(jié)了關(guān)于GSK-3β與RA的相關(guān)炎癥因子緊密聯(lián)系的Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、磷酸酰肌醇3激酶(phosphotylinosital 3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)及核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信號(hào)通路機(jī)制的探討,以期為RA的治療提供更多的理論依據(jù)。

1 GSK-3概述

GSK-3最早是從兔骨骼肌中分離得到,并在哺乳動(dòng)物中鑒定出兩種高度同源的GSK-3,即GSK-3α和GSK-3β。氨基酸序列比較表明,二者在催化區(qū)域有98%的同源性,而整體同源性約為85%。GSK-3α和GSK-3β在調(diào)控和表達(dá)上存在一定差異,具有共同或不同的底物和細(xì)胞功能,不能完全替代對(duì)方,其主要表現(xiàn)在于N和C端不同,GSK-3α和GSK-3β分子量的差異是由GSK-3α N端富含甘氨酸的延伸引起的。而GSK-3α和GSK-3β C端最后76個(gè)氨基酸的同源性僅為36%[2,4]。在調(diào)控上,GSK-3活性被絲氨酸(Ser)21、Ser9磷酸化而抑制和被蘇氨酸(Tyr)279、Tyr216磷酸化而激活。同時(shí),研究證實(shí)GSK-3α敲除小鼠可以存活,但GSK-3β缺失會(huì)導(dǎo)致胚胎死亡[3],表明GSK-3α和GSK-3β的功能不完全相同。

GSK-3活性受自身磷酸化水平的影響,除最早發(fā)現(xiàn)的能調(diào)控糖原合成酶的活性外,GSK-3還作用于眾多信號(hào)通路和轉(zhuǎn)錄因子中,調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖、存活和凋亡[2]。同時(shí)GSK-3作為眾多信號(hào)通路下游的關(guān)鍵因子,可廣泛參與細(xì)胞過(guò)程,如從糖原代謝到血管生成、細(xì)胞生存和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)等[4]。GSK-3在炎癥和免疫疾病中參與調(diào)節(jié)炎癥因子,如白細(xì)胞介素(IL)-6和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等[3]。

2 不同信號(hào)通路對(duì)RA的影響

2.1 Wnt/β-catenin信號(hào)通路

Wnt信號(hào)通路與RA的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。經(jīng)典信號(hào)通路在缺乏Wnt配體參與時(shí),GSK-3β與軸蛋白/結(jié)腸腺瘤樣息肉病基因編碼的蛋白/酪蛋白激酶1形成降解復(fù)合體,磷酸化β-catenin,β-catenin被泛素蛋白酶識(shí)別并降解,抑制Wnt信號(hào)通路的激活。當(dāng)Wnt配體參與時(shí),其與卷曲蛋白(frizzled,FZD)和單跨膜分子低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(low density lipoprotein-related protein,LRP)5/LRP6形成Wnt/FZD/LRP復(fù)合體,招募散亂蛋白,捕獲軸蛋白(Axin)結(jié)合的GSK-3β復(fù)合物,穩(wěn)定β-catenin并使其進(jìn)入細(xì)胞核,與T細(xì)胞因子(T cell factor,TCF)/淋巴樣增強(qiáng)因子(lymphoid enhancer factor,LEF)轉(zhuǎn)錄因子家族相互作用,激活下游靶基因而發(fā)揮作用[5]。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和炎癥參與RA成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞(fibroblastlike synoviocyte,FLS)的激活,激活的FLS可產(chǎn)生和分泌TNF-α、IL-1β、IL-8等炎癥因子,最終導(dǎo)致滑膜炎和關(guān)節(jié)損傷,而FLS產(chǎn)生的炎癥因子也能激活Wnt信號(hào)通路,導(dǎo)致RA的炎癥反應(yīng)[6]。Wnt5a、Wnt7a、Wnt10b作為Wnt/β-catenin信號(hào)通路的配體,能在FLS的增殖過(guò)程中大量釋放炎癥因子,加快RA病情進(jìn)展[7]。Wnt1是纖維連接蛋白(fibronectin,Fn)生成的主要Wnt配體之一,能夠調(diào)節(jié)RA-FLS中β-catenin下游Fn的表達(dá),而Fn提高了FLS的生存,從而加重了RA的炎癥反應(yīng)[6]。RA-FLS作為滑膜組織中參與RA發(fā)展的主要細(xì)胞群,抑制RA-FLS的侵襲、遷移和炎癥可作為治療RA的手段之一。除炎癥作用外,Wnt信號(hào)通路在RA成骨細(xì)胞(osteoblast,OB)和破骨細(xì)胞(osteoclast,OC)的平衡中具有重要的調(diào)節(jié)作用。(1)Dickkopf-1(DKK1)作為Wnt/β-catenin信號(hào)通路的拮抗劑在RA中能加劇FLS介導(dǎo)的炎癥、骨破壞和血管生成,當(dāng)其在RA患者的血清和滑膜液中過(guò)表達(dá)時(shí),通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路而抑制OB分化,間接使OC分化增加,加劇RA患者的骨破壞[7]。(2)Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)骨保護(hù)素(osteoprotegerin,OPG)/核因子-κB配體受體激活劑(oeceptor activatorfor nuclearfactor-κB ligand,RANKL)的表達(dá)起重要調(diào)控作用,Wnt/β-catenin信號(hào)通路能增強(qiáng)OPG的表達(dá),而RANKL誘導(dǎo)OC生成,OPG通過(guò)阻斷RANKL與RANK的結(jié)合抑制OC生成,改善RA的骨破壞。(3)DKK1通過(guò)抑制OPG的過(guò)表達(dá),提高RANKL水平,抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)OB和OC的調(diào)節(jié),保持RA骨代謝的穩(wěn)態(tài)[8]。

