顧家泓，田原野，康非吾

（1.同濟(jì)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，上海牙組織修復(fù)與再生工程技術(shù)研究中心，上海 200072；2.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院口腔頜面外科，長(zhǎng)春 130021）

骨是人體中的一個(gè)動(dòng)態(tài)器官，其無(wú)時(shí)無(wú)刻地通過(guò)破骨細(xì)胞吸收舊骨-成骨細(xì)胞形成新骨，進(jìn)行著骨改建，以維持骨代謝的平衡。然而有很多因素會(huì)影響骨代謝的平衡，例如遺傳、炎癥、年齡、低氧、壓力等[1]。細(xì)胞的特定活動(dòng)與微管、微絲和中間纖維的細(xì)胞骨架密切相關(guān)。對(duì)于細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)，Rho家族發(fā)揮著重要的作用，其中包括Rho、Rac1 和CDC42 等蛋白，它們可以通過(guò)改變細(xì)胞骨架來(lái)參與許多細(xì)胞活動(dòng)，例如肌動(dòng)蛋白和微管細(xì)胞骨架的組織、基因表達(dá)的調(diào)控、囊泡運(yùn)輸、細(xì)胞周期的進(jìn)程、細(xì)胞形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞極性和細(xì)胞遷移等[2-3]。破骨細(xì)胞在進(jìn)行骨吸收前會(huì)通過(guò)由大量微絲所組成的偽足小體，在骨基質(zhì)表面形成一偽足小體環(huán)，即封閉帶來(lái)進(jìn)行骨吸收過(guò)程。有研究[4]表明，Rac1 失活后會(huì)破壞其封閉帶并且降低破骨細(xì)胞吸收活性。然而低氧微環(huán)境下的低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）將會(huì)如何影響Rac1，進(jìn)而調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞細(xì)胞骨架，最終對(duì) 破骨細(xì)胞的骨吸收能力產(chǎn)生何種影響，尚不明確。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

小鼠單核細(xì)胞系RAW264.7（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）；HIF-1α KO RAW264.7 細(xì)胞（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）；HIF-1αfl/fl/cre-小鼠，HIF-1αfl/fl/ctsk-cre 小鼠（美國(guó)杰克遜實(shí)驗(yàn)室）；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、青霉素-鏈霉素（penicillin and streptomycin，PS）、高糖DMEM 培養(yǎng)液（Gibco 公司，美國(guó)）；CoCl2（Sigma 公司，美國(guó)）；sRANKL（Peprotech 公司，美國(guó)）；Rac1抗體、HIF-1α抗體（Abcam公司，美國(guó)）；Rac1 抑制劑（型號(hào)：NSC23766；Selleck 公司，美國(guó)）；TRIzol 試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa 公司，日本）；實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司，中國(guó)）；Western blotting 試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所，中國(guó)）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)處理

小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7 細(xì)胞及HIF-1α KO RAW264.7 細(xì)胞接種于完全培養(yǎng)液（含有10%FBS、1%雙抗的DMEM），于37 ℃、5%CO2混 合氣體的培養(yǎng)箱，換液時(shí)間為1～2 d，傳代時(shí)間為2～3 d。實(shí)驗(yàn)分為5 組，將接種于完全培養(yǎng)液的RAW264.7 細(xì)胞作為對(duì)照組，接種于完全培養(yǎng)液的HIF-1α KO RAW264.7 細(xì)胞作為KO 組；同時(shí)取 100 μmol/L CoCl2加入對(duì)照組中，用以模擬低氧微環(huán)境，將其作為低氧組；取濃度100 μmol/L Rac1活性抑制劑于對(duì)照組中，用以抑制Rac1 活性，將其作為抑制劑組；同時(shí)在抑制劑組的基礎(chǔ)上加入100 μmol/L CoCl2作為抑制低氧組。

1.3 TRAP 染色

將小鼠單核細(xì)胞系RAW264.7 細(xì)胞及HIF-1α KO RAW264.7 細(xì)胞以2 000 個(gè)/孔接種于24孔板中，在含10%FBS 和10 ng/mL sRANKL 的新鮮DMEM中培養(yǎng)2 d，第6 天更換為條件培養(yǎng)液。第7 天時(shí)，根據(jù)說(shuō)明書用TRAP 試劑盒進(jìn)行染色。超過(guò)3 個(gè)核的TRAP 陽(yáng)性多核細(xì)胞計(jì)為破骨細(xì)胞。TRAP 陽(yáng)性細(xì)胞由2 名實(shí)驗(yàn)人員觀察并計(jì)數(shù)。

