馮瑞超, 汪漢成, 邱雪柏, 蔡劉體, 陸 寧, 許靈杰, 章松柏

(1.貴州省煙草科學(xué)研究院，貴陽(yáng) 550081；2.長(zhǎng)江大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025；3.中國(guó)煙草總公司貴州省公司，貴陽(yáng) 550000)

煙草是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中容易受到多種病原菌的侵染，其中煙草赤星病 (tobacco brown spot) 是由鏈格孢菌Alternaria alternata引起的煙草葉部真菌病害。它具有潛育期短、間歇性爆發(fā)流行的特點(diǎn)[1]，在溫濕度適宜的條件下，短時(shí)間內(nèi)可大面積流行，危害嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致減產(chǎn)達(dá)50%以上[2]。目前，煙草赤星病的防治主要以化學(xué)防治為主，但由于化學(xué)農(nóng)藥長(zhǎng)期不合理使用會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生抗藥性菌株[3]、農(nóng)藥殘留及污染環(huán)境[4]，已有針對(duì)亞胺類殺菌劑[5]、三唑類殺菌劑[6]、苯并咪唑類殺菌劑和二甲酰亞胺類殺菌劑[7]抗性菌株的報(bào)道。相較而言，生物農(nóng)藥具有易降解、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)而受到研究者的關(guān)注。

農(nóng)用抗生素是微生物發(fā)酵產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，能有效抑制或殺滅農(nóng)作物病原菌并調(diào)節(jié)作物生長(zhǎng)發(fā)育[8]，已有諸多應(yīng)用抗生素防治煙草赤星病的相關(guān)報(bào)道[9-12]。目前，關(guān)于農(nóng)用抗生素對(duì)煙草的研究大多局限于田間防控，而殺菌劑在對(duì)靶向病原菌起作用的同時(shí)，往往可能會(huì)導(dǎo)致生物體脫靶效應(yīng)，從而導(dǎo)致微生物環(huán)境的生態(tài)失衡[13]。

葉際是一個(gè)大型的微生物棲息地，提供許多不同的微生境[14]。葉際微生態(tài)是葉際微生物與其宿主長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成的相對(duì)穩(wěn)定的生態(tài)系統(tǒng)[15]。葉際生態(tài)系統(tǒng)中的微生物群落組成是高度多樣的，包括各種真菌、細(xì)菌、藻類、病毒、原生生物和線蟲(chóng)等，分為有益菌和致病菌[16-17]。煙葉上存在多種植物病原菌，包括鏈格孢菌[18]、立枯絲核菌Rhizoctonia solani[19]、曲霉菌Aspergillus[20]等；同時(shí)也存在多種益生菌，包括泛菌Pantoea[21]、假單胞菌P s e u d o m o n a s[22]、鞘氨醇單胞菌Sphingomonas[23]等。葉際微生物群落的變化往往是整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)健康和生存能力變化的前提，當(dāng)葉際微生態(tài)失衡后，往往會(huì)引起嚴(yán)重的后果，如冰核活性細(xì)菌可以加重農(nóng)作物凍害[24]。研究不同持效期內(nèi)農(nóng)用抗生素的微生物群落結(jié)構(gòu)和代謝功能的變化規(guī)律可以從微觀預(yù)測(cè)植物的健康變化趨勢(shì)。

多抗霉素是由金色鏈霉菌分泌的一類肽嘧啶核苷酸抗生素，主要作用于抑制病原菌細(xì)胞壁幾丁質(zhì)合成，抑制病原菌芽管和菌絲體局部擴(kuò)展，從而導(dǎo)致病原菌死亡[25]。該藥劑被廣泛用于防控各種作物病害，包括水稻稻瘟病、果實(shí)灰霉病、梨黑斑病等[26]。迄今，已有多抗霉素田間防控?zé)煵莩嘈遣?yīng)用的報(bào)道[12]，然而，其施用后不同時(shí)期煙葉葉際微生物群落結(jié)構(gòu)和代謝功能的變化規(guī)律尚不清楚。為此，本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)和Biolog-ECO 技術(shù)，分析多抗霉素施藥前后健康與感病煙葉葉際微生物群落結(jié)構(gòu)及代謝功能，旨在從微觀層面揭示施用多抗霉素防控?zé)煵莩嘈遣〉奈⑸鷳B(tài)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試煙草品種‘云煙105’，由云南煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供；1 0% 多抗霉素可濕性粉劑(polyoxin 10% WP)，購(gòu)自青島瀚生公司；DNA 提取試劑盒 (Fast DNA? Spin Kit for Soil)，購(gòu)自MP Biomedicals 生物醫(yī)學(xué)公司；Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns 建庫(kù)試劑盒 (貨號(hào)：4471252)和GeneJET 膠回收試劑盒 (貨號(hào)：K0691)，均購(gòu)自Thermo Fisher Scientific 公司 (美國(guó))；Biolog ECO 代謝板 (貨號(hào)：#1056) 購(gòu)自美國(guó)Biolog 公司(USA，CA，Hayward)；多功能噴霧施肥器 (型號(hào)：DSF01A-20-100)，購(gòu)自貴州黔豐源農(nóng)業(yè)科技開(kāi)發(fā)有限公司。自動(dòng)氣象站 (由雨量計(jì) (MC-YL)、溫度計(jì) (MC-KWS) 和濕度計(jì) (MC-KWS) 等組成)，購(gòu)自北京新紅科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