RA的發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜,目前仍處于研究階段,而Wnt/β-catenin信號(hào)通路上不同因子通過(guò)不同的機(jī)制作用于RA,也從不同方面影響著RA的進(jìn)展及預(yù)后。

2.2 GSK-3β介導(dǎo)的Wnt/β-catenin信號(hào)通路

GSK-3作為關(guān)鍵的調(diào)控因子,同時(shí)也被多種因子調(diào)節(jié)。最常見的是GSK-3β結(jié)合蛋白,在體內(nèi)的功能是穩(wěn)定β-catenin。Axin與抗原提呈細(xì)胞(antigen-presenting,APC)作為GSK-3β的底物,GSK-3β能磷酸化Axin并提高其穩(wěn)定性,同時(shí)更有利于β-catenin與APC之間的相互作用,使GSK-3β磷酸化β-catenin[9]。因此,GSK-3在Wnt/β-catenin信號(hào)通路中主要由GSK-3β參與進(jìn)行磷酸化,GSK-3β在β-catenin降解復(fù)合體中作為一個(gè)關(guān)鍵酶,能夠調(diào)控Wnt信號(hào)通路的激活或失活。進(jìn)一步說(shuō)明了GSK-3在Wnt/β-catenin信號(hào)通路中的中心作用。

微RNA-26b(miR-26b)在抑制RA的滑膜炎中發(fā)揮核心作用。研究證實(shí),miR-26b通過(guò)降低GSK-3β水平使Ser9-GSK-3β磷酸化水平下降而提高β-catenin和細(xì)胞周期蛋白1(CyclinD1)表達(dá),抑制Wnt/GSK-3β/β-catenin信號(hào)通路,減少RA-FLS增殖和炎癥因子分泌而抑制RA滑膜炎[10]。氯化鋰(LiCl)作為GSK-3β抑制劑,可以增強(qiáng)GSK-3β在Ser9位點(diǎn)的磷酸化水平并促進(jìn)β-catenin在核內(nèi)的積累,而7-羥基香豆素(7-HC)在體外阻止β-catenin的核轉(zhuǎn)位。LiCl與7-HC聯(lián)合使用恢復(fù)了β-catenin信號(hào)通路的活性,并抑制7-HC對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的RA-FLS的抗增殖和促凋亡作用,說(shuō)明7-HC抗RA進(jìn)展是通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路介導(dǎo)[11]。所以,GSK-3β通過(guò)介導(dǎo)Wnt/β-catenin信號(hào)通路可以誘導(dǎo)RA的進(jìn)展,進(jìn)一步表明GSK-3β在Wnt/β-catenin信號(hào)通路中不可忽視的作用。

