陳玉嬌 江利兵 謝俊 鄭婷 朱子健 許源

（衢州海關(guān) 浙江衢州 324003）

0 引言

魚(yú)子醬（Caviar）由鱘魚(yú)卵腌制而成，富含人體必需的氨基酸、維生素、鈣、鐵和硒等微量元素和不飽和脂肪酸。魚(yú)子醬與松露、鵝肝醬并稱(chēng)為“世界三大美食”，素有“黑色黃金”之稱(chēng)，是國(guó)際上經(jīng)久不衰的名貴高檔食品[1-3]。

近年來(lái)，我國(guó)已發(fā)展成集鱘魚(yú)產(chǎn)品技術(shù)研發(fā)、加工、貿(mào)易于一體的水產(chǎn)食品加工產(chǎn)業(yè)，具備魚(yú)苗繁育、養(yǎng)殖基地、魚(yú)子醬及鱘魚(yú)產(chǎn)品加工和銷(xiāo)售的一整套產(chǎn)業(yè)鏈。目前衢州市是全國(guó)最大的鱘魚(yú)養(yǎng)殖基地，同時(shí)魚(yú)子醬產(chǎn)品的年加工能力為30 余噸，是亞洲地區(qū)最大的魚(yú)子醬加工基地，產(chǎn)品主要銷(xiāo)往歐盟、美國(guó)、日本等國(guó)家和地區(qū)，是頗具潛力及優(yōu)勢(shì)的出口創(chuàng)匯產(chǎn)品。魚(yú)子醬出口貿(mào)易的穩(wěn)定發(fā)展，不僅事關(guān)我市的鱘魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和農(nóng)民增收，也關(guān)系到我國(guó)魚(yú)子醬產(chǎn)業(yè)健康有序的發(fā)展[4-5]。

然而，隨著魚(yú)子醬產(chǎn)業(yè)的興起和發(fā)展，一些歐美、日本等發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)魚(yú)子醬產(chǎn)品的質(zhì)量安全標(biāo)準(zhǔn)越來(lái)越嚴(yán)格，美國(guó)FDA 21 CFR Part 123、歐洲議會(huì)和理事會(huì)（EC）No 852/2004 法規(guī)、歐盟公報(bào)（2003/181/EC）和2004/621/EC 都對(duì)水產(chǎn)品提出了嚴(yán)格的要求，規(guī)定了水產(chǎn)品及其制品中磺胺類(lèi)等禁用物質(zhì)不得檢出[6]。這些都成為制約我國(guó)魚(yú)子醬出口的新的技術(shù)壁壘，使我國(guó)魚(yú)子醬出口面臨嚴(yán)峻形勢(shì)。因此，控制禁用物質(zhì)殘留以保障魚(yú)子醬產(chǎn)品質(zhì)量安全，提高市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，同時(shí)避免類(lèi)似2011 年7 月，歐盟以我國(guó)魚(yú)子醬中孔雀石綠殘留超標(biāo)為由，禁止魚(yú)子醬進(jìn)境從而影響中國(guó)產(chǎn)魚(yú)子醬聲譽(yù)的事件再次發(fā)生，迫切需要對(duì)魚(yú)子醬中禁用物質(zhì)殘留檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行研究。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外越來(lái)越重視關(guān)于磺胺類(lèi)藥物及代謝物殘留檢測(cè)方法的研究[7-19]，但其主要基質(zhì)為雞蛋、畜禽產(chǎn)品（豬、牛、羊、雞）、魚(yú)及水產(chǎn)品等。目前，還未有同時(shí)測(cè)定魚(yú)子醬中磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲基異惡唑和磺胺間甲氧嘧啶等12 種磺胺類(lèi)藥物殘留的固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法的文獻(xiàn)報(bào)道。本文首次建立了通過(guò)正己烷預(yù)處理、固相萃取凈化、超高效液相色譜電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜儀同時(shí)測(cè)定魚(yú)子醬中12 種磺胺類(lèi)藥物的分析方法，該法具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、基質(zhì)干擾小等優(yōu)點(diǎn)，可用于日常大批量魚(yú)子醬樣品中磺胺類(lèi)藥物及其代謝物殘留的定性、定量分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲噻二唑、磺胺甲惡唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基異惡唑、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺吡啶、磺胺間甲氧嘧啶（純度＞97%，北京振翔科技有限公司）；磺胺二甲氧嘧啶-D6、磺胺甲氧噠嗪-D3、磺胺二甲基嘧啶-13C6、磺胺嘧啶-13C6、磺胺吡啶-13C6、磺胺喹噁啉-13C6、磺胺噻唑-13C6（濃度為10.0 μg/mL，北京振翔科技有限公司）。

