賈倩芳,李習(xí)婉

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 康復(fù)醫(yī)學(xué)科,河南 新鄉(xiāng) 453199)

慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)是心臟結(jié)構(gòu)或功能發(fā)生異常而導(dǎo)致心室充盈、射血功能下降的臨床綜合征,液體潴留、呼吸困難、運動耐量下降[1]為主要表現(xiàn)。CHF是各類心血管疾病惡化或終末階段,住院率及病死率居高不下。流行病學(xué)資料顯示,2012—2015年我國35歲以上的心力衰竭總患病率為1.3%,近15年增長了44%,病死率達(dá)4.1%[2]。因此,防治心力衰竭已成為我國重要民生問題。歐洲心臟病指出,心力衰竭的常用藥物有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、抗醛固酮劑、β受體阻滯劑、利尿劑、強心苷類等,盡管可在短期內(nèi)提供較好療效,但長期使用易產(chǎn)生不良反應(yīng),如長期使用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑可引起肝功能損傷、中性粒細(xì)胞減少等,β受體阻滯劑可導(dǎo)致血壓降低,利尿劑可導(dǎo)致低鉀血癥、心律失常等問題[3-5]。

《慢性心力衰竭中西醫(yī)結(jié)合診療專家共識》[6]指出,中藥聯(lián)合西藥能起到協(xié)同增效的作用,可明顯改善CHF患者臨床癥狀,增加活動耐量,甚至改善患者遠(yuǎn)期預(yù)后。升陷湯源于清末醫(yī)家張錫純的《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》,組方為黃芪、柴胡、升麻、桔梗、知母,是大氣下陷病證的代表方劑[7]。大量臨床研究顯示,以升陷湯為基礎(chǔ)方治療慢性心力衰竭臨床療效顯著[8-9],但其治療CHF的作用機制尚不明確。經(jīng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究,中藥復(fù)方可通過多成分、多靶點、全方位發(fā)揮治療作用,與中醫(yī)的整體觀念和辨證論治方法相符合[10-11]。本研究使用相關(guān)數(shù)據(jù)庫對升陷湯治療CHF進(jìn)行數(shù)據(jù)整合并分析,以提供進(jìn)一步的理論支持。

1 升陷湯活性成分及靶點預(yù)測

將5味中藥輸入中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(Traditional Chinese Medicines Syestems Pharmacology Platform,TCMSP),通過口服利用度(OB≥30%)、類藥性(DL≥0.18)2項指標(biāo)篩選活性成分,建立數(shù)據(jù)庫。在TCMSP、Swiss Target Prediction、Pubchem三大數(shù)據(jù)庫里獲取藥物活性成分作用靶點,整合并刪除重復(fù)值,建立藥物靶點蛋白數(shù)據(jù)庫。

1.1 CHF的靶點預(yù)測

以“chronic heart failure”為檢索詞,登錄GeneCard[12]數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫、Drugbank[13]數(shù)據(jù)庫查找CHF的常見靶點,合并每個疾病數(shù)據(jù)庫靶點,去重處理后得到CHF最終靶點。取藥物及疾病交集靶點,作為潛在靶點。

1.2 PPI網(wǎng)絡(luò)及藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

將潛在靶點上傳至String數(shù)據(jù)庫,設(shè)置置信度>0.7,進(jìn)行蛋白互作分析,并利用Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行拓?fù)浞治?獲得核心基因,構(gòu)建升陷湯-有效成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 升陷湯治療CHF靶點功能通路富集分析

通過David數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能通路富集,并可視化處理富集結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥物活性成分及靶點篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中,通過OB、DL值,得到升陷湯有效成分共56個;對應(yīng)靶點1 108個,去除重復(fù)值得到295個靶點。見表1。

表1 升陷湯藥物活性成分

表1(續(xù))

2.2 疾病靶點預(yù)測

使用 GeneCards數(shù)據(jù)庫搜索“chronic heart failure”,查找與CHF相關(guān)靶點,提取評分較高(score≥5)的相關(guān)基因靶點,共得到 4 525 個;使用OMIM數(shù)據(jù)庫,去除重復(fù)值,最終得到618個基因靶點;使用Drugbank數(shù)據(jù)庫,得到CHD相關(guān)基因靶點10個;合并并刪除重復(fù)值,得到4 988個靶點。