2.3 PI3K/Akt信號(hào)通路

PI3K主要由p110催化亞單位和p85調(diào)節(jié)亞單位組成。PI3K可被G蛋白偶聯(lián)受體和(或)蛋白酪氨酸激酶受體激活,也可被Ras蛋白激活。Akt作為PI3K信號(hào)通路的下游靶點(diǎn),當(dāng)PI3K激活后在質(zhì)膜上將磷脂酰肌醇(4,5)二磷酸[phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate,PIP2]磷酸化并產(chǎn)生磷脂酰肌醇(3,4,5)三磷酸[phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate,PIP3],Akt的PH結(jié)構(gòu)域與PIP3結(jié)合,PIP3依賴性激酶-1在被PIP3活化的同時(shí)定位于細(xì)胞膜,進(jìn)一步催化Akt的Thr473和Thr308磷酸化,Akt由此被完全活化,活化的Akt使大量下游底物磷酸化,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、凋亡、增殖等[12]。

PI3K/Akt信號(hào)通路在RA中參與了多個(gè)環(huán)節(jié)的發(fā)生,如調(diào)控炎癥因子的釋放,促進(jìn)OB的生成等。PI3K/Akt信號(hào)通路的異常激活是RA的主要調(diào)節(jié)因子,能誘導(dǎo)RA炎癥反應(yīng)的發(fā)生,而炎癥因子也能通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路來(lái)介導(dǎo)RA的進(jìn)展[8]。PI3K/Akt可以通過(guò)作用于雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制RA-FLS自噬,使FLS異常增殖,加重RA病情[7]。同時(shí),PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑或者通過(guò)上調(diào)其內(nèi)源性負(fù)調(diào)節(jié)蛋白的水平,而抑制RA-FLS增殖,緩解RA的發(fā)展[11]。RA-FLS通過(guò)產(chǎn)生TNF-α、IL-6、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)炎癥反應(yīng),導(dǎo)致PI3K/Akt信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)異常,引起滑膜炎和FLS釋放,最終導(dǎo)致RA的軟骨破壞和骨侵蝕,影響OB的分化和生成[8]。VEGF作為血管生成的關(guān)鍵調(diào)控因子,能誘導(dǎo)RA滑膜中的促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生,而PI3K/Akt信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)及缺氧下能夠促進(jìn)VEGF的表達(dá)。研究證實(shí),紫草素通過(guò)下調(diào)PI3K/Akt信號(hào)通路抑制VEGF誘導(dǎo)的血管生成,從而緩解RA滑膜炎和血管翳的形成[13]。通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白可以誘導(dǎo)RA-FLS細(xì)胞凋亡,控制RA的癥狀和發(fā)展[11]。PI3K/Akt信號(hào)通路可從不同作用、不同方面緩解RA的炎癥反應(yīng)。

2.4 GSK-3介導(dǎo)的PI3K/Akt信號(hào)通路

GSK-3作為PI3K/Akt途徑的下游成分,當(dāng)PI3K/Akt激活時(shí)使Ser21處的GSK-3α和Ser9處的GSK-3β磷酸化,導(dǎo)致GSK-3失活。在特定情況下Akt和GSK-3可以協(xié)同調(diào)控信號(hào)通路,GSK-3也可以調(diào)節(jié)一些GSK-3抑制激酶的作用。這種雙向性的研究主要集中在Akt和GSK-3的相互作用中,Akt不僅抑制GSK-3,而且GSK-3也可以調(diào)控Akt,如GSK-3α還可以通過(guò)Ser312-Akt調(diào)控位點(diǎn)的磷酸化抑制Akt的活性[14]。IL-10是一種抑制炎癥基因表達(dá)的免疫抑制細(xì)胞因子,PI3K/Akt信號(hào)通路能誘導(dǎo)其產(chǎn)生,而Akt下游的GSK-3激酶作為IL-10的抑制劑,當(dāng)GSK-3磷酸化和失活時(shí)使IL-10從GSK-3的抑制中釋放出來(lái)并過(guò)表達(dá),抑制促炎細(xì)胞因子,增強(qiáng)抗炎機(jī)制,緩解RA的炎癥反應(yīng)[15]。

