■ 胡文舉 孫英菲 孫玲利

（1.鄭州信息科技職業(yè)學(xué)院，河南鄭州 450046；2.河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，河南鄭州 451450）

抗菌肽是宿主天然免疫系統(tǒng)的構(gòu)成成分之一，廣泛存在于生物體內(nèi)[1]，目前，已經(jīng)在昆蟲(chóng)、真菌、節(jié)肢動(dòng)物中分離出了具有良好抗菌、抗病毒、特異性抑制腫瘤細(xì)胞的抗菌肽[2-4]。研究表明，抗菌肽在高等動(dòng)物體內(nèi)具有抑菌、促生長(zhǎng)、抗氧化、調(diào)節(jié)腸道菌群和免疫功能的作用[5-6]，且無(wú)毒副作用、不產(chǎn)生耐藥性，是理想的綠色高效飼用替抗產(chǎn)品[7]。

黑水虻（Hermetiaillucens）又稱亮斑扁角水虻，是雙翅目科食腐性昆蟲(chóng)，在全世界廣泛分布，其幼蟲(chóng)繁殖周期短、群體產(chǎn)量高、營(yíng)養(yǎng)成分豐富是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織推薦的可飼用昆蟲(chóng)之一[8]。將黑水虻幼蟲(chóng)暴露于高濃度有害微生物或者不良環(huán)境中，可誘使其產(chǎn)生抗菌肽來(lái)抵抗病原微生物[9]。王龍等[10]利用超濾法、張守玉等[11]利用酸溶堿提法、胡漂琪等[12]利用甲醇提取法，均成功在黑水虻幼蟲(chóng)體內(nèi)獲取具有良好抑菌效果的抗菌肽。

超聲輔助酶解法是利用超聲波機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)加速蛋白質(zhì)水解反應(yīng)而制備抗菌肽[13]，具有反應(yīng)條件溫和，抗菌肽得率高，抑菌活性強(qiáng)等特點(diǎn)，被研究者廣泛關(guān)注。許依能等[7]利用超聲輔助酶法成功在南極磷蝦中提取了抗菌肽，抗菌肽得率達(dá)到了51.24%，抑菌圈直徑為20.8 mm，均顯著高于傳統(tǒng)提取方法。本研究利用響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化超聲輔助酶法制備黑水虻抗菌肽制備工藝，以期提高黑水虻抗菌肽得率，旨在為黑水虻高附加值產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黑水虻蟲(chóng)卵由河南某生物安全技術(shù)有限公司提供；金黃色葡萄球菌、大腸桿菌菌株購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

1.2 主要試劑

胃蛋白酶（200 U/mg）、胰蛋白酶（200 U/mg）、中性蛋白酶（200 U/mg）、木瓜蛋白酶（200 U/mg）購(gòu)自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；LB 培養(yǎng)基購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

1.3 主要儀器設(shè)備

HWS-150 恒溫恒濕細(xì)菌培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；202-0ES 型電熱恒溫干燥箱，北京市永明醫(yī)療儀器有限公司；TDL-80-2B 離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；MKZ-G2A 真空冷凍干燥箱，青島邁可威微波創(chuàng)新科技有限公司；超低溫冰箱MD-86L58，美的集團(tuán)股份有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 黑水虻幼蟲(chóng)的飼養(yǎng)與處理

黑水虻蟲(chóng)卵在28 ℃、70%相對(duì)濕度條件下，孵化72 h。在20～25 ℃條件下，將孵化的黑水虻幼蟲(chóng)以含水量70%的麩皮為基質(zhì)，繼續(xù)飼養(yǎng)至5齡期。取5齡期黑水虻幼蟲(chóng)，沖洗干凈后斷頭處死，50 ℃烘干至恒重，粉碎后索氏法脫脂，過(guò)70目篩冷凍保存。

1.4.2 黑水虻抗菌肽的制備

參考張書(shū)會(huì)等[2]和許依能等[7]方法進(jìn)行黑水虻抗菌肽的制備。稱取20 g脫脂黑水虻幼蟲(chóng)粉，用磷酸鹽緩沖液配置成1 g/10 mL 的蟲(chóng)粉液，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)加入蛋白酶，混合均勻，調(diào)整pH，超聲處理后，置于水浴鍋中酶解，期間每30 min 調(diào)整pH，酶解結(jié)束后95 ℃滅活15 min，冷卻至室溫。酶解液在8 000 r/min 條件下離心15 min。取離心后上清液加入硫酸銨（質(zhì)量百分比濃度70%），攪拌至充分溶解，4 ℃靜止4 h，10 000 r/min 離心15 min，棄上清液。將粗蛋白提取物用1 kD 透析袋4 ℃下透析24 h，期間換液3 次。將透析后的粗蛋白加入到10 kD 超濾管內(nèi)，5 000 r/min離心1 h，收集管底液，真空冷凍干燥稱重后保存。