2.3 潛在靶點預(yù)測

使用 Venny 2.1在線作圖工具,將升陷湯靶點與CHF靶點取交集,獲得作用靶點141個。見圖1。

CHF為慢性心力衰竭。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)及升陷湯-有效成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過String平臺對升陷湯治療CHF潛在靶點進(jìn)行靶標(biāo)蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,得到蛋白結(jié)構(gòu)及功能與基因之間相互作用關(guān)系,將TSV文件導(dǎo)入Cytoscape軟件,得到節(jié)點139個,邊2 113條的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖,如圖2所示。得到中介中心度(betweenness centrality,BC)、接近中心度(closeness centrality,CC)、度值(Degree)和基于局部平均連接度的方法(LAC)的中位數(shù)分別是113.606 8、0.566 738、46.5、30.564 39,得到節(jié)點21個,按Degree值排序,分別為PTGS2、STAT3、TP53、EGFR、MMP9、BCL2L1、CASP3、IL-10、IL-6、TNF、HSP90AA1、HIF-1α、AKT1、CCND1、VEGFA、MTOR、PPARG、RELA、MAPK14、ESR1、ERBB2。如圖3所示。其中度值越大,成為核心基因[14]可能性越大,將中藥、有效成分、靶點導(dǎo)入Cytoscape軟件中,構(gòu)建“中藥-有效成分-靶點”網(wǎng)絡(luò),如圖4所示。通過分析,kaempferol、quercetin、stigmasterol、isorhamnetin、luteolin、7-O-methylisomucronulatol、formononetin等可能是治療CHF的主要活性成分。見表2。

圖2 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 核心基因篩選

圖4 藥物-有效成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)

表2 關(guān)鍵活性成分

2.5 基因本體(gene ontology,GO)功能與京都基因和基因百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析

GO富集分析得到362個條目,分別是生物過程(biological process,BP),細(xì)胞組成(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)3個方面,其中BP 290條,CC 26條,MF 46條,分別取P值排名前20的條目繪制氣泡圖,見圖5、6、7。GO富集結(jié)果顯示,分子功能主要涉及酶結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合、同一蛋白結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合、一氧化氮合酶調(diào)節(jié)活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、組蛋白脫乙酰酶結(jié)合等;生物過程主要涉及RNA聚合酶Ⅱ啟動子對pri-miRNA轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、基因表達(dá)的正調(diào)節(jié)、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、肽基絲氨酸磷酸化的正調(diào)控、轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、DNA模板化、細(xì)胞對缺氧的反應(yīng)、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)節(jié)、平滑肌細(xì)胞增殖的正調(diào)控等;細(xì)胞組成主要涉及高分子復(fù)合物、細(xì)胞質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、細(xì)胞溶膠、核質(zhì)、谷氨酸能突觸等。KEGG富集結(jié)果顯示,升陷湯治療CHF主要涉及AGE-RAGE信號通路、HIF-1信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路、PI3K-Akt信號通路。見圖8。

GO為基因本體;BP為生物過程。

GO為基因本體;CC為細(xì)胞組成。

GO為基因本體;MF為分子功能。

KEGG為京都基因和基因百科全書。

3 討論

CHF作為一種臨床綜合征,是多種心血管疾病發(fā)展的終末階段,以改善腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、交感神經(jīng)系統(tǒng)及利鈉肽系統(tǒng)紊亂,從而抑制心肌纖維化及心室重塑,改善臨床癥狀及預(yù)后[15]。中醫(yī)古籍中無“心力衰竭”的記載,但根據(jù)臨床癥狀可將慢性心力衰竭歸屬于“水腫、心悸、喘證”等,其病位在心,關(guān)乎五臟,總為本虛標(biāo)實,其中心氣、心陽虧虛為本,血瘀、水停為標(biāo)。王振濤教授認(rèn)為CHF以本虛為發(fā)病基礎(chǔ),宗氣虧虛而下陷是CHF的主要病機,并認(rèn)為CHF早期出現(xiàn)心悸、氣短、呼吸困難、乏力的癥狀與宗氣虧虛有關(guān)[15]。張錫純的《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》大氣下陷病證中有多半屬于CHF臨床癥狀,認(rèn)為大氣下陷雖然像喘,其實是大氣下陷太甚,呼吸無力,而代償性努力呼吸的表現(xiàn)。因此,益氣升陷為治療CHF的根本大法。張超等[16]通過觀察加味升陷湯對氣虛水停型CHF臨床療效,發(fā)現(xiàn)治療組總有效率高于對照組,臨床癥狀、心功能明顯改善。張玉煥等[17]通過研究發(fā)現(xiàn)升陷湯隔藥灸治療氣虛血瘀型慢性心力衰竭的效果顯著,且明顯降低患者血清氨基末端腦鈉肽前體、炎癥因子水平。

升陷湯治療CHF臨床療效確切,但目前鮮有文獻(xiàn)報道升陷湯治療CHF的機制。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對其分析示:從56種活性成分中篩選出山奈酚、槲皮素、豆甾醇、異鼠李素、木犀草素、芒柄花黃素、黃芪皂苷類等10個關(guān)鍵活性成分;從141個交集靶點篩選出PTGS2、EGFR 、TP53、STAT3、MMP9等20個重要靶點;通過KEGG富集篩選出AGE-RAGE信號通路、PI3K-Akt信號通路、IL-17信號通路、HIF-1信號通路、TNF信號通路等重要通路。升陷湯可能抑制心肌細(xì)胞凋亡、改善心室重塑、抑制炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激發(fā)揮治療CHF的作用。

