程 昊，吳發(fā)印，劉智丹

(遵義醫(yī)科大學(xué)第五附屬（珠海）醫(yī)院口腔頜面外科，珠海 519100)

腺樣囊性癌（adenoid cystic carcinoma，ACC）約 占頭頸部惡性腫瘤的1%，是最常見的唾液腺惡性腫瘤，多發(fā)生于唾液腺組織，其特點是侵襲性強，經(jīng)常發(fā)生血行轉(zhuǎn)移，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移較為罕見[1]。ACC 的預(yù)后較差，治療方式的進步對ACC 的治療結(jié)果沒有明顯影響，患者長期生存期低與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1-2]。ACC 的治療通常為根治性手術(shù)切除和術(shù)后放療，同時針對ACC 患者的靶向分子治療也被廣泛研究，但該病緩慢的病程限制了其臨床療效[3]。目前，迫切需要研究新的治療方法來提高ACC 患者的治療效果。外泌體是由45 個多泡體內(nèi)部囊泡與質(zhì)膜融合而成的納米囊泡，大量的研究[4]已經(jīng)證實，外泌體在ACC 的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的作用。最近研究[5]發(fā)現(xiàn)，中藥介導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）外泌體在治療癌癥上具有很大的治療潛力。然而中藥介導(dǎo)的BMSCs 外泌體在治療ACC 上的作用還不清楚，其中姜黃素是被證實的具有抗腫瘤功效的中藥[6]，本研究將通過體外實驗探究姜黃素介導(dǎo)的BMSCs 外泌體對調(diào)控ACC-M 細胞增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 細胞

ACC-M 細胞（貨號：bio-105915）和人BMSCs（貨 號：bio-090476）購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。

1.2 藥物與主要試劑

姜黃素（純度：95%；上海源葉生物科技有限公司，中國）；DMEM 培養(yǎng)液（上海瑞永生物科技有限公司，中國）；腫瘤易感基因101（TSG-101）、CD63、CD9、重組人鈣連蛋白（calnexin）、上皮鈣黏素（E-cadherin）、神經(jīng)鈣黏素（N-cadherin）、波形蛋白（vimentin）、轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）抗體、磷酸化-細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（p-ERK）（Abcam 公司，英國）；二抗（上海西寶生物科技股份有限公司，中國）；細胞計數(shù)試劑盒-8（CCK8）（愛必信生物科技有限公司，中國）；transwell 小室（北京杰輝博高生物技術(shù)有限公司，中國）；多聚甲醛（南京化學(xué)試劑股份有限公司，中國）；TRIzol 試劑（成都化夏化學(xué)試劑有限公司，中國）；引物的設(shè)計和合成均由上海碧云天有限公司提供。

1.3 儀器

SpectraMax i3x 多功能酶標(biāo)儀（上海美谷分子儀器有限公司，中國）；StepOneTM實時熒光定量PCR儀（應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，美國）；Ts2R/Ts2 倒置顯微鏡（上海千欣儀器有限公司，中國）。

1.4 方法

1.4.1 藥物處理與分組 參考文獻[7]的方法，使用7.5 μmmol/L 的姜黃素與BMSCs 細胞共培養(yǎng)72 h 后，收集培養(yǎng)液，離心后收集上清液，并按文獻方法分離外泌體并進行鑒定。ACC-M 細胞培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)液中，并將ACC-M 隨機分為4 組：control 組、BMSC-Exo 組、Cur-BMSC-Exo 組和Cur 組。Control 組 為正常培養(yǎng)的ACC-M 細胞；BMSC-Exo 組為使用未經(jīng)姜黃素處理的BMSCs 外泌體160 μg/mL（本研究在預(yù)實驗姜黃素處理的BMSCs 外泌體濃度篩選中，發(fā)現(xiàn)濃度為160 μg/mL 時，ACC-M 細胞存活率接近50%，因此后續(xù)選擇此濃度進行實驗）與ACC-M細胞共培養(yǎng)；Cur-BMSC-Exo 組使用姜黃素處理的BMSCs 外泌體160 μg/mL 與ACC-M 細胞共培養(yǎng)；Cur 組為用7.5 μmmol/L 的姜黃素處理ACC-M 細胞，所有分組培養(yǎng)48 h 后進行后續(xù)實驗。

