任龍艷，楊 亮，梁 會，曾 真，蔣 玲，王 霞

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550000）

慢性腎功能衰竭即各種慢性腎臟疾病終末期綜合征，病情惡化后導(dǎo)致殘余腎功能難以將機體代謝廢物排出或?qū)?nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性予以維持，引起機體毒物或代謝廢物潴留、酸堿或水電解質(zhì)平衡失調(diào)等內(nèi)環(huán)境紊亂或泌尿功能障礙［1-3］。益腎結(jié)透合劑是貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院臨床治療慢性腎功能衰竭的協(xié)定處方，由白茅根、荷葉、生大黃、生龍骨、生牡蠣、丹參、當(dāng)歸、甘草8味中藥組成，具有降逆泄?jié)帷⒁鏆饣钛墓π?。本研究采用薄層色譜法（TLC）對合劑中的白茅根、荷葉、生大黃進(jìn)行鑒別，并建立高效液相色譜法（HPLC）測定白茅根中綠原酸含量的方法，為益腎結(jié)透合劑的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 儀器 FA2204N型電子天平（上海菁海儀器有限公司）；LC-2040C 3D 型高效液相色譜儀（PDA 檢測器，日本島津儀器有限公司）；UV-5900 型紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司）；OSB-2100 型Eyela 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；低溫冷卻液循環(huán)泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）。

1.2 試藥 益腎結(jié)透合劑（批號分別為20181111、20181112、20181113）由貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院制劑室提供；綠原酸對照品（批號110715-201318，含量為93.3%）由中國食品藥品檢定研究院提供；白茅根、荷葉、生大黃對照藥材（批號分別為20181001、20180101、20180201）均購于貴陽濟(jì)仁堂中藥飲片廠；缺白茅根、荷葉、生大黃的陰性樣品制劑均由貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院制劑室提供；乙腈為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

2.1.1 白茅根 取50 ml 益腎結(jié)透合劑溶液蒸干，殘渣置于50 ml 具塞平底燒瓶中，加入20 ml 乙醚溶液，通過超聲波清洗機超聲提取10 min 后過濾，蒸干，并加入1 ml 乙醚溶液溶解制備得供試品溶液。精密稱取白茅根對照藥材1 g，同法制備白茅根對照藥材溶液。取50 ml 缺白茅根的益腎結(jié)透合劑陰性樣品，同法制備缺白茅根的陰性對照溶液。按2020年版《中華人民共和國藥典》四部中薄層色譜法（通則0502）試驗［4］，分別吸取供試品溶液、白茅根對照藥材溶液和缺白茅根的陰性溶液各4μl，在同一硅膠G 薄層板上點樣，以三氯甲烷為展開劑進(jìn)行展開，取出，晾干，然后在紫外光燈下365 nm 處檢視［5］。結(jié)果顯示，供試品溶液在與白茅根對照藥材色譜相應(yīng)位置上呈現(xiàn)相同顏色的斑點，且陰性對照溶液與供試品溶液之間相互無干擾（圖1A）。

圖1 薄層色譜圖

2.1.2 荷葉 取50 ml 益腎結(jié)透合劑溶液蒸干，殘渣置于10 ml容量瓶中，并用甲醇溶液定容至刻度，超聲提取30 min后過濾，蒸干，再加入0.5 ml甲醇溶液溶解制得供試品溶液。精密稱取荷葉對照藥材1 g，同法制備荷葉對照藥材溶液。取50 ml 缺荷葉的益腎結(jié)透合劑陰性樣品，同法制備缺荷葉的陰性對照溶液。根據(jù)2020 年版《中華人民共和國藥典》四部中薄層色譜法（通則0502）試驗［4］，分別吸取供試品溶液、荷葉對照藥材溶液和缺荷葉的陰性溶液各4μl，于同一硅膠G 薄層板上點樣，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（3∶4∶2∶1）下層液為展開劑進(jìn)行展開［6］，取出，晾干，再噴以稀碘化鉍鉀試液顯色，在紫外光燈下365 nm 處檢視。結(jié)果顯示，供試品溶液在與荷葉對照藥材色譜相應(yīng)位置上呈現(xiàn)相同顏色的斑點，且陰性對照溶液與供試品溶液之間相互無干擾（圖1B）。

2.1.3 生大黃 取100 ml 益腎結(jié)透合劑溶液蒸干，殘渣置于50 ml 具塞平底燒瓶中，精密量取甲醇溶液20 ml 浸泡1 h 后過濾，取5 ml 續(xù)濾液蒸干，殘渣置于10 ml 容量瓶中，用純凈水定容至刻度，再加入1 ml 鹽酸溶液，加熱回流30 min 后，立即冷卻，采用乙醚振搖提取，共提取2次，每次乙醚用量為20 ml，合并濾液后蒸干，加入1 ml 三氯甲烷溶液稀釋制得供試品溶液。精密稱取生大黃對照藥材0.1 g，同法制備生大黃對照藥材溶液。取100 ml 缺生大黃的益腎結(jié)透合劑陰性樣品，同法制備缺生大黃的陰性對照溶液。根據(jù)2020年版《中華人民共和國藥典》四部中薄層色譜法（通則0502）試驗［4］，分別精密吸取供試品溶液、生大黃對照藥材溶液和缺生大黃的陰性溶液各4 μl，于同一硅膠G 薄層板上點樣，以石油醚（30～60 ℃）-甲酸乙酯-甲酸（7∶3∶1）的上層溶液為展開劑進(jìn)行展開［7］，取出，晾干，在紫外光燈下365 nm 處進(jìn)行檢視。結(jié)果顯示，供試品溶液在與生大黃對照藥材色譜相應(yīng)位置上呈現(xiàn)相同顏色的斑點，且陰性對照溶液與供試品溶液之間相互無干擾（圖1C）。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Welch Ultimate PolarRP C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；檢測波長為326 nm；流動相為乙腈-0.05%磷酸水溶液（95∶5）；柱溫為30 ℃；流速為0.8 ml/min；進(jìn)樣量為10μl。其理論塔板數(shù)按綠原酸峰計算應(yīng)不低于4 000。