田間試驗(yàn)在貴州省畢節(jié)市威寧縣黑石頭鎮(zhèn)感染赤星病的煙田進(jìn)行，其中病葉率為20%～30%。選取長(zhǎng)勢(shì)相似的煙田劃分小區(qū)，各小區(qū)遵循隨機(jī)排列原則，每小區(qū)選擇60 株煙株，設(shè)多抗霉素和清水對(duì)照2 個(gè)處理，進(jìn)行3 次重復(fù)。10%多抗霉素WP 田間推薦劑量為有效成分0.15 kg/hm2，用水量為900 L/hm2，使用背負(fù)式噴霧器對(duì)煙株正、反葉面進(jìn)行均勻噴施，直至液滴流失，對(duì)照組噴施清水。

使用自動(dòng)氣象站檢測(cè)并記錄試驗(yàn)過(guò)程中的溫度、濕度和降雨量，并分別于施藥前0 d、施藥后5、10 和15 d，各小區(qū)隨機(jī)選取20 株煙株調(diào)查煙葉發(fā)病情況，計(jì)算各時(shí)期的病情指數(shù)。病級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照GB/T23222 的規(guī)定：0 級(jí)，全葉無(wú)病斑；1 級(jí)：病斑面積占葉片面積的1% 以下；3 級(jí)，病斑面積占葉片面積的2%～5%；5 級(jí)，病斑面積占葉片面積的6%～10%；7 級(jí)，病斑面積占葉片面積的11%～20%；9 級(jí)，病斑面積占葉片面積的21%以上[27]。按公式 (1) 計(jì)算病情指數(shù) (I)。

式中，Ni為i級(jí)病葉數(shù)；Vi為i病級(jí)值；N為調(diào)查總?cè)~數(shù)。

1.3 樣品采集

于施藥前0 d 及施藥后5、10、15 d 分別取樣，采用消毒剪刀分別剪取煙株中下部相同部位的感病與健康煙葉組織樣品，分別裝入50 mL 無(wú)菌離心管中，每個(gè)處理3 次重復(fù)。樣品編號(hào)如表1所示。

表1 樣品采集信息Table 1 Sample information

1.4 煙葉葉際真菌和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性的變化規(guī)律

參照DNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)不同時(shí)期所取煙葉樣品中微生物基因組DNA 進(jìn)行提取，先用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其純度和濃度，再將提取的DNA 用無(wú)菌水稀釋至濃度為1 ng/μL。以此為模板，使用真菌引物ITS1-1F-R (5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’) 和ITS1-5F-F (5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’) 及細(xì)菌引物806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’) 和515F(5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’)，分別對(duì)真菌ITS1 區(qū)域[28]與細(xì)菌V4 區(qū)域[29]進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物回收后，使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns 建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建，采用Illumina MiSeq 測(cè)序平臺(tái)對(duì)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙端測(cè)序分析。以上分析均在北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.5 煙葉葉際微生物代謝功能的變化規(guī)律

分別取施藥前后感病與健康混合煙樣各2 g，將其分別置于盛有50 mL0.8% 無(wú)菌生理鹽水的100 mL 三角瓶中，在28 ℃、180 r/min 條件下振蕩搖培2 h，靜置30 min；取100 μL 上清液，依次分別加入到ECO 代謝板的測(cè)試孔中[30]，密封后置于OmniLog 恒溫培養(yǎng)箱，于28 ℃條件下培養(yǎng)7 d，采用Biolog D5E_OKA_data.exe 軟件收集葉際微生物生長(zhǎng)過(guò)程中代謝孔的顏色變化值，用HemI 軟件制作熱圖并分析樣品葉際微生物的代謝功能[31]。

