羅丹，王燕，丁旭，胡耀（.成都大學(xué)附屬醫(yī)院血液凈化中心，四川成都 6008；.成都大學(xué)附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科，四川成都 6008）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病的常見并發(fā)癥，包括I 型和II 型，是世界各地終末期腎病的主要原因[1]。糖尿病腎病的特征是系膜細胞增殖、系膜細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）增厚、腎肥大和隨后的腎小球硬化。除ECM 蛋白積累外，炎癥也是糖尿病腎病的標志，在該疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用[2]。已有研究[3]報道稱，抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細胞（mesangium cells，MC）ECM 積累和炎癥對于防治糖尿病腎病起到積極效果。

川陳皮素（Nobiletin）是柑橘類水果皮中的一種生物活性物質(zhì)，據(jù)報道其是一種有效的抗炎和抗菌劑[4]。有報道[5]稱，川陳皮素可以改善鏈脲佐菌素-鎘誘導(dǎo)的大鼠糖尿病腎病。川陳皮素可以抑制高葡萄糖誘導(dǎo)的炎癥和ECM 在腎小球系膜細胞的積累[6]。腎小球系膜細胞約占腎小球細胞的1/3，在維持細胞平衡中發(fā)揮重要作用，腎小球系膜細胞是體外研究糖尿病腎病的常見細胞[7]。AMP 激活的蛋白激酶（AMPactivated protein kinase，AMPK）/NOD 樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）信號通路是研究糖尿病腎病的常見通路，有報道[8]稱，通過促進AMPK 表達來抑制NLRP3 炎癥小體活化可以改善糖尿病腎病造成的腎損傷。近期還發(fā)現(xiàn)，川陳皮素可以通過調(diào)控AMPK 途徑促進自噬來改善NLRP3 炎癥小體介導(dǎo)的炎癥，進而對LPS處理的大鼠小膠質(zhì)細胞起到保護作用[9]，故推測川陳皮素可能通過調(diào)節(jié)AMPK/NLRP3通路對LPS誘導(dǎo)的腎小球系膜細胞損傷起到改善效果。

本研究擬探索川陳皮素是否可以通過調(diào)節(jié)AMPK/NLRP3通路來緩解LPS誘導(dǎo)的腎小球系膜細胞炎性損傷，以期為糖尿病腎病的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑 川陳皮素（Nobiletin），純度≥97%，購自美國Sigma-Aldrich 公司，批號：N1538；AMPK/NLRP3 信號通路抑制劑雷帕霉素、LPS、MTT 細胞毒性以及細胞增殖檢測試劑盒、二甲基亞砜（DMSO），購自北京索萊寶生物科技有限公司，批號分別為：R8140、 L8880、 M1020、 D8370； 白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒，購自伊艾博（武漢）科技股份有限公司，批號分別為：E0563h、U0079h、E0133h、E0242h；谷胱甘肽（glutataione，GSH）試劑盒，購自上海齊源生物科技有限公司，批號：QYS-231068；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒，購自北京百奧萊博科技有限公司，批號分別為：SNM203、YT131；兔源一抗AMPK、NLRP3 抗體，購自美國Abcam 公司，批號分別為：ab32047、ab263899。

1.2 主要儀器 Multiskan FC 酶標儀，美國Thermo Fisher 公司；FACSCalibur 流式細胞儀，美國Becton-Dickinson公司。

1.3 細胞培養(yǎng)及分組 大鼠腎小球系膜細胞HBZY-1，購自上海烜雅生物科技有限公司。將購買的HBZY-1細胞接種于DMEM 培養(yǎng)基（10%胎牛血清），置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分為5組：正常組，DMEM培養(yǎng)基（10%胎牛血清）培養(yǎng)HBZY-1細胞，未做其他任何處理；LPS 組，用100 ng·mL-1的LPS 處理HBZY-1 細胞24 h 后加入DMEM 培養(yǎng)基（10%胎牛血清）24 h[3]；川陳皮素組，HBZY-1 細胞在經(jīng)過100 ng·mL-1的LPS 處理24 h 后加入40 μmol·L-1的川陳皮素24 h[10]；雷帕霉素組，HBZY-1 細胞在經(jīng)過100 ng·mL-1的LPS 處理24 h 后加入0.5 μmol·L-1雷帕霉素24 h[11]；川陳皮素+雷帕霉素組，細胞在經(jīng)過LPS 處理24 h 后，同時加入40 μmol·L-1的川陳皮素和0.5 μmol·L-1雷帕霉素，孵育24 h 后用于后續(xù)實驗。