1.4.3 制備率測(cè)定

式中：m1——抗菌肽的質(zhì)量（g）；

m——黑水虻幼蟲(chóng)粉的質(zhì)量（g）。

1.4.4 抑菌活性測(cè)定

用滅菌純化水將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分別配制成1.0×107～1.0×108CFU/mL 菌液，用微量移液器吸取100 μL 菌液加入LB 平板表面，用刮刀輕輕涂布均勻。將牛津杯均勻的放置于LB 平板上，在牛津杯中加入100 μL的100 mg/mL黑水虻抗菌肽溶液，在37 ℃條件下培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈的直徑。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.5.1 蛋白酶的篩選

選取胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶，在最適條件下分別對(duì)黑水虻蟲(chóng)粉進(jìn)行酶解（酶解最適條件見(jiàn)表1）。料液比1∶10（g/mL）、加酶量5 000 U/g、超聲功率40 W、處理20 min、酶解2 h。其余按照1.4.2和1.4.4的步驟制備抗菌肽并測(cè)定抑菌活性。

表1 各種酶酶解最適條件

1.5.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

基本酶解條件為料液比1∶10（g/mL）、加酶量5 000 U/g、超聲功率40 W、處理時(shí)間20 min、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間2 h、pH 7.0。分別研究超聲功率（20、40、60、80、100 W）、處理時(shí)間（10、15、20、25、30 min）、酶解溫度（30、40、50、60、70 ℃）、pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）對(duì)黑水虻抗菌肽制備率的影響。每個(gè)因素按照試驗(yàn)水平分別設(shè)置4個(gè)組，每組重復(fù)3次。

單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用（ANOVA）進(jìn)行單因子方差分析，Duncan’s 多重比較檢驗(yàn)，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

1.5.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以超聲功率、處理時(shí)間、酶解溫度和pH 為自變量，制備率為響應(yīng)值利用Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行4 因素3 水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，利用Design-Expert 13.01 軟件進(jìn)行分析。響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選結(jié)果

以制備率和對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌抑菌圈直徑為指標(biāo)，測(cè)定胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶對(duì)黑水虻的酶解效果（見(jiàn)表3）。由表3 可知，4 種酶制備黑水虻抗菌肽制備率以中性蛋白酶最高，其次是木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶。對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑大小順序?yàn)橐鹊鞍酌福局行缘鞍酌福疚傅鞍酌福灸竟系鞍酌浮?duì)大腸桿菌抑菌圈直徑大小順序?yàn)橹行缘鞍酌福疽鹊鞍酌福灸竟系鞍酌福疚傅鞍酌?。?yōu)先考慮抗菌肽制備率，同時(shí)參考抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌效果，選用中性蛋白酶酶解黑水虻幼蟲(chóng)粉制備抗菌肽。

表3 不同蛋白酶對(duì)黑水虻抗菌肽制備效果的影響

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 超聲功率對(duì)抗菌肽制備率的影響

由表4 可知，超聲功率在20～40 W 時(shí)抗菌肽制備率呈上升趨勢(shì)，超聲功率為40 W 時(shí)抗菌肽制備率最高，為25.31%。當(dāng)超聲功率高于40 W 時(shí)，抗菌肽制備率呈下降趨勢(shì)，可能是因?yàn)楦吖β实某暡ㄆ茐牧嗣傅幕钚越Y(jié)構(gòu)，導(dǎo)致酶活性降低。因此，選擇超聲功率40 W作為試驗(yàn)中心點(diǎn)，進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化。

表4 提取條件對(duì)黑水虻抗菌肽提取率的影響

2.2.2 超聲處理時(shí)間對(duì)抗菌肽制備率的影響

由表4 可知，超聲處理時(shí)間在10～25 min 時(shí)抗菌肽制備率隨處理時(shí)間的增加呈緩慢上升趨勢(shì)，超聲處理25 min 時(shí)，抗菌肽制備率最高，為24.68%。當(dāng)處理時(shí)間超過(guò)25 min時(shí)，制備率隨處理時(shí)間的增加顯著降低，在處理時(shí)間為30 min 時(shí)，制備率僅為19.36%。因此，選擇超聲處理時(shí)間25 min 作為試驗(yàn)中心點(diǎn)，進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化。