3.1 關(guān)鍵活性成分分析

本研究發(fā)現(xiàn)升陷湯治療CHF的主要活性成分有6大類,分別是山柰酚、槲皮素、豆甾醇、異鼠李素、木犀草素、黃芪皂苷類等。其中山柰酚、槲皮素、木犀草素、異鼠李素都屬于黃酮類化合物,山柰酚可調(diào)節(jié)SIRT1介導(dǎo)的線粒體途徑,減輕心肌細(xì)胞損害[18],并可通過TLR4/NF-κB途徑產(chǎn)生抗心肌細(xì)胞凋亡作用[19]。槲皮素可通過調(diào)控AKT1-eNOS-MMP9通路減少HF細(xì)胞模型凋亡蛋白的表達(dá),抑制CHF的病理生理進(jìn)程[20]。木犀草素可能通過活化PI3K/Akt/mTOR信號通路,改善CHF大鼠心功能,抑制心室重塑[21-22]。異鼠李素通過調(diào)控H9c2心肌細(xì)胞自噬和凋亡通路蛋白表達(dá),提高細(xì)胞存活率,減輕心肌細(xì)胞損傷[23],抑制心肌TGF-β/Smad信號通路,改善心肌纖維化[24]。芒柄花黃素可降低乳酸脫氫酶活性、肌酸激酶及丙二醛水平,升高超氧化物歧化酶活性,對H9c2心肌細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用[14]。黃芪皂苷可通過抑制 PI3K/Akt/mTOR信號通路磷酸化,調(diào)節(jié) Bcl-2、Bax蛋白表達(dá),從而抑制心肌細(xì)胞凋亡[25-26]。

3.2 關(guān)鍵靶點結(jié)果分析

通過Degree值得出核心靶點,PTGS2、STAT3、TP53、EGFR、MMP9、BCL2L1、CASP3、IL-10、IL-6、TNF、HSP90AA1、HIF-1A、AKT1、CCND1、VEGFA、MTOR、PPARG、RELA、MAPK14、ESR1、ERBB2。PTGS2參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等多種病理過程[27]。STAT3參與細(xì)胞生長、凋亡等過程,可抑制轉(zhuǎn)錄活性減少內(nèi)皮細(xì)胞的增值、遷移及血管形成[28]。TP53作為轉(zhuǎn)錄因子,能調(diào)節(jié)心肌素的表達(dá),通過抑制TP53介導(dǎo)的心肌素表達(dá)而抑制心肌細(xì)胞自噬,減輕心肌缺血及再灌注損傷[29]。心肌缺血再灌注時產(chǎn)生大量炎癥因子,IL-10、IL-6作為有效的炎癥抑制因子,在下調(diào)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[30]。AKT1對心臟的影響表現(xiàn)為抑制心肌細(xì)胞凋亡,有研究表明,心力衰竭小鼠p-AKT1呈低表達(dá),因此,激活A(yù)KT1對CHF具有一定治療作用[31]。進(jìn)一步說明升陷湯加減可以多成分、多靶點作用于CHF。

3.3 通路與生物進(jìn)程分析

GO富集分析結(jié)果表明,升陷湯的作用靶點分布于多種細(xì)胞結(jié)構(gòu),以高分子復(fù)合物、細(xì)胞質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、細(xì)胞溶膠、核質(zhì)、谷氨酸能突觸最為顯著。升陷湯成分主要在酶結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合、同一蛋白結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合、一氧化氮合酶調(diào)節(jié)活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等分子層面發(fā)揮作用,有多個生物學(xué)過程參與,主要與氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等有關(guān)。

KEGG富集結(jié)果顯示,升陷湯治療CHF主要涉及的通路是:AGE-RAGE信號通路、HIF-1信號通路、IL-17信號通路、PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路等。PI3K-Akt信號通路可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂、分化、凋亡等生物學(xué)過程,是CHF主要涉及信號通路的中心環(huán)節(jié),激活該通路可保護(hù)離體大鼠心臟心肌細(xì)胞免受損傷[32],激活PI3Kα促進(jìn)TNF-β和miR-21表達(dá),抑制心肌增厚肥大,PI3K-Akt信號通路的下游靶點mTOR、GSK3、Fox Os等亦可參與CHF過程[33]。AGEs通過與其受體RAGE結(jié)合,引發(fā)氧化應(yīng)激,通過激活核因子κB誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)及平滑肌增生從而導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷,該通路主要在糖尿病引起的心肌病中發(fā)揮重要作用[34]。HIF-1信號通路[35]、IL-17信號通路[36]均參與心肌纖維化、心室重塑的病理過程。由此說明升陷湯加減治療CHF可通過多條信號通路參與治療CHF,并推測其治療機制可能與調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡、改善心室重塑關(guān)系最為密切。

4 結(jié)論

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn),升陷湯治療CHF通過多成分、多靶點等途徑發(fā)揮作用,其主要物質(zhì)基礎(chǔ)可能是黃酮類、甾醇類、皂苷類,其潛在作用機制可能是抑制心肌細(xì)胞凋亡、改善心室重塑、抑制炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激等方面,為進(jìn)一步分子機制驗證提供理論基礎(chǔ)及方向。