SHARMA等[16]通過(guò)藥理實(shí)驗(yàn)證實(shí),小檗枸杞提取物(BLFE)和小檗堿的PI3K、Akt激活均減弱,而GSK-3β激活僅在BLFE和小檗堿給藥組觀察到抑制。GSK-3β在PI3K/Akt信號(hào)通路中能改善RA的臨床癥狀,為PI3K/Akt-GSK-3信號(hào)通路治療RA提供了新的方向及理論依據(jù)。

2.5 NF-κB信號(hào)通路

NF-κB是一種由3個(gè)亞基[p65、p50和抑制劑kappa B(IκB)]組成的轉(zhuǎn)錄因子,多種細(xì)胞內(nèi)外刺激可直接或間接激活NF-κB信號(hào)通路。NF-κB信號(hào)通路由兩種途徑進(jìn)行激活:(1)典型的NF-κB信號(hào)通路由促炎信號(hào)(細(xì)胞因子受體,如IL-1R和TNF-α家族)、Toll樣受體(TLR)和淋巴細(xì)胞受體參與激活。其傳導(dǎo)的關(guān)鍵是三聚體IκB激酶復(fù)合物對(duì)IκBα的磷酸化,以釋放RelA:p50二聚體,使其易位到細(xì)胞核以激活靶基因。(2)非典型的NF-κB信號(hào)通路,由NF-κB的必要調(diào)節(jié)蛋白(NEMO)和催化激酶亞基(IKKβ)獨(dú)立的IKKα二聚體復(fù)合物介導(dǎo),從而間接激活與之相關(guān)的其他細(xì)胞途徑,如絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、免疫球蛋白(Rho)等[17]。NF-κB信號(hào)通路被認(rèn)為是細(xì)胞因子與炎癥反應(yīng)之間的橋梁,而RA作為一種炎癥相關(guān)疾病與NF-κB信號(hào)通路的過(guò)度激活有關(guān)[18]。NF-κB信號(hào)通路作為RA的主要炎癥途徑之一,在所有細(xì)胞類型中普遍表達(dá)和被激活,并與其他信號(hào)通路之間相互作用,在調(diào)節(jié)炎癥、免疫和細(xì)胞增殖、分化、生存方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。高度激活的NF-κB信號(hào)通路可誘導(dǎo)多種促炎細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β和IL-6的產(chǎn)生,從而加速RA的進(jìn)展。而促炎細(xì)胞因子的上調(diào)也可以通過(guò)正反饋調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路的激活,形成惡性循環(huán),加速RA的發(fā)展[19]。

活化的NF-κB信號(hào)通路可促進(jìn)FLS增殖,增強(qiáng)其侵襲、浸潤(rùn)能力。在RA的滑膜炎環(huán)境中,FLS凋亡異常是RA滑膜增生的主要因素。凋亡異常的FLS進(jìn)一步聚集并黏附在軟骨和骨上,加劇關(guān)節(jié)軟骨和骨的破壞[18]。而NF-κB信號(hào)通路的過(guò)度激活會(huì)導(dǎo)致RA中FLS凋亡異常,相反,抑制NF-κB可明顯減輕炎癥反應(yīng)[20]。藥理實(shí)驗(yàn)證實(shí),早期RA患者的炎癥可使用氨甲蝶呤(MTX)來(lái)治療,MTX治療由NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo),MTX可以通過(guò)增加RA患者NF-κB抑制物A20(TNFAIP3)的表達(dá)來(lái)抑制巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[21]。而潑尼松龍是一種合成糖皮質(zhì)激素,通過(guò)NF-κB信號(hào)通路抑制炎癥基因激活,臨床上用于緩解RA的炎癥治療[22]。可見,臨床上通過(guò)藥物來(lái)抑制NF-κB信號(hào)通路,或者通過(guò)該通路抑制相關(guān)炎癥因子的表達(dá),進(jìn)一步改善RA的進(jìn)展。