2.2.3 酶解溫度對(duì)抗菌肽制備率的影響

由表4 可知，酶解溫度在30～50 ℃時(shí)，抗菌肽制備率隨著酶解溫度的提高而呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，當(dāng)酶解溫度為50 ℃時(shí)，抗菌肽制備率最高，為25.28%。當(dāng)酶解溫度高于50 ℃時(shí)，抗菌肽制備率隨酶解溫度的提高呈降低趨勢(shì)，當(dāng)酶解溫度達(dá)到70 ℃時(shí)，制備率最低為14.31%。因此，選擇酶解溫度50 ℃作為試驗(yàn)中心點(diǎn)，進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化。

2.2.4 pH對(duì)抗菌肽制備率的影響

由表4可知，隨著pH的增高，黑水虻抗菌肽制備率呈先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)pH為7時(shí)抗菌肽制備率最高，為24.48%。pH繼續(xù)增高時(shí)抗菌肽的制備率則呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。分析原因可能是pH在7左右時(shí)酶的活性最強(qiáng)，增加或者降低pH 都會(huì)影響酶的活性。因此，選擇pH為7作為試驗(yàn)中心點(diǎn)，進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以超聲功率（A）、處理時(shí)間（B）、酶解溫度（C）、pH（D）為自變量，抗菌肽制備率（Y）為因變量，進(jìn)行29 次響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化黑水虻抗菌肽的制備條件。響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。利用Design-Expert 13.01 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，建立二次多項(xiàng)回歸模型如下。

表5 黑水虻抗菌肽制備條件響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)建立的回歸模型進(jìn)行分析，由表6 可知該模型P＜0.000 1，達(dá)到極顯著水平，失擬項(xiàng)P=0.883 6（P＞0.05）不顯著，說(shuō)明該模型擬合度良好；模型決定系數(shù)R2=0.943 3，說(shuō)明僅有不到6%的變異無(wú)法利用該模型進(jìn)行解釋；矯正決定系數(shù)R2Adj=0.876 9，擬合決定系數(shù)R2pred=0.790 7，說(shuō)明該模型可靠，預(yù)測(cè)值與實(shí)際值之間誤差較小，能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)和分析黑水虻抗菌肽最佳制備工藝參數(shù)和結(jié)果。F值反映了回歸方程中各因素對(duì)黑水虻抗菌肽制備率的影響，F(xiàn)值越大，影響越顯著，4個(gè)因素對(duì)制備率影響順序?yàn)锳＞B＞D＞C。對(duì)模型中的回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)顯示，一次項(xiàng)（A、B）、二次項(xiàng)（A2、B2、C2、D2）的回歸系數(shù)均極顯著；一次項(xiàng)（C、D）、互作項(xiàng)（AB、AD、BC）的回歸系數(shù)均顯著；其余均不顯著。

表6 回歸模型分析結(jié)果

2.4 交互作用分析

等高線的形狀反映交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，圓形表示兩因素交互作用不顯著,而橢圓形則表示兩因素交互作用顯著[14]。由圖1～圖6 可知，超聲功率和處理時(shí)間、超聲功率和pH、處理時(shí)間和酶解溫度3個(gè)等高線圖呈橢圓形，故兩因素之間交互作用顯著；超聲功率與酶解溫度、處理時(shí)間與pH、酶解溫度與pH 3個(gè)等高線圖近似圓形，表示兩因素之間交互作用不顯著；各因素在所選擇水平范圍內(nèi)抗菌肽制備率均存在極值。從超聲功率與處理時(shí)間的等高線圖來(lái)看，超聲功率軸向等高線較處理時(shí)間軸向等高線稀疏，表明超聲功率對(duì)響應(yīng)峰值的影響大于處理時(shí)間；同理，超聲功率對(duì)響應(yīng)峰值的影響大于pH；處理時(shí)間對(duì)響應(yīng)峰值的影響大于酶解溫度。

圖1 超聲功率和處理時(shí)間對(duì)抗菌肽制備率的影響

圖2 超聲功率和酶解溫度對(duì)抗菌肽制備率的影響

圖3 超聲功率和pH對(duì)抗菌肽制備率的影響

圖4 處理時(shí)間和酶解溫度對(duì)抗菌肽制備率的影響

圖5 處理時(shí)間和pH對(duì)抗菌肽制備率的影響

圖6 酶解溫度和pH對(duì)抗菌肽制備率的影響

2.5 最佳制備工藝的確認(rèn)與驗(yàn)證

根據(jù)建立的模型得到最佳制備工藝條件為超聲功率52.92 W、超聲時(shí)間22.92 min、酶解溫度52.16 ℃、pH 為7.28，此時(shí)黑水虻抗菌肽的制備率為26.77%。為進(jìn)一步驗(yàn)證最佳制備工藝，綜合考慮經(jīng)濟(jì)性和可操作性的前提下，將制備條件修正為超聲功率53 W、超聲時(shí)間23 min、酶解溫度52 ℃、pH 7.3。按照修正后的制備工藝進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，測(cè)得該條件下黑水虻抗菌肽的制備率為（26.16±0.94）%，與預(yù)測(cè)值26.77%較為接近，表明該響應(yīng)面法優(yōu)化黑水虻抗菌肽制備工藝具有可行性。