1.4.2 外泌體的分離與鑒定[5]使用DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)人BMSCs，待BMSCs 匯合度至80%后，使用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗細胞，然后將BMSCs 細胞培養(yǎng)在不含血清的DMEM 的培養(yǎng)液中。培養(yǎng)2 d 后，離心機分離并收集細胞培養(yǎng)液，在過濾后進行超速離心，收集沉淀后使用PBS 進行溶解，然后使用蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測外泌體標(biāo)志性蛋白。

1.4.3 Western blotting[8]使用RIPA 裂解液提取各組ACC-M 細胞總蛋白，并使用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度，然后經(jīng)垂直電泳分離蛋白后，進行轉(zhuǎn)膜。使用脫脂牛奶進行封閉。然后加入一抗TSG-101（1∶1 000）、CD63（1∶1 000）、CD9（1∶1 000）、calnexin（1∶1 000）、E-cadherin（1∶10 000）、N-cadherin（1∶5 000）、vimentin（1∶1 000）、TGF-β1（1∶1 000）、p-ERK（1∶1 000），4 ℃下孵育過夜，然后使用0.1%PBS 進行沖洗后，加入二抗（1∶2 000），然后加入增強化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色液進行顯影，然后進行拍照和灰度值分析。

1.4.4 CCK-8 實驗[9]收集細胞，將ACC-M 細胞接種于96 孔板中，接種密度為4×103個/孔，進行分組處理后培養(yǎng)48 h，之后每孔加入10 μL 的CCK-8試劑，繼續(xù)在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h 后使用酶標(biāo)儀檢測吸光度值，并計算細胞存活率，計算公式：細胞存活率=（處理組吸光度值-空白組吸光度值）/（對照組吸光度值-空白組吸光度值）×100%。

1.4.5 Transwell 實驗[10-11]收集各組細胞，調(diào)整密度為1×105個/mL，并在小室的上室加入無血清培養(yǎng)液，且每孔加入200 μL 的細胞，然后在小室的下室每孔加入600 μL 含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液，并在37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h，使用多聚甲醛進行固定，20 min 后使用0.1%的結(jié)晶紫進行染色，20 min 后顯微鏡下觀察細胞遷移數(shù)目。侵襲實驗：將Matrigel 加入到transwell 小室的上室中，在上室中加入100 μL 無血清的培養(yǎng)液，室溫下靜置0.5 h后棄培養(yǎng)液，在上室加入200 μL 的細胞，在下室加入600 μL 的培養(yǎng)液（含10%血清），培養(yǎng)48 h 后，使用4%的多聚甲醛對濾膜進行固定20 min 后使用蘇木精對其染色10 min。之后擦去表面上非侵襲性的細胞，最后通過顯微鏡觀察并計數(shù)。

1.4.6 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）[12]使 用TRIzol 試劑提取ACC-M 細胞總RNA，并檢測提取的RNA 的濃度，將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后配制熒光定量RCR 反應(yīng)體系，并以GAPDH 為內(nèi)參，進行PCR 反應(yīng)。最后根據(jù)2-ΔΔCt法分析TGF-β1和ERK mRNA 相對表達量。TGF-β1 引物序列：F，5'-GGATACCAACTATTGCTTCAGCTCC-3'；R，5'-AGGCTCCAAATATAGGGGCAGGGTC-3'。ERK引物序列：F，5'-CAGAGATTGAGACTGCGTGGC-3'；R，5'-AAGGAACCGGATCCCACATC-3'。GAPDH引物序 列：F，5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'；R，5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 26.0 軟件對所有數(shù)據(jù)進行分析，正態(tài)分布的數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，每組重復(fù)5 次，2 組之間比較使用t檢驗，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外泌體的鑒定

Western blotting 實驗檢測外泌體中外泌體標(biāo)志物TSG-101、CD63、CD9 和calnexin 的蛋白表達，結(jié)果如圖1 所示。與cell 組比較，外泌體組（BMSC-Exo組和Cur-BMSC-Exo 組）中TSG-101、CD63、CD9 蛋白高表達，而calnexin 蛋白呈低表達，表明成功獲得外泌體。

圖1 Western blotting 檢測外泌體標(biāo)志物的表達Figure 1 Expression of exosome markers detected by Western blotting