2.2.2 對照品溶液的制備 取綠原酸對照品在減壓干燥箱內(nèi)60 ℃下干燥4 h，精密稱取0.001 g，置于10 ml 容量瓶中，用70%甲醇溶液定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取益腎結(jié)透合劑150 ml，蒸干，殘渣加入70%乙醇溶液100 ml，加熱回流30 min后過濾，蒸干，殘渣置于50 ml 容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻；精密量取1 ml貯備液置于10 ml容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 陰性溶液的制備 取缺白茅根的益腎結(jié)透合劑陰性樣品適量，按“2.2.3”項下方法制備得陰性溶液。

2.2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性溶液各10μl，按照“2.2.1”項下色譜條件測定峰面積。結(jié)果顯示，對照品溶液與供試品溶液在相同保留時間處有對應(yīng)的色譜峰，與相鄰峰基線分離良好，且與陰性溶液相互無干擾，表明該方法專屬性良好，見圖2。

圖2 HPLC色譜圖

2.2.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取對照品溶液3μl、4 μl、9 μl、12 μl、15 μl、17 μl、20 μl 注入色譜儀，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，以綠原酸進(jìn)樣量（μg）的常用對數(shù)（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）的常用對數(shù)（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=65 304X+62 016（r=0.999 8）。結(jié)果顯示，綠原酸進(jìn)樣量在0.3～2.0 μg 之間與峰面積呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

2.2.7 精密度試驗 分別精密吸取對照品溶液10μl，按照“2.2.1”項下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣測定6 次，結(jié)果綠原酸峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值為1.69%（n=6），表明該儀器精密度良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗 取同一批號（20181111）樣品，按照“2.2.3”項下方法制備供試品溶液6 份，再按照“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)行檢測，記錄其峰面積并計算綠原酸含量，結(jié)果綠原酸的平均含量為4.007 mg/ml，RSD值為2.11%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，分別放置0 h、3 h、6 h、9 h、12 h 后進(jìn)樣檢測，記錄其峰面積。結(jié)果綠原酸峰面積RSD 值為2.08%（n=5），表明供試品溶液在室溫條件下12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.10 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的綠原酸對照品13.96 mg，置于10 ml 容量瓶中，加70%甲醇溶液定容至刻度，搖勻，即得對照品貯備液；分別精密量取6 份已知含量（綠原酸含量為4.24 mg/ml）的樣品（批號：20181111）各0.8 ml，置于50 ml錐形瓶中，再分別精密吸取對照品貯備液（濃度為1.95 mg/ml）各2 ml；按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)行檢測，并記錄峰面積，計算加樣回收率。結(jié)果顯示，平均回收率為100.73%，RSD值為1.75%（n=6），見表3。

表3 加樣回收率試驗結(jié)果

2.2.11 樣品含量測定 取益腎結(jié)透合劑3 批（批號：20181111、20181112、20181113），按照“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，每批平行測定2次，計算各樣品中綠原酸的含量，結(jié)果見表4。

表4 3批樣品含量測定結(jié)果（mg/ml）

通過對3 批益腎結(jié)透合劑樣品進(jìn)行測定，結(jié)果綠原酸平均含量為3.86 mg/ml。從大批量生產(chǎn)規(guī)模角度考慮，制備工藝設(shè)定每瓶為150 ml，根據(jù)80%含量限度計，故本品每瓶含綠原酸（C21H18O11）應(yīng)不得少于463 mg。

3 討 論

在前期預(yù)試驗中，課題組采用薄層色譜法對各味中藥材的成分進(jìn)行了鑒別試驗研究。薄層色譜圖中，荷葉、生大黃、白茅根在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上呈現(xiàn)出同一顏色的斑點，陰性溶液與供試品溶液之間不存在相互干擾的情況，故將其納入鑒別質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。而生龍骨、生牡蠣、甘草及當(dāng)歸雖與其對照品藥材色譜在相應(yīng)位置上呈現(xiàn)出同一顏色斑點，但陰性溶液與供試品溶液之間存在相互干擾；丹參與其對照藥材Rf值未在規(guī)定范圍內(nèi)。因此，此五味中藥材的定性鑒別均未列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案。

綠原酸在醫(yī)藥保健、日用化工及食品等行業(yè)應(yīng)用廣泛［8-9］，具有抑菌、消炎、抗癌、抗病毒、增強免疫調(diào)節(jié)、降糖及降血脂等多種藥理作用［10-11］。課題組通過對益腎結(jié)透合劑處方配伍關(guān)系的分析，并查閱相關(guān)文獻(xiàn)，確定以綠原酸為益腎結(jié)透合劑的含量測定指標(biāo)。在色譜條件的選擇上，曾考察不同比例的流動相對供試品溶液的影響。結(jié)果表明，在流動相進(jìn)行細(xì)微的調(diào)整時，綠原酸色譜峰分離度差異性不大，且綠原酸含量差異不顯著?？紤]到含量最大化、所用時間少等因素，故選用乙腈-0.05%磷酸水溶液（95∶5）為流動相，分離度及峰形均良好，基線較平穩(wěn)，組分間互不干擾。

實驗結(jié)果證明，本研究中建立的方法簡便易行，靈敏度較高，專屬性較強，結(jié)果穩(wěn)定可靠，能較好地控制益腎結(jié)透合劑的質(zhì)量。