1.4 MTT 法檢測細胞毒性檢測 將HBZY-1 細胞以每孔5×104個細胞的密度接種在96孔板中。培養(yǎng)24 h后，分別用不同濃度的川陳皮素（0、10、20、30、40、50 和60 μmol·L-1）處理HBZY-1 細胞24 h。然后在每個孔中加入25 μL MTT（5 mg·mL-1）溶液，37 ℃培養(yǎng)4 h，再在每孔加入100 μL二甲基亞砜。輕微震蕩后，用酶標儀在570 nm處檢測吸光度值。

1.5 MTT 法檢測細胞增殖 將HBZY-1 細胞以每孔5×104個細胞的密度接種在96 孔板中培養(yǎng)24 h，按“1.3”項下方法處理各組細胞后，向每孔加入20 μL MTT（5 mg·mL-1），并在37 ℃下再孵育4 h。然后小心去除培養(yǎng)基并加入150 μL 二甲基亞砜以溶解結(jié)晶顆粒，使用酶標儀在570 nm處測量吸光度值。

1.6 細胞炎性指標、氧化應(yīng)激檢測 按酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒說明書，測定各組細胞IL-1β、IL-6、TNF-α、CAT、SOD、GSH含量。

1.7 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 將各組HBZY-1 細胞以800 r·min-1（離心半徑10 cm）、4 ℃離心5 min，并用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液洗滌2 次。用1 mL 1×Binding Buffer 重懸細胞，按照試劑盒說明各組細胞分別加入5 μL Annexin V-FITC 和PI，孵育15 min（室溫避光），利用流式細胞儀測定各組細胞凋亡率。

1.8 Western Blot 法檢測AMPK/NLRP3 信號通路蛋白水平在RIPA 裂解緩沖液中裂解HBZY-1 細胞。使用蛋白質(zhì)測定試劑盒進行總蛋白定量。將等體積的蛋白質(zhì)加載到10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳上進行分離，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜，封閉1 h 后，在4 ℃下用AMPK（1∶1 000）、NLRP3（1∶2 000）和GAPDH 抗體（1∶1 000）的一抗處理過夜。然后加入二抗（1∶2 000）室溫放置1 h，最后用ECL顯色劑使目的條帶顯色，以ImageJ軟件分析目的條帶的灰度值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用Graphpad Prism 8.0 軟件分析，計量資料呈正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差（±s）表示，單因素方差分析和SNK-q檢驗用于比較多組間差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 川陳皮素對HBZY-1 細胞的影響 見表1。MTT檢測結(jié)果顯示，0、10、20、30、40、50和60 μmol·L-1的川陳皮素對HBZY-1 細胞OD 值無明顯影響（P＞0.05），表明0～60 μmol·L-1的川陳皮素對HBZY-1細胞無明顯毒性。故選用40 μmol·L-1的川陳皮素進行下一步實驗。

表1 川陳皮素對HBZY-1 細胞的影響（±s，n=6）Table 1 Effects of nobiletin on HBZY-1 cells（±s，n=6）

表1 川陳皮素對HBZY-1 細胞的影響（±s，n=6）Table 1 Effects of nobiletin on HBZY-1 cells（±s，n=6）

濃度/（μmol·L-1）0 10 20 30 OD值0.44±0.04 0.45±0.05 0.47±0.06 0.48±0.05濃度/（μmol·L-1）40 50 60 OD值0.46±0.04 0.49±0.07 0.43±0.04

2.2 川陳皮素對LPS 誘導(dǎo)的HBZY-1 細胞增殖的影響見表2。與正常組比較，LPS 組細胞OD 值明顯下降（P＜0.05）；與LPS組比較，川陳皮素組細胞OD 值明顯升高（P＜0.05），而雷帕霉素組細胞OD值明顯下降（P＜0.05）；與川陳皮素組比較，川陳皮素+雷帕霉素組細胞OD值明顯下降（P＜0.05）。

表2 川陳皮素對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)細胞增殖能力的影響（±s，n=6）Table 2 Effects of nobiletin on LPS-induced cell proliferation（±s，n=6）

