馬洪濤，李子龍，薛青蘋，胡 雨

（華潤三九現(xiàn)代中藥制藥有限公司?廣東 惠州?516000）

三棱為黑三棱科植物黑三棱Sparganium stoleniferum,Buch.-Ham 的干燥塊莖，始載于《本草拾遺》[1]。三棱生品為血中氣藥，具有破血行氣、消積止痛的功能，多用于月經(jīng)不調(diào)，積聚結(jié)塊等病癥，是臨床常用的活血化瘀中藥。經(jīng)醋制后，增強破瘀、散結(jié)、止痛的作用。醋三棱的炮制方法有醋煮法、醋蒸發(fā)、醋炙法等[2]，目前臨床使用最多且被2020 版《中國藥典》所收載的僅有醋炙三棱。但是，該炮制方法只規(guī)定：“每100kg三棱，用醋15kg”，未明確規(guī)定炮制時間、炮制溫度等工藝參數(shù)，使市售醋三棱飲片質(zhì)量參差不齊，影響臨床藥效和安全性[3]。

現(xiàn)代研究表明，三棱主要含揮發(fā)油類、有機酸類、黃酮類、苯丙素類、皂苷類等化學(xué)成分，其中阿魏酸、4-香豆酸和香草酸能抗血小板凝結(jié)，與三棱活血化瘀的功效一致[4-6]。目前，《中國藥典》2020 年版三棱藥材項下無明確的成分定性及定量檢測標(biāo)準(zhǔn)，其質(zhì)量評價方法僅僅是浸出物含量測定。本實驗以UPLC 檢測三棱藥材4-香豆酸炮制前后含量變化，以4-香豆酸和浸出物含量的綜合評分為評價指標(biāo)，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化炮制工藝關(guān)鍵參數(shù)，建立參數(shù)明確、過程可控的三棱醋炙工藝，為提高醋三棱的質(zhì)量均一性和臨床用藥安全性提供了技術(shù)支持。

1 儀器與實驗材料

1.1 儀器與試劑

Waters 超高效液相色譜儀，包括四元溶劑管理器、柱溫箱、二極管陣列檢測器；電子分析天平：METTLER TOLEDO（XPE26、MS204S），瑞士梅特勒；KDMA 六聯(lián)電熱套，常州邁科諾儀器有限公司；乙腈（色譜純，批號：JA122830），德國默克公司；甲醇（分析純，批號：20220315），冰醋酸（分析純，批號：20201230），國藥集團化學(xué)試劑有限公司；娃哈哈純凈水（批號：20220310），杭州娃哈哈集團有限公司；4-香豆酸對照品（批號：111684-202003，純度：98.0%），中國食品藥品檢定研究院。

1.2 材料

實驗用三棱飲片購買自亳州市場，經(jīng)鑒定為2020 年版《中國藥典》收載基原黑三棱的干燥塊莖。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱為Waters CORTECS T3（柱長為100mm，內(nèi)徑為2.1mm，粒徑為1.6μm）；以乙腈為流動相A，以0.1%冰醋酸溶液為流動相B，按下表中的規(guī)定進行梯度洗脫；流速為每分鐘0.3mL；柱溫為35℃；檢測波長為300nm。理論板數(shù)按4-香豆酸峰計算應(yīng)不低于5000。

2.1.2 對照品溶液制備

取4-香豆酸對照品適量，精密稱定，加入甲醇制成每1mL 含5μg 的混合溶液，搖勻，即得對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液制備

取本品粉末(過四號篩)約1.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇50mL，稱定重量，加熱回流1 小時，放冷，再稱定重量，用80%甲醇補足減失重量，搖勻，濾過，水浴蒸干，加甲醇溶解定容至5mL容量瓶中，即得供試品溶液。

2.1.4 線性關(guān)系考察

取4-香豆酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL 含20μg 的對照品儲備液。分別稀釋，制備成4-香豆酸濃度為1.25、2.5、5、10、20μg?mL-1溶液。分別吸取對照品溶液各2μL，注入液相色譜儀，測定峰面積。對照品濃度為橫坐標(biāo)以X 表示，峰面積為縱坐標(biāo)以Y 表示，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=23569X+19269，相關(guān)系數(shù)（r=0.9953），4-香豆酸在1.25～20μg?mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗

吸取2.1.2 項下對照品溶液2μL，重復(fù)進樣6 次，進行精密度試驗，結(jié)果4-香豆酸峰面積RSD 為0.41%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗

分別吸取同一供試品溶液2μL，在室溫環(huán)境下0、2、4、8、16、24h 按上述色譜條件進樣，測定峰面積，計算峰面積RSD 為1.50%，表明樣品在24h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗

相比鋁合金來說，鎂合金的密度要低得多，但其具有良好的鑄造性能。人們通過各種各樣的方法，如添加顆粒、纖維和晶須等來生產(chǎn)、制造以鎂作為基體的鎂合金復(fù)合材料。

