■ 竺利紅 尹小良 施躍峰 皮雄娥*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所，浙江杭州 310021；2.浙江省紹興市越城區(qū)東湖街道事業(yè)綜合服務(wù)中心，浙江紹興 312001)

米爾伊麗莎白菌（Elizabethkingia miricola）是一種臨床新興條件致病菌，于2003 年在和平號(hào)空間站的冷凝水中首次被分離到[1]。2008 年，美國第一例報(bào)告米爾伊麗莎白菌感染病例是一名血液科患者[2]。隨后，越來越多的研究表明，在歐洲國家的免疫功能低下和免疫功能正常的患者中，米爾伊麗莎白菌可導(dǎo)致細(xì)菌性貧血和敗血癥[3]。在中國，米爾伊麗莎白菌主要被發(fā)現(xiàn)感染兩棲類動(dòng)物中的蛙類，不僅侵染肝臟、腎臟等器官，還入侵腦部組織，從而引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失調(diào)[4-6]，表現(xiàn)出歪頭等癥狀，俗稱“歪頭病”。研究人員已從米爾伊麗莎白菌中檢測(cè)到編碼β類碳青霉烯酶的blaGOB-13和blaB-9等耐藥性基因，還檢測(cè)到DNA促旋酶GyrA亞基的Ser83Ile/Asp87Asn/Thr83Ser、GyrB 亞基的Met437Leu 和拓?fù)洚悩?gòu)酶IVParE 亞基的Met437Phe/Ala473Leu 的氨基酸突變點(diǎn)[7]，說明該菌具有多重耐藥性。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，米爾伊麗莎白菌僅對(duì)米諾環(huán)素、氟苯尼考、利福平和萬古霉素敏感[8]，進(jìn)一步證實(shí)了該菌的多重耐藥性。由米爾伊麗莎白菌引起的蛙類疾病具有發(fā)病急、防治難和死亡率極高等特點(diǎn)，對(duì)我國蛙類養(yǎng)殖造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，成為制約規(guī)?；B(yǎng)殖發(fā)展的瓶頸，迫切需要一種高效、安全的防治手段。

微生態(tài)制劑是利用有益微生物經(jīng)特殊加工而成的制劑，對(duì)生物和環(huán)境安全，可用于預(yù)防畜禽疾病、提高飼料轉(zhuǎn)化率、改善產(chǎn)品品質(zhì)及養(yǎng)殖環(huán)境等方面，尤其對(duì)提高動(dòng)物免疫力具有諸多優(yōu)勢(shì)，在畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)上廣泛應(yīng)用[9-11]。黑斑蛙作為一種新興產(chǎn)業(yè)，人們對(duì)其研究主要集中在病原菌的分離鑒定和防治藥物的篩選上，市場(chǎng)上缺乏黑斑蛙專用微生態(tài)制劑。關(guān)于黑斑蛙益生菌的篩選，僅見王瑩等[12]報(bào)道一株抗生鏈霉菌（Streptomyces antibioticus）對(duì)米爾伊麗莎白菌有頡頏作用。

前期，從黑斑蛙養(yǎng)殖場(chǎng)污泥中分離到一株對(duì)米爾伊麗莎白菌有強(qiáng)抑菌活性的細(xì)菌，編號(hào)為ZL397，本研究對(duì)其進(jìn)行了分類鑒定、抑菌活性、抗菌譜及黑斑蛙攻毒保護(hù)試驗(yàn)研究。以期獲取更多有應(yīng)用前景的益生菌資源，保障黑斑蛙的綠色健康養(yǎng)殖。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株ZL397、米爾伊麗莎白菌及檢測(cè)菌均由浙江省農(nóng)科院植物保護(hù)與微生物研究所保存。

細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒、PCR 試劑盒、16S擴(kuò)增通用引物27F/1492R 均由生工生物工程（上海）股份有限公司生產(chǎn)或合成。

ZL397種子培養(yǎng)基：黃豆餅粉4.0 g，葡萄糖0.5 g，蔗糖0.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.5；

ZL397 發(fā)酵培養(yǎng)基：黃豆餅粉15.0 g，可溶性淀粉15.0 g，酵母粉5.0 g，MgSO41.0 g，CaCO30.2 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.5；

LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.5。

1.2 ZL397分類鑒定

1.2.1 形態(tài)學(xué)觀察和生理生化特征分析

將菌株ZL397 用番紅復(fù)紅染液進(jìn)行染色，在顯微鏡下觀察其形態(tài)。用細(xì)菌微量生化鑒定管對(duì)菌株進(jìn)行生理生化特性鑒定。觀察結(jié)果參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[13]進(jìn)行鑒別。