2.2 Cur-BMSC-Exo 對ACC-M 細胞存活率的影響

CCK-8 檢測培養(yǎng)48 h 后ACC-M 細胞存活率，control 組、BMSC-Exo 組、Cur-BMSC-Exo 組、Cur 組 的細胞存活率分別為（100.00±2.53）%、（96.78± 3.75）%、（67.21±5.15）%和（80.22±4.65）%。與 control 組比較，BMSC-Exo 組ACC-M 細胞存活率無明顯變化（P＞0.05）；與BMSC-Exo 組比較，Cur-BMSC-Exo 組和Cur 組ACC-M 細胞存活率均顯著降低（P＜0.05），且Cur-BMSC-Exo 組細胞活力下降水平顯著高于Cur 組（P＜0.05）。詳見圖2。

圖2 CCK-8 檢測培養(yǎng)48 h 后ACC-M 細胞存活率Figure 2 Survival rate of ACC-M cells after 48 h of culture detected by CCK-8 assay

圖3 Transwell 實驗檢測各組細胞遷移情況Figure 3 Cell migration in each group detected by transwell experiment

圖4 Transwell 實驗檢測各組細胞侵襲情況Figure 4 Cell invasion in each group detected by transwell experiment

2.3 Cur-BMSC-Exo 對ACC-M 細胞遷移的影響

Transwell 實驗檢測各組細胞遷移情況，結(jié)果如圖3 所示。control 組、BMSC-Exo 組、Cur-BMSC-Exo組、Cur 組的遷移細胞數(shù)分別為（100.40±2.61）、（97.89±2.12）、（62.63±1.60）、（82.95±1.21）個。與control 組比較，BMSC-Exo 組細胞遷移無明顯變 化（P＞0.05）；與BMSC-Exo 組比較，Cur-BMSCExo 組和Cur 組ACC-M 細胞遷移數(shù)目均明顯降低（P＜0.05）；與Cur-BMSC-Exo 組比較，Cur 組細胞遷移數(shù)量增加（P＜0.05）。

2.4 Cur-BMSC-Exo 對ACC-M 細胞侵襲的影響

Transwell 實驗檢測各組細胞侵襲情況，結(jié)果如 圖4 所 示。Control 組、BMSC-Exo 組、Cur-BMSCExo 組、Cur 組的細胞侵襲數(shù)分別為（120.40±8.87）、（117.80±9.02）、（62.00±8.88）、（90.00±7.88）個。與control 組比較，BMSC-Exo 組侵襲數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與BMSC-Exo 組比較，Cur-BMSC-Exo 組和Cur 的細胞侵襲數(shù)量均明顯降低（P＜0.05）；與Cur-BMSC-Exo 組比較，Cur 組細胞侵襲數(shù)量顯著增加（P＜0.05）。

2.5 Cur-BMSC-Exo 對ACC-M 細胞遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達的影響

由圖5和表1可見，與control組比較，BMSC-Exo組E-cadherin、N-cadherin 和vimentin 蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與BMSC-Exo 組比較，Cur-BMSC-Exo 組和Cur 組的E-cadherin 蛋白表達水平均顯著增加，而N-cadherin 和vimentin 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05），且Cur-BMSC-Exo 組和Cur 組之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組細胞遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達情況（±s,n=5）Table 1 Expression of migration and invasion-related proteins in each group (±s,n=5)

表1 各組細胞遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達情況（±s,n=5）Table 1 Expression of migration and invasion-related proteins in each group (±s,n=5)

①表示P＜0.05，與BMSC-Exo 組比較；②表示P＜0.05，與Cur-BMSCExo 組比較。

圖5 各組細胞遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達情況Figure 5 Expression of migration and invasion-related proteins in each group

2.6 Cur-BMSC-Exo 對ACC-M 細 胞TGF-β1/ERK通路的影響

由圖6 和表2 可見，與control 組比較，BMSC-Exo 組TGF-β1 和ERK mRNA 相對表達量和蛋白表達水平均無明顯差異（P＞0.05）；與BMSC-Exo 組比 較，Cur-BMSC-Exo 組 和Cur 組 的TGF-β1、ERK mRNA，TGF-β1、p-ERK 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05），且Cur 組mRNA 水平和蛋白水平顯著高于Cur-BMSC-Exo 組（P＜0.05）。

