馮鈺瑾 楊曉云 趙 昆 劉 芬 宗美男 王 一

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常見的晚期微血管并發(fā)癥之一，透析治療的DN患者5 年生存率僅約50%，早期檢出率低、干預(yù)不及時是導(dǎo)致DN 患者高死亡率的主要原因之一［1］。腎臟纖維化是DN 的主要病理表現(xiàn)，也是識別早期DN的關(guān)鍵［1-2］。腎穿刺活檢是目前臨床診斷DN 的金標(biāo)準(zhǔn)，但其為有創(chuàng)操作，可能引起腰痛、血尿、腎周血腫等并發(fā)癥。超聲分子成像是在超聲造影和分子標(biāo)記基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新興檢查手段，其原理是將特定的分子探針結(jié)合在液態(tài)氟碳納米粒（fluorocarbon nanoparticles，PFP-NPs）上，從而獲得靶向特定抗原或抗體的能力，然后將其通過靜脈注入體內(nèi)，分子探針會靶向結(jié)合其配體，繼而使PFPNPs 在分子探針高表達(dá)區(qū)域累積，PFP-NPs 在低強(qiáng)度聚焦超聲的誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)化為微米級微泡，再通過超聲進(jìn)行檢測［3-4］，其具有靶向性好、能實時顯示病變結(jié)構(gòu)等優(yōu)勢，為組織定性和定量檢測提供了一種無創(chuàng)、實時的新型成像技術(shù)，具有極好的臨床應(yīng)用前景。超聲分子成像的關(guān)鍵在于分子探針的選擇。近期研究［5-6］發(fā)現(xiàn)了一種可與Ⅰ型膠原特異性結(jié)合的新型分子探針——膠原結(jié)合蛋白35（CNA35），可用于Ⅰ型膠原的標(biāo)記。本實驗通過探討CNA35 靶向PFP-NPs 在超聲分子成像檢測DN 大鼠腎臟纖維化中的應(yīng)用價值，旨在為臨床DN 診斷提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、主要實驗材料及儀器

1.主要材料：二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC）、二硬脂酰磷脂酰甘油鈉鹽（DSPG）、二硬脂?；字Ｒ掖及罚―SPE）、二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000-氨基（DSPE-PEG2000-NH2）、3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-羥基丁二酰亞胺（NHS）、膽固醇（CH）均購于德國Merck 公司；細(xì)胞膜紅色熒光探針（DiI）購于美國MCE 公司；全氟正戊烷（PFP）、2-嗎啉乙磺酸（2-MES）、PBST 緩沖液均購于阿拉丁控股集團(tuán)有限公司；含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基購于賽默飛世爾科技（中國）有限公司；轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、HRP 標(biāo)記二抗、DAB 染色試劑盒均購于英國Abcam 公司；DAPI 染色液、鏈脲佐菌素（STZ）均購于德國Sigma公司；FITC標(biāo)記的抗大鼠Ⅰ型膠原蛋白抗體購于美國Arigo公司。

2.主要儀器：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（BK-RE-1A，濟(jì)南程騰生物技術(shù)有限公司）；超聲波處理器（FS-150N，上海生析超聲儀器有限公司）；倒置熒光顯微鏡（DMIL，德國徠卡公司）；低強(qiáng)度聚焦超聲儀（重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所）；正置顯微鏡（Axioscope 5，德國蔡司公司）；超聲成像系統(tǒng)［東芝Aplio 500，上海電氣（集團(tuán)）公司］。