表2 川陳皮素對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)細胞增殖能力的影響（±s，n=6）Table 2 Effects of nobiletin on LPS-induced cell proliferation（±s，n=6）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與LPS 組比較，#P＜0.05；與川陳皮素組比較，&P＜0.05

組別正常組LPS組川陳皮素組雷帕霉素組川陳皮素+雷帕霉素組OD值0.49±0.05 0.25±0.04*0.45±0.05#0.10±0.02#0.32±0.04&

2.3 川陳皮素對LPS 誘導(dǎo)的HBZY-1 細胞炎性因子的影響見表3。與正常組比較，LPS組IL-1β、IL-6、TNF-α 含量明顯增加（P＜0.05）；與LPS 組比較，川陳皮素組IL-1β、IL-6、TNF-α 含量明顯降低（P＜0.05），而雷帕霉素組IL-1β、IL-6、TNF-α含量明顯升高（P＜0.05）；與川陳皮素組比較，川陳皮素+雷帕霉素組IL-1β、IL-6、TNF-α含量明顯增加（P＜0.05）。

表3 川陳皮素對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)HBZY-1 細胞炎性因子的影響（±s，n=6）Table 3 Effects of nobiletin on LPS-induced inflammatory factors in HBZY-1 cells（±s，n=6）

表3 川陳皮素對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)HBZY-1 細胞炎性因子的影響（±s，n=6）Table 3 Effects of nobiletin on LPS-induced inflammatory factors in HBZY-1 cells（±s，n=6）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與LPS 組比較，#P＜0.05；與川陳皮素組比較，&P＜0.05

組別正常組LPS組川陳皮素組雷帕霉素組川陳皮素+雷帕霉素組IL-1β/（pg·mL-1）100.52±13.56 185.63±21.25*119.46±14.46#334.58±41.26#168.34±18.25&IL-6/（pg·mL-1）20.52±2.08 41.71±4.66*24.45±2.79#62.68±6.74#38.41±4.13&TNF-α/（pg·mL-1）40.45±4.05 120.08±13.52*57.78±6.81#239.45±27.91#104.24±11.34&

2.4 川陳皮素對LPS 誘導(dǎo)的HBZY-1 細胞氧化應(yīng)激的影響見表4。與正常組比較，LPS 組SOD、GSH、CAT 水平明顯降低（P＜0.05）；與LPS 組比較，川陳皮素組SOD、GSH、CAT 水平明顯升高（P＜0.05），而雷帕霉素組SOD、GSH、CAT 水平明顯降低（P＜0.05）；與川陳皮素組比較，川陳皮素+雷帕霉素組SOD、GSH、CAT水平明顯降低（P＜0.05）。

表4 川陳皮素對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)HBZY-1 細胞氧化應(yīng)激的影響（±s，n=6）Table 4 Effects of nobiletin on LPS-induced oxidative stress in HBZY-1 cells（±s，n=6）

表4 川陳皮素對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)HBZY-1 細胞氧化應(yīng)激的影響（±s，n=6）Table 4 Effects of nobiletin on LPS-induced oxidative stress in HBZY-1 cells（±s，n=6）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與LPS 組比較，#P＜0.05；與川陳皮素組比較，&P＜0.05

組別正常組LPS組川陳皮素組雷帕霉素組川陳皮素+雷帕霉素組SOD/（U·mL-1）345.24±34.65 278.76±28.76*340.97±33.65#215.43±22.45#279.98±27.92&GSH/（mg·mL-1）15.34±1.52 12.76±1.34*15.08±1.50#9.32±1.32#12.93±1.39&CAT/（μmol·L-1）5.71±0.53 3.70±0.36*5.35±0.54#1.64±0.16#3.85±0.38&

2.5 川陳皮素對LPS 誘導(dǎo)的HBZY-1 細胞凋亡的影響見表5。與正常組比較，LPS 組細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與LPS 組比較，川陳皮素組凋亡率明顯下降（P＜0.05），而雷帕霉素組凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與川陳皮素組比較，川陳皮素+雷帕霉素組凋亡率明顯上升（P＜0.05）。

表5 川陳皮素對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)細胞凋亡的影響（±s，n=6）Table 5 Effects of nobiletin on LPS-induced apoptosis（± s，n=6）