1.6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理[32]，對(duì)真菌和細(xì)菌的alpha 多樣性指數(shù)進(jìn)行差異顯著性分析。利用QIIME 軟件 (1.9.1 版) 對(duì)不同時(shí)間序列樣本的微生物群落多樣性 (香農(nóng)和辛普森指數(shù))、豐富度(Chao1 指數(shù))、商品覆蓋率指數(shù)和beta 多樣性進(jìn)行計(jì)算。用R 語(yǔ)言工具統(tǒng)計(jì)并繪制真菌、細(xì)菌花瓣圖、物種積累箱形圖、門(mén)屬水平相對(duì)豐度圖，分析樣品微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性。真菌使用Unit(8.2) 進(jìn)行注釋[33]，細(xì)菌使用SILVA132 的SSUrRNA 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋[34]，使用Qiime 軟件計(jì)算alpha 多樣性指數(shù)，使用corr.test 函數(shù)計(jì)算環(huán)境因子與微生物alpha 多樣性及物種間的相互變化關(guān)系數(shù)值并進(jìn)行Spearman 分析。此過(guò)程在北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙葉葉際微生物菌群結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律

2.1.1 操作分類單元 (operational taxonomic units,OTU) 聚類分析 花瓣圖分析結(jié)果 (圖1) 表明，在OTU 水平下，所有樣本共有的真菌OTU 數(shù)為12 種，共有的細(xì)菌OTU 數(shù)為5 種。共有的真菌屬為鏈格孢屬Alternaria、枝孢霉屬Cladosporium、附球菌屬Epicoccum、Symmetrospora、亞隔孢殼屬Didymella、Stagonosporopsis等；共有的細(xì)菌屬為泛菌屬Pantoea、假單胞菌屬Pseudomonas、未分類的立克次體目unidentified Rickettsiales 等。施藥前感病與健康煙葉真菌群落獨(dú)有的OTU 種類數(shù)分別為1 和13 種 (圖1A)，而細(xì)菌群落獨(dú)有的OTU 種類數(shù)為8 和17 種 (圖1B)。施用多抗霉素5、10、15 d 后，健康煙葉中葉際真菌獨(dú)有的OTU 數(shù)分別為14、27、37 種，均高于感病煙葉（分別為2、2、4 種），但兩者均較施藥前增高。而施用多抗霉素5、10、15 d 后，感病煙葉葉際細(xì)菌特有的OTU 分別為8、13、6 種，在10 d 時(shí)達(dá)到峰值；而健康煙葉葉際細(xì)菌特有的OTU 分別為4、1、1 種，較施藥前大幅減少且獨(dú)有OTU 數(shù)低于感病煙葉。

圖1 煙葉樣品真菌 (A)和細(xì)菌 (B) OTU 分布花瓣圖Fig.1 Petal diagrams of OTU distributions of fungi (A) and bacteria (B) in tobacco leaf samples

2.1.2 施用多抗霉素后不同持效期健康煙葉與感病煙葉葉際真菌和細(xì)菌群落alpha 多樣性的變化規(guī)律 alpha 多樣性分析結(jié)果 (表2) 表明，健康與感病煙葉葉際真菌和細(xì)菌群落的測(cè)序覆蓋度指數(shù)均達(dá)到0.96 以上，表明測(cè)序數(shù)據(jù)合理，可以真實(shí)、合理地反映微生物群落的多樣性。在真菌群落結(jié)構(gòu)中，施用多抗霉素前，健康煙葉 (DKJ0) 的多樣性指數(shù) ( Shannon 指數(shù)和 Simpson 指數(shù)) 和豐富度指數(shù) (Chao1) 均高于感病煙葉 (DKB0)，且在多樣性指數(shù)間存在顯著差異。施用多抗霉素后，感病煙葉的多樣性指數(shù) ( Shannon 指數(shù)和 Simpson 指數(shù)) 在5 d 時(shí)分別達(dá)到峰值1.62 和0.47。而健康煙葉在15 d 時(shí)達(dá)到峰值 (分別為3.46 和0.80)，豐富度指數(shù) (Chao1) 無(wú)顯著差異。在細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)中，施用多抗霉素前，健康煙葉 (DKJ0) 與感病煙葉(DKB0) 的多樣性指數(shù) (Shannon 指數(shù)和Simpson指數(shù)) 和豐富度指數(shù) (Chao1) 之間無(wú)顯著差異。施用多抗霉素后，感病煙葉的多樣性指數(shù) (Shannon指數(shù)和Simpson 指數(shù)) 明顯增加，且在5 d 時(shí)達(dá)到峰值2.90 和0.79；而健康煙葉的多樣性指數(shù)則呈下降趨勢(shì)。

表2 煙葉葉際真菌和細(xì)菌alpha 多樣性變化Table 2 The variation of alpha diversity of phyllosphere fungi and bacteria in tobacco leaf samples