1.2.2 16S rDNA序列分析

首先采用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取菌株ZL397 的總 DNA，然后用16S 通用引物擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。在Genbank 基因數(shù)據(jù)庫中對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST 比對(duì)，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 ZL397發(fā)酵上清液和粉劑的制備

用接種環(huán)挑取新鮮的ZL397 斜面于種子培養(yǎng)基中，37 ℃下180 r/min 振蕩培養(yǎng)15 h，作為種子液按5%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃下200 r/min 振蕩培養(yǎng)36 h，即得發(fā)酵液。取100 mL 經(jīng)8 000 r/min離心15 min，得到的上清液用0.22 μm 微孔過濾器過濾，即得無菌發(fā)酵上清液，4 ℃密封保存。剩余發(fā)酵液離心后收集菌體進(jìn)行噴霧干燥，進(jìn)風(fēng)溫度160 ℃、出風(fēng)溫度80 ℃，制備得含孢量為1010CFU/g 的粉劑，常溫避光保存。

1.4 抑菌活性測(cè)定

1.4.1 對(duì)米爾伊麗莎白菌的抑菌活性

取12 瓶裝有50 mL LB 培養(yǎng)液的三角燒瓶，等量接入米爾伊麗莎白菌。分成4 組，每組3 瓶，其中3 組分別加入ZL397 發(fā)酵上清液原液、2 倍稀釋液、4 倍稀釋液1 mL，得到發(fā)酵上清液終濃度為50 倍、100 倍、200 倍的3 個(gè)試驗(yàn)組，對(duì)照組加入無菌水1 mL。30 ℃下200 r/min 振蕩培養(yǎng)，8 h 后取培養(yǎng)液測(cè)定其OD600，按公式計(jì)算抑菌率。

抑菌率（%）=（對(duì)照組OD600-試驗(yàn)組OD600）/對(duì)照組OD600×100

1.4.2 抗菌譜測(cè)定

將20 mL LB 培養(yǎng)基融化并冷卻至45 ℃，分別加入12 種檢測(cè)菌液（108CFU/mL）200 μL，輕輕振蕩混勻，迅速倒平板。待凝固后，將無菌濾紙片（直徑為7 mm）均勻放置在平板上，吸取20 μL ZL397 發(fā)酵上清液50 倍稀釋液于紙片中，37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑。每種菌液各3個(gè)重復(fù)，取平均值。

1.4.3 對(duì)米爾伊麗莎白菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

處理組為在裝有50 mL LB 培養(yǎng)液的三角燒瓶中接入米爾伊麗莎白菌，30 ℃下200 r/min振蕩培養(yǎng)8 h，加入ZL397 發(fā)酵上清液2 倍稀釋液1 mL；而對(duì)照組為加入無菌水1 mL。繼續(xù)培養(yǎng)3 h，取少量菌體于電鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.5 攻毒保護(hù)試驗(yàn)

取健康成年黑斑蛙120只，隨機(jī)分成4組，即預(yù)防組、治療組、攻毒對(duì)照組和不攻毒對(duì)照組，每組各3 個(gè)重復(fù)。預(yù)防組為在飼料中按終濃度為0.1‰添加ZL397 粉劑，其余組按照常規(guī)飼喂。7 d 后對(duì)預(yù)防組、治療組和攻毒對(duì)照組黑斑蛙皮下注射含106CFU/mL米爾伊麗莎白菌的菌液100 μL，不攻毒對(duì)照組黑斑蛙注射同等體積的無菌生理鹽水。接著對(duì)預(yù)防組和治療組黑斑蛙飼喂含0.1‰ ZL397 粉劑的飼料，攻毒對(duì)照組和不攻毒對(duì)照組按照常規(guī)飼料飼喂。攻毒7 d后統(tǒng)計(jì)死亡數(shù)，計(jì)算存活率，并從各組存活的黑斑蛙中隨機(jī)抽取5只稱重，計(jì)算增重率。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，并用t檢驗(yàn)比較組間差異。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZL397菌株鑒定結(jié)果