表5 川陳皮素對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)細胞凋亡的影響（±s，n=6）Table 5 Effects of nobiletin on LPS-induced apoptosis（± s，n=6）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與LPS 組比較，#P＜0.05；與川陳皮素組比較，&P＜0.05

組別正常組LPS組川陳皮素組雷帕霉素組川陳皮素+雷帕霉素組凋亡率/%6.05±0.62 20.38±2.57*7.31±0.71#31.57±3.15#18.36±1.73&

2.6 川陳皮素對LPS 誘導(dǎo)的HBZY-1 細胞AMPK/NLRP3 通路的影響 見圖1、表6。與正常組比較，LPS 組AMPK 蛋白水平明顯下調(diào)（P＜0.05），NLRP3蛋白水平明顯上調(diào)（P＜0.05）。與LPS 組比較，川陳皮素組AMPK 蛋白水平明顯上調(diào)（P＜0.05），NLRP3蛋白水平明顯下調(diào)（P＜0.05）；而雷帕霉素組AMPK蛋白水平明顯下調(diào)（P＜0.05），NLRP3 蛋白水平明顯上調(diào)（P＜0.05）。與川陳皮素組比較，川陳皮素+雷帕霉素組AMPK 蛋白水平明顯下調(diào)（P＜0.05），NLRP3蛋白水平明顯上調(diào)（P＜0.05）。

圖1 Western Blot 法檢測AMPK/NLRP3 通路相關(guān)蛋白表達Figure 1 Western Blot analysis of AMPK / NLRP3 pathway related protein expression

表6 川陳皮素對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)HBZY-1 細胞AMPK/NLRP3 通路的影響（±s，n=6）Table 6 Effect of nobiletin on AMPK/NLRP3 pathway in LPSinduced HBZY-1 cells（±s，n=6）

表6 川陳皮素對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)HBZY-1 細胞AMPK/NLRP3 通路的影響（±s，n=6）Table 6 Effect of nobiletin on AMPK/NLRP3 pathway in LPSinduced HBZY-1 cells（±s，n=6）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與LPS 組比較，#P＜0.05；與川陳皮素組比較，&P＜0.05

組別正常組LPS組川陳皮素組雷帕霉素組川陳皮素+雷帕霉素組AMPK/GAPDH 0.94±0.09 0.56±0.06*0.89±0.09#0.33±0.03#0.62±0.06&NLRP3/GAPDH 1.09±0.16 1.67±0.18*1.18±0.13#2.51±0.27#1.53±0.16&

3 討論

糖尿病因其發(fā)病率迅速上升和巨大的經(jīng)濟負擔(dān)，已成為世界范圍內(nèi)公認的嚴重公共衛(wèi)生問題。2019 年，全球糖尿病患病率約為9.3%（4.63 億成年人），預(yù)計到2030 年上升至10.2%（5.78 億）[12]。約30%～40%的糖尿病患者患有糖尿病腎病，糖尿病腎病是糖尿病最嚴重的微血管并發(fā)癥之一。糖尿病腎病還是終末期腎臟疾病的主要原因，并被認為是一種慢性炎癥性疾病[13]。盡管關(guān)于糖尿病腎病的研究已有大量報道，但糖尿病腎病的確切發(fā)病機制尚未得到充分解釋。由于LPS誘導(dǎo)的腎小球系膜細胞病理變化與糖尿病腎病的病理特征相似，因此，LPS誘導(dǎo)的腎小球系膜細胞常用于體外模擬糖尿病腎病。川陳皮素是從柑橘類植物中分離出來的多甲氧基類黃酮，有抗炎和抗糖尿病的作用[14]。有報道[15]稱，川陳皮素可改善葡萄糖代謝并減少與妊娠糖尿病相關(guān)的炎癥，并且可能是預(yù)防妊娠糖尿病的新型療法。有報道[5]稱，川陳皮素可能抑制炎癥反應(yīng)以及氧化應(yīng)激改善鏈脲佐菌素-鎘誘導(dǎo)的大鼠糖尿病腎病。以上研究提示川陳皮素可能通過抑制炎癥反應(yīng)對糖尿病以及糖尿病并發(fā)癥（例如糖尿病腎?。┢鸬椒e極影響。本研究用不同濃度0～60 μmol·L-1的川陳皮素處理HBZY-1細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0～60 μmol·L-1的川陳皮素對HBZY-1 細胞無明顯毒性。我們參考有關(guān)研究[3]用100 ng·mL-1的LPS 處理HBZY-1 細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HBZY-1 細胞的OD 值明顯降低，而川陳皮素處理LPS誘導(dǎo)的HBZY-1細胞后，HBZY-1細胞OD值明顯升高，說明川陳皮素可能對LPS 誘導(dǎo)的HBZY-1細胞生長起到促進作用。