甲醇、正己烷、乙酸乙酯（色譜純，美國(guó)fisher 公司）；氨水（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲酸（分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；超純水（Millpore 純水儀制備）；MCX 固相萃取小柱（500 mg，6 mL，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）。

魚(yú)子醬樣品由衢州某企業(yè)提供，冷凍保存。

1.2 儀器與設(shè)備

1260-6460 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；MS3 digital 漩渦混合器（德國(guó)IKA 公司）；MD 200 氮吹儀（杭州奧盛儀器公司）；KQ-500B 超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器公司）；Milli-Q Advantage A10 超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millpore 公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 試樣制備

取適量代表性樣品，用組織粉碎機(jī)充分搗碎均勻，裝入樣品袋中，密封、標(biāo)記，于-18℃冷凍保存。

1.3.2 樣品提取

稱(chēng)取樣品5.00 g（精確至0.01 g）于50 mL 帶蓋離心管中，準(zhǔn)確加入0.25mL 內(nèi)標(biāo)混合溶液（10ng/mL）；加入5mL 正己烷，渦旋1min；超聲30min，加入10mL乙酸乙酯，渦旋振蕩提取，6 000 r/min 離心5 min；取上清液，用5 mL 乙酸乙酯重復(fù)提取1 次；合并提取液，45℃下用氮吹儀吹干，加5 mL 水溶解殘?jiān)齼艋?/p>

1.3.3 凈化

將提取液轉(zhuǎn)移至MCX 固相萃取小柱（500 mg/6 mL，使用前依次用5 mL 甲醇和5 mL 水活化）中，用10 mL 水分2 次洗滌離心管，轉(zhuǎn)移至固相萃取小柱，棄去流出液；用5 mL 甲醇-水（1∶1，V/V）淋洗，抽干；用8 mL 5%氨水甲醇洗脫，收集全部洗脫液，在45℃下水浴中用氮吹儀吹干；用1.0 mL 含0.15%甲酸的甲醇-水（2∶8，V/V）溶液溶解，混勻后經(jīng)0.45 μm 有機(jī)相濾膜過(guò)濾后用于上機(jī)分析。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：InertSustain Swift C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：A 為0.15%甲酸水溶液，B 為乙腈，流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 液相洗脫梯度Table 1 Liquid elution gradient

1.3.5 質(zhì)譜條件

電噴霧離子化源（ESI），正離子掃描模式；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；干燥氣溫度（Gas Temp）：325℃；干燥氣流量（Gas Flow）：5 L/min；噴霧氣壓力（Nebulizer）：45 psi；鞘氣溫度（Sheath Gas Temp）：350℃；鞘氣流速（Sheath Gas Flow）：12 L/min；毛細(xì)管電壓（Capillary）：4 000 V；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），采集參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 質(zhì)譜參數(shù)Table 2 MS parameters

1.3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制

分別稱(chēng)取適量12 種磺胺類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成1 000 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，儲(chǔ)存于-20℃冰箱中。取適量各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋成100 ng/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。取適量混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋?zhuān)渲瞥蓾舛葹?.0、2.0、5.0、10.0、20.0 ng/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其中同位素內(nèi)標(biāo)溶液濃度均為5.0 ng/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別取1.0 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及其內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用流動(dòng)注射進(jìn)樣的方式，以30 μL/min 流速，分別對(duì)其母離子掃描從而得到分子離子峰，再對(duì)其進(jìn)行子離子掃描得到碎片離子信息。優(yōu)化各項(xiàng)質(zhì)譜參數(shù)，使母離子與選取的子離子強(qiáng)度達(dá)到最大。優(yōu)化結(jié)果表明，磺胺類(lèi)藥物在正模式下靈敏度較高，目標(biāo)分析物的二級(jí)質(zhì)譜圖，母離子、子離子的質(zhì)量數(shù)均與文獻(xiàn)[20-22]報(bào)道一致。多種磺胺類(lèi)藥物及其代謝物多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖見(jiàn)圖1，磺胺類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液選擇離子色譜圖見(jiàn)圖2。

圖1 磺胺類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatograms of standard of Sulfonamide drugs

圖2 磺胺類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液選擇離子色譜圖Fig.2 Selected ion chromatograms of standard of Sulfonamide drugs