二、主要實驗方法

（一）CNA35靶向PFP-NPs的制備及相關(guān)檢測

1.CNA35 靶向PFP-NPs 的制備：分別稱取10 mg DPPC、4 mg DSPG、3 mg DSPE-PEG2000-NH2或DSPE、3 mg CH 溶解于10 ml 三氯甲烷中，然后再加入100 ml DiI；使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50℃條件下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)1 h，除去有機(jī)溶劑。加入4 ml PBS 緩沖液，在冰水?。?～4℃）條件下，使用超聲波處理器聲振乳化，得到半透明的混懸液，加入液態(tài)PFP后，再次使用超聲波處理器聲振乳化，12 000 g 離心3 次取沉淀，將其加入2-MES 溶液（pH 值為8.0）中混勻即得帶有熒光標(biāo)記的非靶向PFP-NPs 混懸液。另取4 mg EDC、3 mg NHS 溶于1 ml 2-MES 溶液（pH 值為5.2）中，加入50 ml CNA35，冰?。?℃）條件下置于搖床孵育1 h，然后調(diào)節(jié)溶液pH 值至8.0，即為CNA35 溶液。取500 ml 上述制備好的帶有熒光標(biāo)記的非靶向PFP-NPs 混懸液，加入CNA35溶液，4℃避光孵育過夜，即得帶有熒光標(biāo)記的CNA35 靶向PFP-NPs 混懸液。將上述帶有熒光標(biāo)記的非靶向PFP-NPs 混懸液和帶有熒光標(biāo)記的CNA35 靶向PFPNPs混懸液于4℃離心取沉淀，即制得帶有熒光標(biāo)記的非靶向PFP-NPs和CNA35靶向PFP-NPs［5］。

2.CNA35靶向PFP-NPs體外靶向性檢測及體外超聲分子成像觀察

（1）體外靶向性檢測：將人腎小管上皮HK-2 細(xì)胞加入含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞貼壁生長至80%左右時，加入濃度為5 ng/ml TGF-β誘導(dǎo)上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，24 h后將細(xì)胞分為非靶向組和靶向組（每組6個復(fù)孔），然后分別將非靶向PFP-NPs 和CNA35 靶向PFP-NPs（1×104個/ml）加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，37℃孵育1 h，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS緩沖液洗滌3次，加入DAPI染色液進(jìn)行細(xì)胞核染色，并于倒置熒光顯微鏡下觀察非靶向組和靶向組細(xì)胞上PFP-NPs熒光信號（即紅色區(qū)域面積）。

（2）體外超聲分子成像觀察：取上述1 ml CNA35靶向PFP-NPs 混懸液置入凝膠模具中，低強(qiáng)度聚焦超聲儀體外給予超聲輻照（工作頻率：650 kHz，焦距：125 mm，功率：0.2 W/cm2，輻照時間：60 s），觀察并比較輻照前后超聲分子成像信號強(qiáng)度。

（二）DN大鼠模型建立

選擇健康清潔級6～8 周齡SD 大鼠［北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SYXK（京）2022-0026］30 只，體質(zhì)量180～220 g，單籠飼養(yǎng)，自由飲食，12 h 晝夜節(jié)律飼養(yǎng)。其中20 只采用腹腔注射大劑量STZ（65 mg/kg）的方式制備DN 大鼠模型，STZ 注射前禁食、禁水12 h。注射后連續(xù)3 d采集尾靜脈血檢測空腹血糖，當(dāng)空腹血糖均＞16.7 mmol/L，且尿白蛋白＞15 μg/ml視為DN 大鼠模型構(gòu)建成功［7］。本實驗經(jīng)我院動物倫理委員會批準(zhǔn)（2022-AE182）。

（三）CNA35 靶向PFP-NPs 體內(nèi)超聲分子成像觀察及體內(nèi)靶向性檢測

1.體內(nèi)超聲分子成像觀察：將20 只DN 大鼠隨機(jī)分為非靶向組和靶向組，每組各10只。使用戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉大鼠，待完全麻醉，使用超聲成像系統(tǒng)（LA523 探頭，頻率5～9 MHz）對比脈沖序列造影模式進(jìn)行超聲成像，非靶向組與靶向組超聲成像增益、機(jī)械指數(shù)、脈沖重復(fù)頻率、掃描深度、聚焦位置等參數(shù)均相同，待圖像穩(wěn)定后，將30 mg/ml 非靶向PFP-NPs和CNA35 靶向PFP-NPs（1×106個/ml）經(jīng)大鼠尾靜脈分別注入非靶向組和靶向組大鼠體內(nèi)，劑量均為2 ml/kg，隨即推注1 ml生理鹽水沖管，注射10 min、30 min后于造影模式下觀察兩組大鼠腎臟，選取固定大小的感興趣區(qū)檢測超聲分子成像信號強(qiáng)度［7］。