表2 各組細胞TGF-β1/ERK 通路相關(guān)基因表達情況（±s,n=5）Table 2 Expression of TGF-β1/ERK pathway-related proteins in each group (±s,n=5)

表2 各組細胞TGF-β1/ERK 通路相關(guān)基因表達情況（±s,n=5）Table 2 Expression of TGF-β1/ERK pathway-related proteins in each group (±s,n=5)

①表示P＜0.05，與BMSC-Exo 組比較；②表示P＜0.05，與Cur-BMSC-Exo 組比較。

圖6 各組細胞TGF-β1/ERK 通路相關(guān)蛋白表達情況Figure 6 Expression of TGF-β1/ERK pathway-related proteins in each group

3 討論

外泌體被定義為是在細胞通信和疾病中發(fā)揮重要作用的細胞外囊泡，幾乎所有種類的哺乳動物細胞都分泌脂質(zhì)雙層囊泡，由包括癌細胞在內(nèi)的多種真核細胞釋放的外泌體，對腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移具有調(diào)控作用[13-15]。因此，外泌體在癌癥進展中具有關(guān)鍵作用，它們不僅可以作為癌癥診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物，而且還可以作為藥物傳遞載體和可重構(gòu)的治療系統(tǒng)。姜黃素是從姜黃根莖中提取的多酚類藥物，具有抗炎、抗腫瘤等功效，然而由于姜黃素具有水溶性差、滲透性較差等缺點，姜黃素的藥用價值大打折扣[16]。近年來關(guān)于外泌體作為載藥系統(tǒng)提高中藥療效的研究已備受關(guān)注[17]。外泌體作為藥物載體可在多種疾病中發(fā)揮重要作用。有研究[18]表明，外泌體因其天然良好的穩(wěn)定性，以及能較好地穿越腦血屏障的特點，在腦部疾病中可作為良好的載 體。此外，外泌體作為載體在中藥治療腫瘤中也具有不可忽視的作用，如張婷等[19]在研究中發(fā)現(xiàn)，姜黃素預(yù)處理的外泌體可通過誘導(dǎo)細胞凋亡減緩肝癌的進程。然而關(guān)于姜黃素預(yù)處理的外泌體是否對ACC-M 細胞也具有顯著的作用，此前學(xué)界還不清楚。

不少學(xué)者[20]已經(jīng)證實間充質(zhì)干細胞可通過分泌因子發(fā)揮對疾病的治療作用。本研究通過體外培養(yǎng)將姜黃素與人BMSCs 共培養(yǎng)，然后將載有姜黃素的BMSCs 外泌體與ACC-M 細胞共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，載有姜黃素的BMSCs 外泌體與ACC-M 細胞培養(yǎng)后，ACC-M 細胞的存活率、遷移及細胞數(shù)均明顯減少，提示載有姜黃素的BMSCs 外泌體可以發(fā)揮顯著的抑癌作用；同時還發(fā)現(xiàn)載有姜黃素的BMSCs 外泌體處理組對ACC-M 細胞活力、遷移和侵襲能力的抑制作用顯著高于單獨使用姜黃素處理組，提示以BMSCs 外泌體為載藥載體可增強姜黃素對腺樣囊性癌的療效。

本研究發(fā)現(xiàn)，攜帶姜黃素的BMSCs 外泌體可顯著降低TGF-β1 和p-ERK 蛋白表達水平，表明攜帶姜黃素的BMSCs 外泌體可能通過調(diào)節(jié)TGF-β1/ERK 信號通路發(fā)揮抑癌作用。有研究[21]已經(jīng)證實，TGF-β1/ERK 信號通路的激活會加速腫瘤的進展，且誘導(dǎo)多種促癌蛋白的發(fā)生；相反，TGF-β1/ERK 信號通路的抑制可明顯抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移速度[22]。我們的研究結(jié)果與先前學(xué)者的報道[21]相似。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)人BMSCs 分泌的外泌體可作為姜黃素的載體抑制ACC-M 細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，并調(diào)控TGF-β1/ERK 信號通路。本研究為今后間充質(zhì)干細胞源性外泌體治療ACC 提供參考。然而本研究仍然存在不足之處，外泌體作為載藥系統(tǒng)對姜黃素藥用價值的提高效率仍需進一步確定。