由物種積累箱形圖 (圖2) 可知，真菌OTU 數(shù)接近150 種時(shí)，細(xì)菌OTU 數(shù)接近80 種時(shí)，隨著樣本量的加大，箱形圖位置趨于平緩，表明此環(huán)境中的物種并不會(huì)隨樣本量的增加而顯著增多，即抽樣充分，可以進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

圖2 煙葉樣品真菌 (A)和細(xì)菌 (B) OTU 水平物種累積箱形圖Fig.2 Box diagrams of horizontal species accumulations of fungi (A) and bacteria (B) OTU in tobacco leaf samples

2.1.3 施用多抗霉素后不同持效期健康煙葉與感病煙葉葉際真菌和細(xì)菌群落變化規(guī)律 在真菌群落結(jié)構(gòu)門(mén)水平 (圖3A) 上，施藥前健康 (DKJ0) 與感病 (DKB0) 煙葉葉際優(yōu)勢(shì)菌門(mén)均為子囊菌門(mén)(Ascomycota，占比分別為64.20%和94.05%) 和擔(dān)子菌門(mén) (Basidiomycota，6.77% 和2.40%)。施用多抗霉素后，感病煙葉葉際子囊菌門(mén)相對(duì)豐度隨時(shí)間變化不大，而擔(dān)子菌門(mén)相對(duì)豐度呈上升趨勢(shì)且在5 d 時(shí)達(dá)到峰值2.97%；而健康煙葉中子囊菌門(mén)相對(duì)豐度在5 d 時(shí)達(dá)到峰值76.41%，擔(dān)子菌門(mén)相對(duì)豐度呈下降趨勢(shì)。

圖3 多抗霉素施用后煙葉在真菌門(mén)(A)和屬(B)水平上的群落組成Fig.3 Community composition at phylum (A) and genus(B) levels of phyllosphere fungi after polyoxin application

在真菌群落結(jié)構(gòu)屬水平 (圖3B) 上，38.06%的OTU 可以注釋到屬水平。其中優(yōu)勢(shì)菌屬為鏈格孢屬Alternaria、枝孢霉屬Cladosporium、附球菌屬Epicoccum、Boeremia、亞隔孢殼屬Didymella、Symmetrospora、Stagonosporopsis、Plectosphaerella、亡革菌屬Thanatephorus、莖點(diǎn)霉屬Phoma。施用多抗霉素前，感病 (DKB0) 煙葉的鏈格孢屬(84.63%) 顯著高于健康煙葉 (36.56%) (P＜0.05)。施用多抗霉素后，感病煙葉的鏈格孢屬呈下降趨勢(shì)而健康煙葉中的鏈格孢屬呈上升趨勢(shì)且在5 d 時(shí)達(dá)到峰值 (54.14%)；感病煙葉和健康煙葉的枝孢霉屬總體均呈下降趨勢(shì)，在15 d 時(shí)分別下降了12.9%和3.54%；附球菌屬在健康煙葉和感病煙葉中表現(xiàn)出相似的變化情況，均在5 d 時(shí)達(dá)到峰值 (分別為5.69%和6.26%)，此后呈下降趨勢(shì)；Boeremia在健康煙葉中總體呈下降趨勢(shì)，在15 d時(shí)下降了3.67%，而在感病煙葉中總體呈上升趨勢(shì)，在15 d時(shí)上升了5.25%；亞隔孢殼屬在健康煙葉和感病煙葉中均呈上升趨勢(shì)，在健康煙葉中15 d 時(shí)達(dá)到峰值 (5.31%)，而在感病葉片中5 d 時(shí)達(dá)到峰值(3.23%)；Symmetrospora在健康煙葉中總體呈下降趨勢(shì)，而在感病煙葉中隨時(shí)間變化不大；Stagonosporopsis在健康煙葉和感病煙葉中均在5 d 時(shí)達(dá)到峰值 (分別為2.66%和2.59%)；Plectosphaerella在健康煙葉和感病煙葉中均隨時(shí)間變化不大；亡革菌屬僅在施用多抗霉素前的健康煙葉中檢測(cè)到；莖點(diǎn)霉屬在健康煙葉和感病煙葉中均在10 d時(shí)達(dá)到峰值 (分別為0.89%和0.57%)。

在細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)門(mén)水平 (圖4A) 上，施藥前，健康 (DKJ0) 與感病 (DKB0) 煙葉葉際優(yōu)勢(shì)菌門(mén)均為變形菌門(mén) (Proteobacteria，分別為7.16% 和38.81%) 和厚壁菌門(mén) (Firmicutes，分別為16%和0.78%)。施藥后，健康和感病煙葉葉際變形菌門(mén)的相對(duì)豐度均上升，在健康煙葉中于15 d 時(shí)達(dá)到峰值 (12.19%)，而在感病煙葉中于5 d 時(shí)達(dá)到峰值(72%)；厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度在健康和感病煙葉中均隨時(shí)間延長(zhǎng)而下降，在15 d 時(shí)分別下降了15.78%和0.78%。