2.體內(nèi)靶向性檢測：于避光條件下處死兩組中各5只DN 大鼠并取出腎臟組織，制備冰凍切片，F(xiàn)ITC 標(biāo)記的抗大鼠Ⅰ型膠原蛋白抗體37℃孵育1 h，PBST 緩沖液洗滌后，加入DAPI 染色液進(jìn)行細(xì)胞核染色，并于倒置熒光顯微鏡下檢測PFP-NPs 熒光信號強(qiáng)度及Ⅰ型膠原熒光信號強(qiáng)度。

（四）腎臟組織病理學(xué)觀察及Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)檢測

將剩余的10只DN大鼠及10只健康大鼠均處死，取腎臟組織制備石蠟切片，對腎臟組織進(jìn)行Masson染色，于正置顯微鏡下觀察腎小球、腎小管的纖維化情況（藍(lán)色區(qū)域面積，陽性組織被染成藍(lán)色）；同時使用抗原修復(fù)液對DN 大鼠腎臟組織進(jìn)行抗原修復(fù)，山羊血清37℃封閉2 h，F(xiàn)TTC 標(biāo)記的兔抗大鼠Ⅰ型膠原蛋白抗體（1∶1000）4℃孵育12 h，PBST 緩沖液洗滌3 次，使用HRP 標(biāo)記二抗37℃孵育1 h，PBST 緩沖液洗滌3次，使用DAB染色15 min，蘇木素復(fù)染、封片，于正置顯微鏡下觀察Ⅰ型膠原陽性（即棕黃色染色）情況，采用ImageJ 軟件計算Ⅰ型膠原染色面積占比，分析超聲分子成像信號強(qiáng)度與Ⅰ型膠原染色面積占比的相關(guān)性。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用GraphPad 8.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以x±s 表示，兩組比較采用t 檢驗。相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、CNA35 靶向PFP-NPs 體外靶向性檢測及體外超聲分子成像觀察

本實驗制備的非靶向PFP-NPs 和CNA35 靶向PFP-NPs 平均粒徑分別為（268.03±4.73）nm、（277.06±5.62）nm。體外實驗結(jié)果顯示，靶向組人腎小管上皮HK-2細(xì)胞上的PFP-NPs熒光信號強(qiáng)度高于非靶向組（388.21±15.28 vs.25.79±3.62），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。CNA35靶向PFP-NPs 經(jīng)體外低強(qiáng)度聚焦超聲輻照后的超聲分子成像信號顯著強(qiáng)于輻照前。見圖2。

圖1 靶向組與非靶向組人腎小管上皮HK-2細(xì)胞倒置熒光顯微鏡下觀（標(biāo)尺為100 μm）

圖2 CNA35靶向PFP-NPs體外低強(qiáng)度聚焦超聲輻照前后超聲分子成像

二、CNA35靶向PFP-NPs體內(nèi)超聲分子成像觀察

靶向組DN大鼠靜脈注射CNA35靶向PFP-NPs后10 min、30 min 腎臟組織超聲分子成像信號強(qiáng)度分別為8.37±1.27、9.73±1.25，均高于非靶向組（1.92±0.25、2.08±1.32），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；且注射后10 min 超聲分子成像信號強(qiáng)度與注射后30 min 比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖3。