1.4 RT-qPCR

將RAW264.7 細(xì) 胞和 HIF-1α KO RAW264.7細(xì)胞接種于6 孔板中，細(xì)胞貼壁后，按上述條件培養(yǎng)細(xì)胞。TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA，按RT-qPCR 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行RT-qPCR，檢測(cè)RAW264.7 HIF-α、CTSK、MMP-9、TRAP、Rac1、β-actin mRNA的表達(dá)水平。引物見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1 Primers sequence

1.5 細(xì)胞免疫熒光

將RAW264.7 細(xì)胞和HIF-1α KO RAW264.7細(xì)胞接種于24 孔板，細(xì)胞貼壁后，按上述條件培養(yǎng)細(xì)胞。4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.5%Triton X-100通透細(xì)胞膜，牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）非免疫羊血清封閉，加入兔抗HIF-1α（1∶200）、兔抗Rac1（1∶300）4 ℃過(guò)夜，熒光二抗（1∶200）、鬼筆環(huán)肽（1∶300）、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（1∶1 000）避光孵育，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍攝圖像。

1.6 Western blotting

將RAW264.7 細(xì)胞和 HIF-1α KO RAW264.7細(xì)胞接種于6 孔板，細(xì)胞貼壁后，按上述條件培養(yǎng)細(xì)胞。強(qiáng)裂解液裂解細(xì)胞，4 ℃下以11 000 r/min 離心，取上清液后于金屬浴100 ℃煮沸，加入5×上樣緩沖液后于-20 ℃保存待用。將蛋白樣品進(jìn)行電泳轉(zhuǎn)膜，封閉液封閉。封閉完成后，加入兔抗HIF-1α（1∶500）、兔抗Rac1（1∶1 000）、兔抗β-actin（1∶1 000）4 ℃過(guò)夜。加入二抗，即抗兔HRP-IgG（1∶1 000）室溫孵育，曝光拍攝。

1.7 生物信息學(xué)

取得4～6 周齡HIF-1αfl/fl/ctsk-cre C57 小鼠與 HIF-1αfl/fl/cre-小鼠各3 只，前者作為CKO 組，后者為Ctrl 組。通過(guò)提取小鼠股骨及脛骨中的單核細(xì)胞，進(jìn)行體外培養(yǎng)。經(jīng)鑒定后，破骨向誘導(dǎo)分化及提取RNA 后，行RNA 測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果使用limma程序包對(duì)細(xì)胞骨架相關(guān)基因（CDC42、Rac1、PI3K、PAK1、CD47、PI4P5K、LIMK1）及破骨細(xì)胞表面標(biāo)志 物（MMP-9）的表達(dá)進(jìn)行差異分析，使用經(jīng)驗(yàn)eBayes 算法，將閾值設(shè)定為logFC＞1，校正P＜0.05，數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)歸一化處理，采用eBayes 檢驗(yàn)差異。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行3 次，并使用SPSS 23.0 軟件和GraphPad Prism 9.4 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。使用單因素方差分析（ANOVA 方差分析）和Tukey分析進(jìn)行組間差異分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 低氧刺激促進(jìn)RAW264.7 破骨向分化

TRAP 染色結(jié)果（圖1A）顯示，相比對(duì)照組，低氧組所形成的破骨細(xì)胞體積更大。此外，RT-qPCR結(jié)果（圖1B）顯示，與對(duì)照組相比，低氧組破骨細(xì)胞HIF-1α mRNA 表達(dá)水平升高，破骨細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物（MMP-9、TRAP、CTSK）mRNA 的表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 體外模擬低氧狀態(tài)下破骨細(xì)胞的生成情況與相關(guān)標(biāo)志物mRNA 的表達(dá)情況Figure 1 Osteoclast generation and mRNA expression of related markers in vitro under hypoxia

2.2 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)HIF-1α與細(xì)胞骨架相關(guān)基因的關(guān)系