圖4 多抗霉素施用后煙葉在細(xì)菌門(mén)(A)和屬(B)水平上的群落組成Fig.4 Community compositions at phylum(A) and genus(B) levels of phyllosphere bacteria after polyoxin application

在細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)屬水平 (圖4B) 上，32.65%的OTU 可以注釋到屬水平。其中優(yōu)勢(shì)菌屬為泛菌屬Pantoea、假單胞菌屬Pseudomonas、馬賽菌屬M(fèi)assilia、魏斯氏菌屬Weissella、鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas、未鑒定的立克次氏體目unidentified_Rickettsiales、寒冷桿菌屬Frigoribacterium、甲基桿菌屬M(fèi)ethylobacterium、Pseudokineococcus、科薩克氏菌屬Kosakonia。施用多抗霉素前，感病(DKB0) 煙葉的泛菌屬 (22.93%) 顯著高于健康煙葉(6.26%) (P＜0.05)。施用多抗霉素后，泛菌屬在健康煙葉和感病煙葉的相對(duì)豐度均呈上升趨勢(shì)，且分別在15 d 時(shí)達(dá)到峰值 (分別為6.94%和35.23%)；健康煙葉和感病煙葉中的假單胞菌屬的相對(duì)豐度在15 d 時(shí)分別增加了2.46%和25.84%；馬賽菌屬在健康煙葉中僅在5 d 時(shí)被檢測(cè)到，而在感病煙葉中均被檢測(cè)到且在5 d 時(shí)達(dá)到峰值 (17.45%)；魏斯氏菌屬僅在健康煙葉中0 d 時(shí)檢測(cè)到；鞘氨醇單胞菌屬在健康煙葉中5 d 時(shí)達(dá)到峰值 (1.68%)，而在感病煙葉中的相對(duì)豐度隨時(shí)間延長(zhǎng)而減少；未鑒定的立克次氏體目在健康煙葉和感病煙葉中表現(xiàn)出相似的模式，均在10 d 時(shí)達(dá)到峰值 (分別為1.45%和1.01%)；寒冷桿菌屬和甲基桿菌屬在健康煙葉中僅在5 d 時(shí)被檢測(cè)到，而在感病煙葉中 5 d 時(shí)達(dá)到峰值 (分別為0.56%和0.89%)；Pseudokineococcus僅在健康煙葉5 d 時(shí)和感病煙葉10 d 時(shí)被檢測(cè)到；科薩克氏菌屬在健康煙葉中僅在10 d 時(shí)被檢測(cè)到，而在感病煙葉中在0 和5 d 均被檢測(cè)到。

2.1.4 Spearman 相關(guān)分析 在試驗(yàn)開(kāi)展期間該地區(qū)大部分時(shí)間均有小雨。自動(dòng)氣象站測(cè)量結(jié)果顯示，在施藥前0 d 及施藥后5、10、15 d 時(shí)的降雨量分別為13.60、19.00、11.30 和25.40 mm；溫度分別為18.32、18.97、17.51 和16.54 ℃；空氣相對(duì)濕度分別為82.49%、83.81%、78.99%和90.98%；病情指數(shù)分別為38.33、45.74、65.00、78.89。

本研究對(duì)樣品的取樣時(shí)間、環(huán)境因子 (平均溫度、相對(duì)濕度、降雨量) 及病情指數(shù)與其葉際top50 的菌屬進(jìn)行了Spearman 相關(guān)分析，用來(lái)研究環(huán)境因子與微生物alpha 多樣性和物種之間的相互變化關(guān)系。結(jié)果表明，在真菌屬水平上，取樣時(shí)間與枝孢霉屬和Hannaella相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)；溫度與枝孢霉屬的相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)，與Boeremia的相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)；降雨量和相對(duì)濕度均與Botryotinia的相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)；病情指數(shù)與鏈格孢屬的相對(duì)豐度呈極顯著正相關(guān)，與Symmetrospora、Candida、Dioszegia、Saitozyma的相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān) (圖5A)。

圖5 多抗霉素施用后葉際真菌(A)和細(xì)菌(B)群落的Spearman 相關(guān)分析熱圖Fig.5 Heat maps of Spearman correlation analysis based on phyllosphere fungal (A) and bacterial(B) communities after polyoxin application

在細(xì)菌屬水平上，取樣時(shí)間與unidentified_Lachnospiraceae 和unidentified_Corynebacteriaceae相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)；溫度與Faecalibacterium和Aureimonas的相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)；病情指數(shù)與Pantoea和Pseudomonas的相對(duì)豐度呈極顯著正相關(guān)，與Massilia、Microbacterium的相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān) (圖5B)。