圖3 靶向組與非靶向組靜脈注射PFP-NPs后10 min、30 min體內(nèi)超聲分子成像

三、CNA35靶向PFP-NPs體內(nèi)靶向性檢測

腎臟組織切片熒光檢測顯示，靶向組DN大鼠腎臟組織PFP-NPs 熒光信號強(qiáng)度高于非靶向組（946.02±83.55 vs.73.69±21.72），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；靶向組Ⅰ型膠原熒光信號強(qiáng)度與非靶向組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（969.07±96.67 vs.943.39±106.18），且PFPNPs熒光信號與Ⅰ型膠原熒光信號區(qū)域重合。見圖4。

圖4 靶向組DN大鼠體內(nèi)靶向性檢測倒置熒光顯微鏡下觀（紅色區(qū)域為PFP-NPs熒光信號；綠色區(qū)域為Ⅰ型膠原熒光信號）。標(biāo)尺為50 μm

四、DN大鼠腎臟病理檢測

Masson 染色顯示，DN 大鼠腎臟纖維化面積大于健康大鼠腎臟（1527.69±129.66 vs. 147.81±52.36），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖5。

圖5 健康大鼠和DN大鼠腎臟病理圖（Masson染色，×200）

五、超聲分子成像信號強(qiáng)度與Ⅰ型膠原染色面積占比的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析顯示，DN 大鼠腎臟超聲分子成像信號強(qiáng)度與Ⅰ型膠原染色面積占比呈正相關(guān)（r=0.838，P＜0.001）。見圖6，7。

圖6 DN 大鼠腎臟組織Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)圖（G：腎小球；V：腎內(nèi)血管系統(tǒng)）

圖7 DN 大鼠腎臟超聲分子成像信號強(qiáng)度與Ⅰ型膠原染色面積占比的相關(guān)性分析散點圖

討論

纖維化是結(jié)締組織在損傷反應(yīng)中逐漸積累，形成不可修復(fù)性器官損傷，并進(jìn)一步導(dǎo)致器官衰竭的一種病理變化。超聲分子成像能夠使細(xì)胞和亞細(xì)胞活動過程可視化，理論上選擇合適的分子標(biāo)記物可實現(xiàn)分子纖維化途徑的監(jiān)測及量化評估［8］。糖尿病患者持續(xù)高血糖狀態(tài)會損傷腎臟，導(dǎo)致腎間質(zhì)出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤，腎小管上皮細(xì)胞也會凋亡，而來源于腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的肌成纖維細(xì)胞將會聚集并使細(xì)胞外基質(zhì)的生成與降解失衡，從而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，進(jìn)而引發(fā)腎臟纖維化［9］。膠原沉積是DN患者腎臟纖維化的典型病理學(xué)特征。因此，通過合適的分子探針靶向膠原是DN 分子診斷的重要研究方向。既往實驗［10］制備了一種膠原結(jié)合蛋白CNA35，其可特異性結(jié)合纖維化組織中的膠原蛋白；且體內(nèi)和體外成像實驗顯示，CNA35 較目前可用的其他膠原蛋白可視化技術(shù)具有更高的空間分辨率。靜脈注射CNA35 后，可在腎臟和肝臟觀察到膠原蛋白的標(biāo)記，是目前應(yīng)用較為廣泛的纖維化分子診斷標(biāo)記物。