2.6 GSK-3介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路

RA患者炎癥細(xì)胞因子表達(dá)較高,它們既是NF-κB信號(hào)通路的靶基因,又是激活因子。TNF-α能夠調(diào)節(jié)GSK-3,促進(jìn)NF-κB信號(hào)通路反饋抑制,使炎癥細(xì)胞因子減少。而GSK-3β參與多種事件,如激活NF-κB信號(hào)通路、阻止IκB的降解、抑制p65的核轉(zhuǎn)位及降低p65的磷酸化水平[4]。說(shuō)明抑制GSK-3β可抑制NF-κB信號(hào)通路的激活。而GSK-3β可以選擇性激活NF-κB信號(hào)通路,如NF-κB介導(dǎo)的IL-6和單核細(xì)胞趨化蛋白-1的表達(dá)需要GSK-3β才能有效表達(dá),而IκBα和巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-2則不需要。GSK-3β對(duì)NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)的基因表達(dá)的這種選擇性作用可能有助于GSK-3抑制劑的抗炎作用,同時(shí)表明GSK-3的抑制不會(huì)干擾NF-κB信號(hào)通路的所有作用[23]。

研究發(fā)現(xiàn),在RA小鼠模型中隨著NF-κB信號(hào)通路的激活,炎癥細(xì)胞因子表達(dá)增加,使用GSK-3β抑制劑TDZD-8后,下調(diào)了RA-FLS中NF-κB信號(hào)通路,抑制了c-Jun N末端激酶(JNK)、c-Jun、活化轉(zhuǎn)錄因子(ATF)2和p38的表達(dá),從而抑制RA的炎癥反應(yīng)[24]。NF-κB信號(hào)通路是一種有效的炎癥因子和轉(zhuǎn)錄因子,在膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)的動(dòng)物模型中GSK-3β和NF-κB信號(hào)通路的同時(shí)激活是RA動(dòng)物炎癥和滑膜增殖過(guò)程中的主要關(guān)鍵因素,在RA動(dòng)物模型中,GSK-3β的抑制通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路的激活提供保護(hù)[20]。藥理實(shí)驗(yàn)表明,阿托伐他汀和槲皮素的聯(lián)合治療進(jìn)一步促進(jìn)了miR-26b和miR-20a表達(dá)的升高,從而抑制GSK-3β/NF-κB/活化的NOD樣受體蛋白3(NLRP-3)信號(hào)通路,導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的減少,在RA中發(fā)揮抗炎作用[25]。

NF-κB信號(hào)通路可以被一個(gè)或多個(gè)復(fù)雜的信號(hào)通路激活,這些信號(hào)通路之間也可以相互影響。GSK-3β對(duì)NF-κB信號(hào)通路具有不同的調(diào)節(jié)作用,主要以其對(duì)RA炎癥作用為主,但相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究較少,所以在RA中的作用機(jī)制需進(jìn)一步探討。

3 小 結(jié)

RA發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前仍不能明確其發(fā)病機(jī)制。而信號(hào)通路為RA的治療提供了明確的治療靶點(diǎn),Wnt/β-catenin、PI3K/Akt及NF-κB信號(hào)通路與炎癥因子相互作用共同促進(jìn)RA的發(fā)展。GSK-3作為一種能夠調(diào)節(jié)多種靶分子絲氨酸和蘇氨酸氨基酸殘基磷酸化的激酶,參與許多細(xì)胞調(diào)節(jié)過(guò)程,并在多個(gè)不同的信號(hào)通路中有助于緩解炎癥。而使用GSK-3β抑制劑作用于特定信號(hào)通路可抑制RA的炎癥反應(yīng),表明抑制GSK-3β可以有效治療RA,為治療RA提供了新的方向,但其安全性還需要大量的臨床研究進(jìn)一步評(píng)估。GSK-3β在RA中研究較充分的是其抗炎作用,而GSK-3β對(duì)其他風(fēng)濕病的具體作用機(jī)制研究較少,還需進(jìn)一步研究,以期為風(fēng)濕病的治療提供更多的理論依據(jù)。