2.2 煙葉葉際微生物代謝功能的變化規(guī)律

2.2.1 煙葉葉際微生物功能組成分析 真菌群落FUNGuild 功能預(yù)測(cè)結(jié)果 (圖6A)：多抗霉素施用前，健康和感病煙葉葉際真菌優(yōu)勢(shì)功能類群均為內(nèi)生菌-植物病原菌類群 (endophyte-plant pathogen)和動(dòng)物病原菌-內(nèi)生菌-植物病原菌-木質(zhì)腐生菌類群 (animal pathogen-endophyte-plant pathogen-wood saprotroph)，且感病組織的動(dòng)物病原菌-內(nèi)生菌-植物病原菌-木質(zhì)腐生菌類群相對(duì)豐度高于健康組織而內(nèi)生菌-植物病原菌類群相對(duì)豐度低于健康組織；多抗霉素施用后，在感病煙葉中，動(dòng)物病原菌-內(nèi)生菌-植物病原菌-木質(zhì)腐生菌類群的相對(duì)豐度在5 d 時(shí)呈下降趨勢(shì)而后逐漸上升；內(nèi)生菌-植物病原菌類群的相對(duì)豐度在5 d時(shí)達(dá)到峰值；健康煙葉中動(dòng)物病原菌-內(nèi)生菌-植物病原菌-木質(zhì)腐生菌類群的相對(duì)豐度在5 d 時(shí)達(dá)到峰值此后逐漸下降，內(nèi)生菌-植物病原菌類群的相對(duì)豐度呈逐漸下降趨勢(shì)。

圖6 FUNGuild 葉際真菌 (A) 和細(xì)菌 (B) 功能注釋聚類熱圖Fig.6 FUNGuild heatmaps of functional prediction of phyllosphere fungi (A) and bacteria (B) in tobacco leaf samples

細(xì)菌群落FUNGuild 功能預(yù)測(cè)結(jié)果 (圖6B)：多抗霉素施用后，健康和感病煙葉葉際細(xì)菌優(yōu)勢(shì)功能類群的相對(duì)豐度未發(fā)生明顯變化，其優(yōu)勢(shì)功能群均為遺傳信息處理類群(genetic information processing)、新陳代謝類群 (metabolism)、未定義類群(unclassified) 和細(xì)胞過(guò)程類群 (cellular processes)。

2.2.2 煙葉葉際微生物代謝功能變化規(guī)律 Biolog ECO 微孔板中含有可供自然界中大部分微生物利用的碳源物質(zhì)，其中包括糖類、氨基酸、羧酸類、雙親化合物、聚合物和胺/氨基化合物共31 種碳源。多抗霉素施用前，健康煙葉 (DKJ0) 能夠代謝除了α-丁酮酸以外的30 種碳源；而感病煙葉能夠代謝除了α-丁酮酸和L-蘇氨酸以外的29 種碳源。

多抗霉素施用后，感病與健康煙葉葉際微生物對(duì)31 種碳源的代謝均受到不同程度抑制，多抗霉素施用5 d 后，感病煙葉可高效代謝25 種碳源，而對(duì)D-木糖、2-羥基苯甲酸、L-苯丙氨酸、4-羥基苯甲酸、α-丁酮酸和苯乙基胺的代謝較差；而健康煙葉受多抗霉素影響較大，此時(shí)無(wú)高效利用碳源。多抗霉素施用10 d 后，感病煙葉葉際微生物的代謝能力進(jìn)一步受到抑制，此時(shí)無(wú)高效代謝碳源；而健康煙葉葉際微生物的代謝活性逐漸恢復(fù)，此時(shí)可高效代謝7 種碳源，包括D-半乳糖醛酸、L-天冬酰胺、吐溫80、D-甘露醇、L-絲氨酸、N-乙酰-D-葡萄糖胺和D-蘋(píng)果酸。多抗霉素施用15 d 后，感病煙葉葉際微生物的代謝活性逐漸恢復(fù)，此時(shí)可高效利用除了丙酮酸甲酯、D-木糖、2-羥基苯甲酸、4-羥基苯甲酸和α-丁酮酸以外的26 種碳源，而健康煙葉此時(shí)無(wú)高效利用碳源(圖7)。

圖7 多抗霉素施用后煙葉葉際微生物代謝功能的聚類熱圖Fig.7 Cluster heat map of the effect of polyoxin on metabolism of tobacco phyllosphere microorganisms