氧化應(yīng)激和炎癥在糖尿病腎病的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，可以通過緩解氧化應(yīng)激和炎癥來治療糖尿病腎病[16]。有研究報道稱，高血糖會引起ROS的過量產(chǎn)生，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激引起一系列代謝和細胞紊亂，包括脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)氧化和DNA損傷，最終導(dǎo)致腎細胞凋亡[17]；此外，氧化應(yīng)激還可以通過刺激相關(guān)生長因子、細胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的產(chǎn)生來促進炎癥反應(yīng)，加重腎損傷[18]。SOD 催化O2-轉(zhuǎn)化為H2O2，H2O2可以在CAT 或GPX 催化的反應(yīng)中進一步還原為H2O 從而抑制ROS 的產(chǎn)生[19]，而涉及GPX 的反應(yīng)需要GSH 的氧化[20]。因此，SOD、CAT、GSH 可以直接或間接地反映機體抗氧化水平。炎癥反應(yīng)通常由氧化應(yīng)激和ROS 介導(dǎo)，炎癥介質(zhì)參與或誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生，IL-6、IL-1β和TNF-α是糖尿病腎病發(fā)生的關(guān)鍵促炎因子，抑制IL-1β、IL-6、TNF-α的釋放可以抑制糖尿病腎病進展[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS 處理后HBZY-1 細胞CAT、SOD、GSH 水平明顯降低，細胞凋亡率、IL-1β、IL-6、TNF-α 含量明顯升高，表明LPS 處理HBZY-1細胞誘導(dǎo)其發(fā)生氧化應(yīng)激，進而促進其細胞凋亡以及炎癥的發(fā)生。川陳皮素處理LPS 誘導(dǎo)的HBZY-1 細胞后，HBZY-1 細胞CAT、SOD、GSH水平明顯升高，細胞凋亡率、IL-1β、IL-6、TNF-α 含量明顯降低，表明川陳皮素可抑制LPS 誘導(dǎo)的HBZY-1 細胞氧化應(yīng)激、炎癥以及細胞凋亡。

AMPK/NLRP3 信號通路是廣泛研究的炎癥通路，上調(diào)AMPK/NLRP3 信號傳導(dǎo)可以減輕糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞炎癥和氧化應(yīng)激損傷[22]。Hou等[23]也發(fā)現(xiàn)，增加AMPK活性，同時抑制NLRP3蛋白水平可以減輕糖尿病腎小管上皮細胞氧化應(yīng)激損傷，進而改善小鼠糖尿病腎病。本研究結(jié)果顯示，LPS 處理后，HBZY-1 細胞AMPK 蛋白低表達，NLRP3 蛋白高表達；而川陳皮素處理LPS 誘導(dǎo)的HBZY-1 細胞后，HBZY-1 細胞AMPK 蛋白水平明顯升高，NLRP3 蛋白水平明顯降低，提示川陳皮素可能是通過激活A(yù)MPK/NLRP3 信號通路減輕氧化應(yīng)激和炎性損傷，進而對LPS 誘導(dǎo)的HBZY-1細胞起到改善作用。為了進一步證實川陳皮素可能是通過激活A(yù)MPK/NLRP3 信號通路來發(fā)揮作用，我們在HBZY-1細胞經(jīng)過LPS 處理后，同時加入川陳皮素和AMPK/NLRP3 信號通路抑制劑雷帕霉素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素與川陳皮素的作用效果相反，雷帕霉素消除了川陳皮素對LPS誘導(dǎo)的HBZY-1細胞的保護作用。

綜上所述，川陳皮素可能通過促進AMPK 的表達來抑制NLRP3表達，從而改善LPS誘導(dǎo)的HBZY-1細胞氧化應(yīng)激損傷、炎性損傷以及細胞凋亡，今后可通過體內(nèi)實驗進行進一步研究。另外，川陳皮素是否可以通過上調(diào)AMPK/NLRP3 信號通路緩解其他腎病，仍需進一步探究。