2.6 抑菌試驗(yàn)結(jié)果

為確認(rèn)抗菌肽的抑菌性能，測(cè)定了3 次平行驗(yàn)證試驗(yàn)所制備的抗菌肽抑金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑，分別為（16.82±1.27） mm 和(18.71±0.86) mm，表明該制備工藝提取的抗菌肽抑菌效果穩(wěn)定。

3 討論

3.1 蛋白酶的種類對(duì)抗菌肽制備效果的影響

抗菌肽大多是小分子肽[15]，酶解過(guò)程中由于不同酶可以識(shí)別不同的酶切位點(diǎn)，從而得到的多肽產(chǎn)物也不相同[16]。孫長(zhǎng)江等[17]研究認(rèn)為用胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解黃粉蟲(chóng)，抗菌肽得率低，抑菌活性弱，而堿性蛋白酶則取得良好效果。許依能等[7]研究則認(rèn)為用中性蛋白酶酶解南極磷蝦制備的抗菌肽抑菌效果最好，與本試驗(yàn)結(jié)果相似。這可能是因?yàn)槟蠘O磷蝦和黑水虻中的蛋白質(zhì)能夠被中性蛋白酶更充分的酶解，從而暴露更多具有抑菌活性的氨基酸序列[18]，得到更多的抗菌肽。

3.2 超聲條件對(duì)抗菌肽制備效果的影響

超聲波在輔助酶提取多肽過(guò)程中能夠產(chǎn)生熱效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)[19]，使酶的聚合體變得松散，暴露活性位點(diǎn)，讓底物與酶活性位點(diǎn)更易結(jié)合，從而提高酶的活性和反應(yīng)速率[20]。當(dāng)超聲強(qiáng)度超過(guò)最佳強(qiáng)度時(shí)，可以破壞酶和蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)[21-22]，從而降低酶的活性。因此選擇適宜的超聲條件是提高抗菌肽制備效果的關(guān)鍵。許依能等[7]研究認(rèn)為超聲功率120 W，處理25 min 南極磷蝦抗菌肽的提取率最高，抑菌效果最好。本研究則認(rèn)為，超聲功率40 W，處理20 min中性蛋白酶的活性較高，黑水虻抗菌肽制備率高，當(dāng)超聲功率超過(guò)40 W 時(shí)，隨著功率的增大，黑水虻抗菌肽提取率明顯降低。這可能是因?yàn)榈孜锊煌瑢?duì)超聲波的耐受性也不同，高強(qiáng)度的超聲波改變了底物蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象[19]，影響酶活性位點(diǎn)與底物的結(jié)合，從而影響酶解效果。

3.3 交互作用對(duì)抗菌肽制備效果的影響

超聲功率、酶解時(shí)間、酶解溫度、pH 等因素不僅單獨(dú)對(duì)抗菌肽制備效果產(chǎn)生影響，各因素之間還可能存在交互作用。孫長(zhǎng)江等[17]研究表明，酶解時(shí)間與酶解溫度、加酶量與酶解溫度的交互作用對(duì)黃粉蟲(chóng)抗菌肽的制備效果有顯著影響，加酶量和酶解時(shí)間之間的交互作用不顯著。張玥等[13]研究認(rèn)為，乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)與液料比、乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)與超聲時(shí)間的交互作用對(duì)紫貽貝加工下腳料抗菌肽的提取率影響顯著，液料比與超聲時(shí)間的交互作用影響不顯著。本研究結(jié)果表明超聲功率和處理時(shí)間、超聲功率和pH、處理時(shí)間和酶解溫度之間的交互作用對(duì)黑水虻抗菌肽制備效果影響顯著，其余因素之間交互作用不顯著。這說(shuō)明底物、酶和制備條件不同，各因素之間的交互作用對(duì)制備效果的影響也不同，在進(jìn)行制備工藝優(yōu)化過(guò)程中，需要考慮各因素之間的交互作用。

4 結(jié)論

黑水虻抗菌肽的最優(yōu)制備工藝為超聲功率53 W、超聲時(shí)間23 min、酶解溫度52 ℃、pH 為7.3，在該工藝下抗菌肽制備率為（26.16±0.94）%。制備的抗菌肽抑金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑，分別為（16.82±1.27） mm 和（18.71±0.86） mm，說(shuō)明抗菌肽抑菌效果良好。試驗(yàn)表明該工藝制備黑水虻抗菌肽具有可行性。