2.1.1 形態(tài)學(xué)、生理生化特征

ZL397 菌落在LB 培養(yǎng)基上呈現(xiàn)淡黃色，表面褶皺突起，邊緣不規(guī)則。革蘭氏染色呈陽性，短桿狀，兩端鈍圓，單個(gè)、成對(duì)或成串出現(xiàn)，橢圓形中生芽孢（見圖1）。好氧，能利用葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇和麥芽糖等，淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、接觸酶和H2S 反應(yīng)均呈陽性，硝酸鹽還原陰性。根據(jù)上述特征，初步判斷ZL397為芽孢桿菌屬（Bacillussp.）。

圖1 菌株ZL397的桿狀體(A)、孢囊體(B)、芽孢(C)形態(tài)(100×)

2.1.2 16S rDNA序列分析

對(duì)菌株ZL397 的16S rDNA 序列進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序，將測(cè)定的序列（登錄號(hào)：OQ799135）在Genbank 上比對(duì)，并與相關(guān)屬種構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2 所示。可以看 出ZL397 與B.tequilensisstrain HBUM07074 和B.tequilensisstrain 10b聚合在一枝，同源性達(dá)99%以上。結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化特征，將芽孢桿菌ZL397 鑒定為特基拉芽孢桿菌（Bacillus tequilensis）。

圖2 菌株ZL397基于16S序列的進(jìn)化樹

2.2 抑菌活性測(cè)定結(jié)果

2.2.1 對(duì)米爾伊麗莎白菌的抑菌活性

從表1 可以看出，不同濃度的ZL397 發(fā)酵上清液均能抑制米爾伊麗莎白菌的生長。隨著ZL397 濃度的增加，米爾伊麗莎白菌的OD600越低。抑菌活性以50 倍液最強(qiáng)，對(duì)靶標(biāo)菌的抑制率高達(dá)90.29%，與其余2組相比差異顯著（P＜0.05）。

表1 ZL397發(fā)酵上清液對(duì)米爾伊麗莎白菌的抑菌活性

2.2.2 抗菌譜測(cè)定結(jié)果

菌株ZL397 對(duì)各類細(xì)菌的抑制作用見表2。ZL397對(duì)藤黃八疊球菌（Micrococcus luteus）、雞沙門氏菌（Salmonella gullinarum）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、米爾伊麗莎白菌（E.miricola）、乙酸鈣不動(dòng)桿菌（Acinetobacter caleoaceticus）的抑制作用最強(qiáng)，對(duì)普通變形桿菌（Proteus vulgaris）、寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonassp.）、鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）和Chryseobacterium arthrosphaerae的作用次之，對(duì)致病性大腸桿菌（Escherichia coli）和銅綠假單胞桿菌（Pseudomonas aeruginosa）的作用最弱。米爾伊麗莎白菌、乙酸鈣不動(dòng)桿菌、寡養(yǎng)單胞菌、嗜水氣單胞菌和C.arthrosphaerae均為從患病黑斑蛙分離出來的細(xì)菌，具有一定的致病性。說明菌株ZL397 對(duì)黑斑蛙多種病原細(xì)菌具有抑菌活性。

表2 菌株ZL397的抗菌譜

2.2.3 ZL397對(duì)米爾伊麗莎白菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

圖3（A）為對(duì)照組米爾伊麗莎白菌在掃描電鏡下的觀察結(jié)果，表現(xiàn)為完整、健壯的桿狀體，長約2 μm。經(jīng)ZL397 發(fā)酵上清液處理3 h 后，米爾伊麗莎白菌細(xì)胞破裂、部分菌體斷裂，見圖3（B），證實(shí)了ZL397對(duì)米爾伊麗莎白菌的抑菌活性。

圖3 掃描電鏡觀察ZL397對(duì)米爾伊麗莎白菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響（×8 000）

2.3 攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果

ZL397粉劑對(duì)米爾伊麗莎白菌的防治效果見表3。從表3 可以看出，米爾伊麗莎白菌人工攻毒7 d 后，預(yù)防組中黑斑蛙的存活率高達(dá)92.22%；治療組黑斑蛙存活率為61.11%，防治效果不佳；攻毒對(duì)照組存活率僅為41.11%，差異顯著（P＜0.05）。說明對(duì)由米爾伊麗莎白菌引起的黑斑蛙病害采用ZL397 預(yù)防效果更佳。預(yù)防組黑斑蛙存活率雖低于不攻毒對(duì)照組，但兩組黑斑蛙的體重增長率差異不顯著（P＞0.05），進(jìn)一步證實(shí)了ZL397 對(duì)米爾伊麗莎白菌病的防治效果。攻毒7 d后預(yù)防組和治療組黑斑蛙體重增重率分別為35.15%和11.42%，與攻毒對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05），說明菌株ZL397對(duì)黑斑蛙具有促生長功效。