3 結(jié)論與討論

微生物群落是環(huán)境脅迫的敏感指標(biāo)，在維持生態(tài)系統(tǒng)平衡和葉片健康方面均具有不可忽視的作用[35]。本研究采用Illumina 高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)施用多抗霉素后不同持效期內(nèi)煙葉葉際微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，多抗霉素施用前，健康煙葉與感病煙葉的優(yōu)勢(shì)真菌門(mén)均為子囊菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)均為變形菌門(mén)，健康煙葉的子囊菌門(mén)和變形菌門(mén)低于感病煙葉而擔(dān)子菌門(mén)高于感病煙葉，這與劉亭亭等[36]報(bào)道的煙草葉際微生物群落結(jié)構(gòu)相似。煙草赤星病病原菌侵入煙草組織前有一個(gè)旺盛的腐生階段，而子囊菌門(mén)中致病菌較多，其大多為腐生生物[37]，這可能是導(dǎo)致感病煙葉中子囊菌門(mén)顯著高于健康煙葉的原因。變形菌門(mén)在多種農(nóng)作物上均為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，例如水稻、甘蔗、大豆、三葉草、擬南芥[38-40]等。這可能是由于變形菌門(mén)的革蘭氏陰性菌可以依賴群體感應(yīng)分子 (QS) 來(lái)與其他葉際細(xì)菌競(jìng)爭(zhēng)，從而獲得有利的生態(tài)位置[41]。有研究表明，感病擬南芥葉片中變形菌門(mén)細(xì)菌群體過(guò)度增殖可以抑制厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度，而健康葉片可以通過(guò) patterntriggered immunity (PTI) 途徑和MIN7 囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)途徑以及CADI基因共同調(diào)節(jié)葉際微生態(tài)平衡[42]，這可能是導(dǎo)致感病煙葉變形菌門(mén)相對(duì)豐度顯著高于健康煙葉而厚壁菌門(mén)低于健康煙葉的原因。

在真菌屬水平上，感病煙葉中占優(yōu)勢(shì)的真菌屬為鏈格孢屬、枝孢霉屬、Symmetrospora，而健康煙葉中占優(yōu)勢(shì)的真菌屬為鏈格孢屬、枝孢霉屬、Boeremia、亞隔孢殼屬及Symmetrospora；與劉亭亭[36]等發(fā)現(xiàn)感赤星病煙葉與健康煙葉優(yōu)勢(shì)真菌屬為鏈格孢屬、Symmetrospora和枝孢霉屬的結(jié)果類似。在健康煙葉中同樣存在相當(dāng)比例的鏈格孢屬，同時(shí)枝孢菌屬[43]、亞隔孢殼屬[44]和Boeremia[45]均被報(bào)道可使作物致病，表明健康煙葉同樣存在感病風(fēng)險(xiǎn)，一旦微生態(tài)失調(diào)即可導(dǎo)致植物病害的發(fā)生。在細(xì)菌屬水平上，感病煙葉和健康煙葉中占優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌屬均為泛菌屬和假單胞菌屬，Huang 等[46]發(fā)現(xiàn)，煙草Didymella葉斑病中感病煙葉和健康煙葉中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬同樣為泛菌屬和假單胞菌屬。推測(cè)煙草葉際細(xì)菌的種類相對(duì)穩(wěn)定，泛菌屬和假單胞菌屬為煙草葉際常見(jiàn)的優(yōu)勢(shì)菌屬，這可能是由于其能夠利用高絲氨酸內(nèi)酯(AHLs) 來(lái)?yè)屨忌鷳B(tài)位從而成為葉際優(yōu)勢(shì)細(xì)菌[47]，其大多為有益細(xì)菌。