在熱圖中，藍(lán)色表示低表達(dá)，紅色表示高表達(dá)（圖2A）。在火山圖中，紅點(diǎn)表示轉(zhuǎn)錄本上調(diào)，藍(lán)點(diǎn)表示轉(zhuǎn)錄本下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2B，P＜0.05）。結(jié)果顯示，CKO 組小鼠原代單核細(xì)胞誘導(dǎo)分化后，Rac1 mRNA 的表達(dá)均明顯低于對(duì)照組。Rac1 屬于Rho 蛋白家族，其主要調(diào)控破骨細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白，影響破骨細(xì)胞進(jìn)行骨吸收時(shí)所形成的肌動(dòng)蛋白環(huán)，即封閉帶。因此，HIF-1α可能通過(guò)調(diào)控Rac1 影響破骨細(xì)胞細(xì)胞骨架，從而影響破骨細(xì)胞的骨吸收能力。

圖2 生物信息學(xué)分析Figure 2 Bioinformation analysis

2.3 HIF-1α通過(guò)調(diào)控Rac1 影響破骨細(xì)胞細(xì)胞骨架，影響骨吸收能力

TRAP 染色結(jié)果（圖3A、3B）顯示，與對(duì)照組及低氧組相比，KO 組形成的破骨細(xì)胞呈相對(duì)規(guī)則的圓形，體積相對(duì)較小。RT-qPCR 結(jié)果（圖3C）顯示，KO 組破骨細(xì)胞HIF-1α mRNA 表達(dá)降低，Rac1 mRNA 表達(dá)也隨之降低，破骨細(xì)胞表面標(biāo)志物（MMP-9、TRAP、CTSK）mRNA 表達(dá)同樣減弱。Western blotting 結(jié)果（圖3D）顯示，KO 組HIF-1α與Rac1 表達(dá)均呈明顯降低。細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖3E、3F）顯示，將HIF-1α敲除后的實(shí)驗(yàn)組使用鬼筆環(huán)肽對(duì)肌動(dòng)蛋白（filamentous actin，F(xiàn)-actin）進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞肌動(dòng)蛋白所形成的封閉帶形成異常，Rac1 陽(yáng)性表達(dá)面積與對(duì)照組和低氧組相比呈明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。我們推測(cè)HIF-1α位于Rac1 上游，能夠通過(guò)調(diào)控Rac1 影響破骨細(xì)胞細(xì)胞骨架，參與調(diào)控破骨細(xì)胞封閉帶形成，從而影響破骨細(xì)胞的骨吸收能力。

圖3 HIF-1α 條件性敲除 RAW264.7 所形成破骨細(xì)胞的生成情況Figure 3 Osteoclast formation from HIF-1α conditional knockout of RAW264.7

2.4 抑制RAW264.7 內(nèi)Rac1 使破骨吸收能力降低

TRAP 染色結(jié)果（圖4A、4B）顯示，抑制劑組所形成的破骨細(xì)胞體積減小，而抑制低氧組所形成的破骨細(xì)胞體積繼續(xù)增大。RT-qPCR 結(jié)果（圖4C）顯示，抑制劑組所形成的破骨細(xì)胞的HIF-1α及Rac1 mRNA 表達(dá)無(wú)明顯差異，破骨細(xì)胞表面相關(guān)標(biāo)志物mRNA 表達(dá)降低；而抑制低氧組其HIF-1α、Rac1 mRNA 及表面相關(guān)標(biāo)志物mRNA 表達(dá)增高。以上結(jié)果證明了Rac1 位于HIF-1α下游，并不會(huì)影響破骨細(xì)胞HIF-1α表達(dá)，而NSC23766 本身作為Ra1 活性抑制劑，對(duì)其本身Rac1 mRNA 表達(dá)無(wú)明顯改變，卻會(huì)通過(guò)影響細(xì)胞骨架來(lái)改變其所形成的破骨細(xì)胞的骨吸收能力。但通過(guò)再次模擬低氧環(huán)境，其相關(guān)的mRNA 表達(dá)會(huì)發(fā)生改變。

圖4 低氧抑制RAW264.7 內(nèi)Rac1 使破骨吸收能力降低Figure 4 Inhibition of Rac1 in RAW264.7 decreased osteoclast absorbance