表3 ZL397粉劑對(duì)米爾伊麗莎白菌病的防治效果

3 討論

2006 年，特基拉芽孢桿菌首次從墨西哥一座有2000年歷史的墓穴中被分離出來[14]。隨后，研究人員陸續(xù)發(fā)現(xiàn)該菌株能夠產(chǎn)生脂肽類物質(zhì)抑制病原菌生長，促進(jìn)植物種子萌發(fā)和幼苗生長，具有優(yōu)良的植病生防潛力[15-16]。研究表明，特基拉芽孢桿菌可產(chǎn)蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶，提高血清溶菌酶、脂肪酶和肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性，可抑制動(dòng)物多種病原菌，具有抗病、促消化、提高免疫力和飼料轉(zhuǎn)化率等功能，是一類有潛力的飼用微生態(tài)制劑[17-20]。

根據(jù)形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性和16S rDNA 序列分析結(jié)果，將一株對(duì)黑斑蛙源米爾伊麗莎白菌有強(qiáng)抑菌活性的菌株ZL397 鑒定為特基拉芽孢桿菌。抑菌活性測(cè)定結(jié)果表明，該菌株發(fā)酵上清液50 倍液對(duì)米爾伊麗莎白菌的生長抑制率為90.29%，說明菌株ZL397 在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了一種或幾種具有抑菌活性的代謝產(chǎn)物。從超微結(jié)構(gòu)看，該類活性物質(zhì)的抑菌機(jī)制主要是破壞靶標(biāo)菌細(xì)胞壁和膜，致使菌體斷裂，胞內(nèi)物質(zhì)外泄，細(xì)菌生長受到抑制或死亡。至于該類活性物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)和特性有待進(jìn)一步解析。菌株ZL397 抗菌譜較廣，尤其對(duì)蛙類多種病原細(xì)菌米爾伊麗莎白菌、乙酸鈣不動(dòng)桿菌、寡養(yǎng)單胞菌、嗜水氣單胞菌和黑斑蛙病原菌C.arthrosphaerae具有較好的抑菌活性，和他人研究結(jié)果一致[4，21-23]。下一步可通過菌種誘變和發(fā)酵工藝的研究提高其活性物質(zhì)的產(chǎn)量，進(jìn)一步提高其抑菌活性。

米爾伊麗莎白菌在侵染黑斑蛙時(shí)，除了侵染肝臟、腎臟等內(nèi)臟器官，還突破了血腦屏障侵入了腦部組織。目前用抗生素治療效果并不理想，究其原因主要有三方面：一是很多抗生素不能通過血腦屏障或通過不多，在腦脊液和腦組織中不能達(dá)到有效的治療濃度；二是米爾伊麗莎白菌具有多重耐藥性，導(dǎo)致很多抗生素對(duì)其無效；三是患病黑斑蛙往往食欲降低甚至斷食，通過飼料中添加抗生素這條途徑很難起效。本研究在黑斑蛙攻毒保護(hù)試驗(yàn)中分別設(shè)置了預(yù)防組、治療組、攻毒對(duì)照組和對(duì)照組，采用米爾伊麗莎白菌人工攻毒后，預(yù)防組中黑斑蛙的存活率高達(dá)92.22%，治療組為61.11%，攻毒對(duì)照組僅為41.11%。說明在健康黑斑蛙飼料中添加0.1‰ ZL397粉劑（100億CFU/g）飼喂7 d，可有效抵抗由米爾伊麗莎白菌引起的病害，有助于解決目前黑斑蛙規(guī)?；B(yǎng)殖中的病害防治難題。攻毒對(duì)照組黑斑蛙體重與攻毒前比體重略有減輕，可能是由于病原菌的感染導(dǎo)致其食欲降低引起，而預(yù)防組黑斑蛙的體重較治療組有顯著增加，說明用ZL397粉劑預(yù)防可提高黑斑蛙的產(chǎn)量。

4 結(jié)論

特基拉芽孢桿菌對(duì)黑斑蛙多種病原細(xì)菌具有較好的抑菌活性，尤其對(duì)由米爾伊麗莎白菌引起的病害有較好的防治效果，并有顯著的增重效果，展現(xiàn)出飼用微生態(tài)制劑的開發(fā)前景。