液態(tài)氟碳是一種全氟碳化合物，穩(wěn)定性高且具有攜氧功能，近年來逐漸應(yīng)用于超聲造影劑，并取得良好的效果。液態(tài)氟碳經(jīng)由磷脂殼層包裹成納米級的顆粒后，相變閾值與其粒徑呈負(fù)相關(guān)，即粒徑越小，其相變閾值越高，反之則越低［11-12］。既往實驗［12］指出，PFP-NPs沸點為29℃，但被脂質(zhì)包裹后，在37℃環(huán)境下1 h內(nèi)粒徑未見明顯改變。本實驗成功制備Dil標(biāo)記的非靶向PFP-NPs 及CNA35 靶向PFP-NPs，平均粒徑分別為（268.03±4.73）nm、（277.06±5.62）nm。TGF-β 能夠誘導(dǎo)人腎小管上皮HK-2 細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致大量膠原沉積［13］，因此發(fā)生間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的上皮細(xì)胞可用于體外檢測CNA35 靶向PFP-NPs 的靶向性。體外實驗結(jié)果顯示，靶向組人腎小管上皮HK-2 細(xì)胞上PFPNPs 熒光信號強(qiáng)度高于非靶向組（388.21±15.28 vs.25.79±3.62，P＜0.05），表明CNA35 靶向PFP-NPs 能夠靶向識別膠原蛋白。為了進(jìn)一步探究CNA35 靶向PFP-NPs 對DN 大鼠腎臟纖維化的診斷效果，本實驗利用STZ 誘導(dǎo)構(gòu)建DN 大鼠模型，結(jié)果顯示DN 大鼠腎臟組織有大量纖維沉積，與既往實驗［14］中DN 兔腎臟病理變化一致，提示成功建立了DN 大鼠模型。分別給予DN 大鼠注射CNA35 靶向PFP-NPs 和非靶向PFP-NPs，結(jié)果顯示靶向組DN 大鼠腎臟組織中PFPNPs 熒光信號強(qiáng)度高于非靶向組（P＜0.05）。進(jìn)一步對上述大鼠腎臟組織進(jìn)行Ⅰ型膠原免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，PFP-NPs 熒光信號與Ⅰ型膠原熒光信號區(qū)域重合，表明CNA35靶向PFP-NPs能夠靶向結(jié)合DN大鼠腎臟Ⅰ型膠原纖維沉積部位。體內(nèi)CNA35 靶向PFP-NPs 經(jīng)超聲輻照后，由液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闅鈶B(tài)，超聲分子成像信號較輻照前明顯提高，表明其增強(qiáng)了超聲分子成像效果［15］。本實驗應(yīng)用超聲分子成像觀察DN大鼠腎臟，結(jié)果顯示靶向組DN大鼠腎臟組織注射CNA35靶向PFPNPs 后10 min、30 min 超聲分子成像信號強(qiáng)度分別為8.37±1.27、9.73±1.25，均高于非靶向組（1.92±0.25、2.08±1.32），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；且注射后10 min 超聲分子成像信號強(qiáng)度與注射后30 min 比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；表明CNA35靶向PFP-NPs 能夠靶向結(jié)合大鼠腎臟膠原高表達(dá)部位，實現(xiàn)了對DN 大鼠的靶向超聲分子成像。在超聲分子成像過程中，未與靶點結(jié)合的游離微泡會很快被消除，CNA35 靶向PFP-NPs 多在注射后10 min 即可觀察到，且持續(xù)至注射后30 min，這為今后單次造影劑注射后雙側(cè)腎臟同時成像提供了可能。腎臟纖維化是DN 的基本病理表現(xiàn)，病理學(xué)檢查是診斷DN 的“金標(biāo)準(zhǔn)”，其主要根據(jù)腎臟膠原沉積評估腎臟纖維化程度［16］。本實驗相關(guān)性分析顯示，DN大鼠腎臟超聲分子成像信號強(qiáng)度與Ⅰ型膠原染色面積占比呈正相關(guān)（r=0.838，P＜0.001），表明超聲分子成像在DN 診斷中有一定價值。但CNA35靶向PFP-NPs 與腎臟纖維化組織中膠原靶向結(jié)合效率仍需進(jìn)一步探究。

綜上所述，CNA35 靶向PFP-NPs 能夠靶向結(jié)合大鼠腎臟膠原高表達(dá)部位，實現(xiàn)了對DN大鼠腎臟纖維化的靶向超聲分子成像，為臨床DN診斷提供了理論依據(jù)。