此外，Western blotting 結(jié)果（圖4D）中也顯示，抑制劑組HIF-1α 與Rac1 蛋白表達(dá)無(wú)明顯差別，然而抑制低氧組中HIF-1α 與Rac1 蛋白表達(dá)量均明顯升高。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果（圖4E、4F）顯示，同樣使用鬼筆環(huán)肽對(duì)肌動(dòng)蛋白進(jìn)行染色，抑制劑組破骨細(xì)胞的封閉帶形成不完整，紅色熒光陽(yáng)性Rac1表達(dá)與對(duì)照組無(wú)明顯差異。與之相反，抑制低氧組破骨細(xì)胞的封閉帶熒光表達(dá)明顯，Rac1 陽(yáng)性表達(dá)也同樣增強(qiáng)。

3 討論

在骨發(fā)育過(guò)程中，骨骼重建和骨骼完整性通常是由成骨細(xì)胞進(jìn)行的骨形成和破骨細(xì)胞參與的骨吸收之間的平衡所調(diào)節(jié)的。當(dāng)這個(gè)平衡被打破以后，便會(huì)發(fā)生病理性的骨丟失。破骨細(xì)胞過(guò)度激活可直接導(dǎo)致類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、癌癥的骨轉(zhuǎn)移[5-7]。當(dāng)口腔頜面部頜骨骨折時(shí)，由于血流中斷或減少，從而造成局部低氧環(huán)境，破骨細(xì)胞在此條件下，其分化能力與骨吸收能力將得到增強(qiáng)，會(huì)影響骨折愈合。同理，正頜手術(shù)Lefort Ⅰ型截骨手術(shù)后，由于鼻腭動(dòng)脈及腭降動(dòng)脈被切斷，產(chǎn)生了局部低氧環(huán)境，破骨細(xì)胞骨吸收能力得到增強(qiáng)，對(duì)術(shù)后的恢復(fù)也將有一定的影響。而細(xì)胞在進(jìn)行生物活動(dòng)過(guò)程中，其細(xì)胞骨架起到重要作用。破骨細(xì)胞與骨基質(zhì)相接觸后，細(xì)胞骨架將會(huì)發(fā)生變化，在其外圍形成肌動(dòng)蛋白環(huán)，即封閉帶，封閉帶將吸收的微環(huán)境與一般的細(xì)胞外空間分隔開(kāi)來(lái)，進(jìn)而開(kāi)始骨吸收過(guò)程。然而生長(zhǎng)在非礦化基質(zhì)上，破骨細(xì)胞無(wú)法形成封閉帶，而是會(huì)形成由肌動(dòng)蛋白聚集所成的帶狀結(jié)構(gòu)，即偽足小體帶[8-9]。

低氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor，HIF）是低氧條件下誘導(dǎo)生成的一種結(jié)合蛋白，其廣泛存在于慢性低氧的細(xì)胞中，而HIF-1α亞基是HIF-1特有的調(diào)節(jié)蛋白，因此大多數(shù)研究均集中于HIF-1α這個(gè)活性亞基上[10-13]。在破骨細(xì)胞形成過(guò)程中，低氧可以刺激其HIF-1α產(chǎn)生，促進(jìn)其細(xì)胞分化與維持骨吸收功能[14]。于是在此基礎(chǔ)上，本研究通過(guò)誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞形成破骨細(xì)胞，并使用CoCl2模擬局部低氧環(huán)境，并發(fā)現(xiàn)低氧環(huán)境下破骨細(xì)胞 體積變大，骨吸收功能也得到增強(qiáng)，低氧環(huán)境下破骨細(xì)胞外圍的肌動(dòng)蛋白環(huán)所圍成的表面積也相對(duì)增大。我們推測(cè)在局部低氧微環(huán)境下，破骨細(xì)胞骨吸收功能得到增強(qiáng)可能是由于其細(xì)胞骨架發(fā)生的變化所造成的。破骨細(xì)胞肌動(dòng)蛋白環(huán)所圍成的表面積增大，破骨細(xì)胞所能進(jìn)行骨吸收的面積也將變大，由此骨吸收的能力得到增強(qiáng)。