取同一醋三棱樣品，依照“2.1.3”項下供試品溶液制備方法，分別平行制備6 份樣品，精密吸取2μL，按上述色譜條件進樣，測定峰面積。計算4-香豆酸的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.0054%，RSD 為1.21%。

2.1.8 加樣回收試驗

稱取同一批醋三棱樣品粉末0.5g，共6 份，精密稱定，每份加入約0.027mg 的4-香豆酸，按“2.1.3”項下的方法制備供試品溶液，分別吸取2μL，注入液相色譜儀，按“2.1.1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積值，計算回收率和RSD 值，4-香豆酸的平均回收率為99.8%，RSD 為1.4%，表明本方法測量結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.1.9 樣品測定

取響應(yīng)曲面試驗的樣品（過四號篩）1.0g，精密稱定，按照“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，分別吸取2μL，注入液相色譜儀，按“2.1.1”項下色譜條件進行測定，計算各樣品中4-香豆酸含量。詳見圖1。

圖1 4-香豆酸對照品（A）及醋三棱樣品（B）UPLC 圖

2.2 浸出物含量測定

參照《中國藥典》2020 年版醇溶性浸出物測定法（通則2201）項下的熱浸法測定，用稀乙醇作溶劑。

2.3 響應(yīng)曲面試驗

表1 醋三棱炮制工藝響應(yīng)曲面實驗因素水平表

對浸出物及4-香豆酸含量數(shù)據(jù)進行“歸一化” 處理后進行綜合加權(quán)評分，優(yōu)選醋三棱的炮制工藝，浸出物和4-香豆酸的含量原則上越高越好。采用Hassan 方法進行數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)化“歸一值”。

計算公式：dmax=。

由于各成分的藥效貢獻值大小未知，因此賦予2項指標(biāo)權(quán)重各50 分，總分100 分，然后計算各試驗組綜合評分。計算公式：綜合評分（Y）=“浸出物歸一值”×50+“4-香豆酸歸一值”×50[10]。具體實驗安排及結(jié)果，詳見表2，方差分析結(jié)果，詳見表3。

表2 Box-Behnken 設(shè)計實驗及結(jié)果

表3 醋三棱炮制工藝優(yōu)化綜合評分回歸模型方差分析

通過Design Expert 12 軟件對各因素經(jīng)回歸擬合后，得二次多項回歸方程為Y=87.56+2.31A+2.08B+0.836C+2.96AB-0.0203AC+0.4181BC -29.78A2-10.04B2-6.06C2，通過方差分析，模型具有顯著性，失擬項不顯著。多元相關(guān)系數(shù)R2=0.9923，說明相關(guān)性越好，預(yù)測值R2（RPred2=0.9134）和調(diào)整后R2（RAdj2=0.9824）較為吻合，差值小于0.2，說明回歸模型能充分說明工藝過程。C.V.=3.46＜10.0%，表明實驗的可信度和精確度高；模型擬合精密度Adeq Precision=24.5179>4，視為合理。因此，擬合的回歸方程符合以上檢驗原則，適應(yīng)性較好。因素A、因素B、因素AB 的P＜0.05，具有顯著性，各因素的影響大小為A>B>C。根據(jù)擬合模型繪制三維曲線圖（圖2），觀察各因素的交互作用對綜合評分的影響，AB 交互作用顯著，AC、BC交互作用不顯著。

實驗設(shè)計顯示，最佳炮制工藝為炒制溫度151.330℃、炒制時間15.559min、悶潤時間41.458min，在此工藝條件下炮制醋三棱飲片4-香豆酸及浸出物含量綜合評分最高，為87.759。根據(jù)實際情況將最佳炮制工藝調(diào)整為：炒制溫度150℃、炒制時間15min、悶潤時間40min。因?qū)嶒灲M中已有最佳組合，故不需要進行驗證實驗。

3 討論

三棱作為臨床常用中藥，具有破血行氣，消積止痛的作用。目前，三棱有效成分不明確，已報道的成分主要有揮發(fā)油類、有機酸類、黃酮類、苯丙素類、皂苷類等。人體內(nèi)的自由基與心血管疾病有密切聯(lián)系[11，12]。已有研究表明，阿魏酸和4-香豆酸有抗血小板聚集、鎮(zhèn)痛作用。本實驗選擇與三棱功效相對應(yīng)的代表4-香豆酸，以對成品質(zhì)量影響較大的悶潤時間、炒制溫度和炒制時間3 個主要因素，采用響應(yīng)曲面法對醋三棱醋炙工藝進行優(yōu)化，與傳統(tǒng)的正交實驗和均勻試驗相比，響應(yīng)面法參數(shù)預(yù)測精度高，更接近真實值，可實現(xiàn)多個指標(biāo)的篩選、優(yōu)化，建立連續(xù)變量曲面模型，對各因素水平進行全面的優(yōu)化研究，更直觀、精確地得到最優(yōu)組合。最終確定了醋三棱最佳炮制工藝，即取凈三棱飲片，加15%醋，浸潤40min，在150℃條件下炒制15min，為醋三棱生產(chǎn)炮制提供參考。