2.2 線(xiàn)性關(guān)系、檢出限和定量限

分別吸取不同濃度的磺胺類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液，用空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，用建立好的方法進(jìn)行分析，以各目標(biāo)分析物與內(nèi)標(biāo)的濃度比為橫坐標(biāo)，目標(biāo)分析物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析，繪制基質(zhì)加標(biāo)工作曲線(xiàn)。得到本方法的線(xiàn)性范圍、回歸曲線(xiàn)方程及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果顯示，在1.0～20.0 ng/mL范圍內(nèi)，12 種磺胺素類(lèi)藥物均呈現(xiàn)出良好的線(xiàn)性關(guān)系（相關(guān)系數(shù)r≥0.99），如表3 所示。在陰性魚(yú)子醬樣品中加標(biāo)測(cè)定，3 倍信噪比對(duì)應(yīng)的加標(biāo)水平為方法的檢出限，10 倍為定量限。該方法的檢出限和定量限符合我國(guó)及歐盟等國(guó)家對(duì)動(dòng)物源性產(chǎn)品中磺胺素類(lèi)藥物殘留限量的要求[23]。

表3 線(xiàn)性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 3 Linear rangs，regression equations，correlation coefficients，recoveries，limit of detection and limit of quantitation

2.3 回收率和精密度

采用本方法對(duì)2018—2020 年采集的320 個(gè)魚(yú)子醬樣品進(jìn)行檢測(cè)，均未檢出磺胺類(lèi)藥物殘留。選取陰性魚(yú)子醬樣品，分別在1.0、2.0 和5.0 μg/kg 共3個(gè)加標(biāo)水平下進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，測(cè)得的回收率和精密度如表4 所示。結(jié)果顯示，魚(yú)子醬中12 種藥物殘留的平均回收率在72.9%～119.0%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.9%～11.0%之間。

表4 實(shí)際空白樣品的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 4 Spiked recoveries rate and relative standard deriations（RSDs）of in real blank samples（n=6）

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

本文采用以基質(zhì)空白配制標(biāo)樣響應(yīng)值（A）與同質(zhì)量濃度溶劑標(biāo)樣響應(yīng)值（B）的比值來(lái)評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)，其計(jì)算公式為Matrix effect（ME）=A/B×100[24-30]。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為5.0 ng/mL 時(shí)，磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲噻二唑、磺胺甲惡唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基異惡唑、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺吡啶和磺胺間甲氧嘧啶的質(zhì)效應(yīng)分別為ME（磺胺噻唑）=44.4%，ME（磺胺嘧啶）=66.3%，ME（磺胺鄰二甲氧嘧啶）=42.6%，ME（磺胺喹噁啉）=32.3%，ME（磺胺甲噻二唑）=49.4%，ME（磺胺甲惡唑）=30.4%，ME（磺胺甲基嘧啶）=79.7%，ME（磺胺二甲基異惡唑）=32.9%，ME（磺胺二甲氧嘧啶）=18.6%，ME（磺胺鄰二甲基嘧啶）=66.6%，ME（磺胺吡啶）=56.4%，ME（磺胺間甲氧嘧啶）=68.1%。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，魚(yú)子醬基質(zhì)對(duì)磺胺噻唑，磺胺嘧啶，磺胺鄰二甲氧嘧啶，磺胺喹噁啉，磺胺甲噻二唑，磺胺甲惡唑，磺胺甲基嘧啶，磺胺二甲基異惡唑，磺胺二甲氧嘧啶，磺胺二甲基嘧啶，磺胺吡啶，磺胺間甲氧嘧啶12 種化合物均表現(xiàn)出較強(qiáng)的基質(zhì)抑制效應(yīng)，為消除基質(zhì)效應(yīng)帶來(lái)的影響，本文采用同位素內(nèi)標(biāo)以及空白基質(zhì)提取液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的溶液等方法來(lái)降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。

3 結(jié)論

本文采用正己烷預(yù)處理，乙酸乙酯重復(fù)提取，MCX 固相萃取柱凈化等前處理方法，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同位素內(nèi)標(biāo)法測(cè)定魚(yú)子醬中痕量磺胺類(lèi)藥物殘留量，通過(guò)對(duì)液相色譜及質(zhì)譜條件的優(yōu)化，經(jīng)驗(yàn)證，方法線(xiàn)性范圍1.00～20.0 ng/mL，相關(guān)系數(shù)均≥0.990，回收率在72.9%～119.0%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.9%～11.0%之間，檢出限為0.5 μg/kg。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法具有操作簡(jiǎn)捷、靈敏度高、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，可以有效解決魚(yú)子醬黏性大、不易提取等問(wèn)題，可用于魚(yú)子醬中痕量磺胺類(lèi)藥物殘留的定性和定量分析，能夠?yàn)轸~(yú)子醬的質(zhì)量控制、風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)及污染物溯源分析提供有力的技術(shù)支撐。