破骨細(xì)胞在與骨基質(zhì)結(jié)合的過(guò)程中，細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白被認(rèn)為與Rac1 有著密切關(guān)系，其可以誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的片狀偽足和皺褶緣[15]。Rac1 是Ras 相關(guān)C3肉毒桿菌毒素底物1，屬于Rho家族成員之一，其能調(diào)節(jié)偽足小體的產(chǎn)生和排列，影響其封閉帶的形成[16]。Rac 活化后會(huì)促進(jìn)片狀偽足的擴(kuò)散，而Rac 失活后則會(huì)使得細(xì)胞發(fā)生回縮和偽足小體的解體。有證據(jù)[17]表明，Rac1 可以被各種應(yīng)激刺激激活。有研究[18]發(fā)現(xiàn)，低氧會(huì)刺激乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生活性氧成分，這可能是低氧通過(guò)PI3K/ERK 信號(hào)通路來(lái)刺激Rac1 活化的重要介質(zhì)。同時(shí)，進(jìn)一步認(rèn)證發(fā)現(xiàn)，將Rac1激活下調(diào)阻斷，HIF-1α將會(huì)上調(diào)[19-20]。然而HIF-1α究竟處于Rac1 的上游還是下游，還存在爭(zhēng)議。有研究[21]通過(guò)模擬慢性低氧環(huán)境，抑制PHDs 來(lái)使HIF-1α獲得長(zhǎng)期的穩(wěn)定，從而作用于Rac1 表達(dá)。然而短期低氧的作用卻剛好相反，Rac1 作用于HIF-1α的上游，是誘導(dǎo)HIF-1α蛋白表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性所必需的[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)使用CoCl2來(lái)模擬低氧環(huán)境作用24 h 后，Rac1 表達(dá)將會(huì)得到增強(qiáng)；將HIF-1α敲除后，Rac1 表達(dá)將會(huì)降低。然而將Rac1 活性抑制后，HIF-1α表達(dá)不會(huì)有明顯變化，證明長(zhǎng)期低氧環(huán)境下HIF-1α位于Rac1上游，會(huì)對(duì)其產(chǎn)生影響。將HIF-1α敲除后，所誘導(dǎo)形成的破骨細(xì)胞體積明顯縮小，在免疫熒光下，其外圍的肌動(dòng)蛋白環(huán)所圍成的表面積也減小，表達(dá)不顯著。而將Rac1 活性抑制后，誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞形成的破骨細(xì)胞體積也會(huì)縮小。外圍肌動(dòng)蛋白環(huán)表達(dá)不明顯，甚至?xí)l(fā)生缺如，破骨細(xì)胞無(wú)法較好地行使骨吸收功能，造成骨吸收能力減弱。對(duì)此可以認(rèn)為HIF-1α位于Rac1 上游，通過(guò)HIF-1α表達(dá)量的變化來(lái)影響Rac1，進(jìn)一步改變破骨細(xì)胞細(xì)胞骨架的變化。而骨架的變化對(duì)破骨細(xì)胞的功能將產(chǎn)生一定的影響，例如細(xì)胞與骨基質(zhì)所接觸的面積得到擴(kuò)大或縮小，從而可以促進(jìn)或減弱其骨吸收能力。

但是本研究也存在一定的局限性，首先通過(guò)體外藥物去模擬低氧環(huán)境不能真實(shí)反映體內(nèi)的低氧情況，無(wú)法構(gòu)建細(xì)胞所生活的低氧環(huán)境[23]。此外,影響細(xì)胞骨架的蛋白還有很多，HIF-1α 可能也會(huì)對(duì)其產(chǎn)生影響，而不是只影響Rac1 并使其發(fā)生變化。因此，HIF-1α對(duì)于破骨細(xì)胞細(xì)胞骨架的影響還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究證實(shí)了低氧可以影響破骨細(xì)胞細(xì)胞骨架，上調(diào)Rac1 的表達(dá)，使其細(xì)胞與骨基質(zhì)相接觸的面積得到擴(kuò)大，增強(qiáng)破骨細(xì)胞的骨吸收功能。本研究加深了對(duì)骨代謝平衡中低氧環(huán)境作用的認(rèn)識(shí)，為治療頜面部骨折及正頜手術(shù)術(shù)后治療提供了一種思路。