殺菌劑在防控相應(yīng)病害的同時(shí)往往會(huì)影響葉際微生物穩(wěn)態(tài)環(huán)境，如殺菌劑烯肟菌酯施用后，小麥葉片的細(xì)菌群落發(fā)生顯著變化[48]；菌核凈防控?zé)煵莅邪卟〉耐瑫r(shí)，感病與健康葉片的alpha 多樣性均增加[49]。本研究中，多抗霉素施用后，感病煙葉和健康煙葉的真菌多樣性均增加，且健康煙葉真菌多樣性顯著高于感病煙葉，表明多抗霉素不同持效期內(nèi)葉際真菌和細(xì)菌的菌群結(jié)構(gòu)均發(fā)生了改變，推測(cè)其原因可能是多抗霉素施用后促進(jìn)了某些菌群的大量繁殖。Chen 等[50]同樣發(fā)現(xiàn)擬南芥感病葉片微生物多樣性低于健康葉片，推測(cè)植物可以通過(guò)調(diào)節(jié)微生物穩(wěn)態(tài)從而維持植物健康。多抗霉素殺菌劑施用后健康煙葉具有持久的保護(hù)作用，因此在病害預(yù)防和控制方面，建議在早期病情指數(shù)較低時(shí)使用多抗霉素殺菌劑。本研究結(jié)果表明，多抗霉素可以降低感病煙葉和健康煙葉致病菌鏈格孢屬、枝孢霉屬的相對(duì)豐度，與劉亭亭[36]等發(fā)現(xiàn)波爾多液施用后，煙草葉際真菌鏈格孢屬和枝孢霉屬等致病菌的相對(duì)豐度降低結(jié)果相似。在本研究中，多抗霉素不僅作用于鏈格孢屬和枝孢霉屬，同時(shí)感病煙葉中真菌Boeremia、亞隔孢殼屬、附球菌、Stagonosporopsi、莖點(diǎn)霉等潛在病原體的相對(duì)豐度增加，有益細(xì)菌泛菌屬和假單胞菌屬的相對(duì)豐度葉同樣增加；有研究表明，泛菌屬能夠抑制多種真菌或細(xì)菌引起的病害[51-52]，銅綠假單胞菌可以用來(lái)誘導(dǎo)大豆對(duì)灰霉病產(chǎn)生抗性[53]。而這些菌群相對(duì)豐度的改變可能會(huì)直接或間接影響植物的各種生理代謝活動(dòng)，進(jìn)而影響植物的正常生長(zhǎng)。本研究中，健康煙葉中真菌other組微生物明顯增加，高多樣性有助于維持葉際生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定。推測(cè)多抗霉素可能對(duì)煙草葉際益生微生物具有調(diào)控作用，進(jìn)而防控?zé)煵莩嘈遣〉陌l(fā)生。

植物葉際微生物來(lái)源復(fù)雜且呈動(dòng)態(tài)變化，是植物內(nèi)在因素與環(huán)境因子長(zhǎng)期選擇的結(jié)果[54]。本研究對(duì)樣品的取樣時(shí)間、環(huán)境因子 (溫度、相對(duì)濕度和降雨量) 及病情指數(shù)與葉際top50 微生物進(jìn)行了Spearman 相關(guān)分析。結(jié)果表明，病情指數(shù)與鏈格孢屬、泛菌屬、假單胞菌屬的相對(duì)豐度呈極顯著正相關(guān)，與Symmetrospora、Candida、Dioszegia、Saitozyma的相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)。已有研究表明，鏈格孢屬真菌會(huì)產(chǎn)生許多初級(jí)和次級(jí)代謝產(chǎn)物 (SMs)，共計(jì)可產(chǎn)生 70 余種霉菌毒素，從而抑制次級(jí)定植微生物的生長(zhǎng)[55]。本研究中，溫度與枝孢霉屬、Faecalibacterium和Aureimonas的相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)，與Boeremia的相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)。這與韓秋影等[56]、劉偉妍[57]報(bào)道假單胞菌屬和Thalassospira等細(xì)菌屬隨溫度升高數(shù)量急劇降低，紅螺菌科和Ruegeria在32 ℃大幅增加的結(jié)果類似，進(jìn)一步說(shuō)明本文多抗霉素對(duì)葉際微生態(tài)的影響中，環(huán)境因子也起到了一定影響。

本研究測(cè)定了多抗霉素施用前后不同持效期內(nèi)感病與健康煙葉葉際微生物對(duì)糖類、羧酸類、氨基酸、聚合物類、胺類和酚類等6 類共31 種碳源的代謝活性，發(fā)現(xiàn)多抗霉素施用前，健康煙葉能夠代謝除了α-丁酮酸以外的30 種碳源；而感病煙葉能夠代謝除了α-丁酮酸和L-蘇氨酸以外的29 種碳源，α-丁酮酸對(duì)煙草赤星病葉際微生物的抑制效果有待進(jìn)一步研究。多抗霉素施用5 d時(shí)，健康煙葉葉際微生物無(wú)高效利用的碳源，而感病煙葉可高效利用25 種碳源，與謝蘭芬等[58]發(fā)現(xiàn)噴施解淀粉芽孢桿菌B9601-Y2 可以降低玉米葉際微生物碳源代謝活性的結(jié)果類似，這可能是由于健康葉片中不可培養(yǎng)的微生物多于感病葉片。不可培養(yǎng)的微生物在受到外界脅迫時(shí)會(huì)進(jìn)入 VBNC(viable but nonculturable) 狀態(tài)，即保持長(zhǎng)期低代謝活性[59]。進(jìn)一步說(shuō)明多抗霉素在防控?zé)煵莩嘈遣∩暇哂谐中院皖A(yù)防作用，推測(cè)此藥劑提前施用作用更佳，建議將其作為一種預(yù)防保護(hù)性藥劑使用。