林 迪,豐晨晨,陳 悅,郭冰林,李嵐?jié)?/p>

(1.河南農(nóng)業(yè)大學林學院,河南 鄭州 450046;2.河南農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院,河南 鄭州 450046)

鎘(Cd)具有降解難、隱蔽性高和毒性強等特點[1-2]。研究表明,Cd脅迫可顯著抑制植物正常生長發(fā)育,使植株矮小、葉色乏綠、根尖變黃、關鍵酶失活、氧化還原系統(tǒng)功能失衡等,嚴重時可造成植物死亡[3]。微塑料(MPs)是指粒徑大于100 nm且小于5 mm的塑料顆粒和碎片,作為一類新型環(huán)境污染物,其在土壤中富集來源廣泛[4]。研究顯示,MPs對植物生長發(fā)育、生理特征均有較大影響,如氧化應激響應、細胞毒性、營養(yǎng)與品質構建等[5]。此外,MPs對植物光合作用、葉片葉綠素和可溶性蛋白質含量等參數(shù)的抑制效應同樣明顯[6-7]。前人對黑藻和黃瓜的研究結果表明,外源添加MPs脅迫后其株高和干重與對照株相比顯著降低[8-9]。

聚苯乙烯微塑料(PS-MPs)是較為常見的MPs之一,具有穩(wěn)定性高、可塑性強、耐腐蝕等特點,在生活中應用廣泛[10]。目前,巨大的PS-MPs使用量增加了農(nóng)田土壤環(huán)境污染風險。前人研究認為,低濃度MPs對植物生長發(fā)育具有促進作用,可激發(fā)植物對MPs的刺激效應,增強植物對環(huán)境變化的耐受性[11];高濃度MPs則會對植物發(fā)育產(chǎn)生負面效應,如造成植物DNA受損、氧化損傷、降低植物光合作用、惡化營養(yǎng)品質等[12]。此外, MPs進入土壤環(huán)境后可與土壤重金屬Cd產(chǎn)生協(xié)同污染效應或相互阻抑效應。王曉晶等[13]研究顯示,添加PS-MPs可顯著降低Cd的生物有效性。與此相反, 寧瑞艷等[14]研究表明,MPs的添加促進了東南景天和葉芽鼠耳芥對Cd的吸收,增強了Cd對東南景天生長的抑制作用。LIAN等[15]研究發(fā)現(xiàn),Cd和PS-MPs聯(lián)合暴露并未顯著激活小麥葉片抗氧化酶活性,但可有效提高小麥葉片有機自由基含量。WANG等[16]研究表明,MPs可以在一定程度上降低Cd的生物利用度,減緩其負向脅迫效應。

作為新型環(huán)境污染物,PS-MPs不僅自身對植物生長發(fā)育具有顯著影響,同時也可作為其他污染物的載體,兩者雙向復合后往往會對植物系統(tǒng)產(chǎn)生“1+1>2”的影響效應[17]。目前, 我國農(nóng)田Cd污染面積高達20萬 km2。西南地區(qū)土壤團聚體調查結果顯示,MPs平均豐度為18 760 kg-1[18]。研究表明,河北地區(qū)土壤中塑料地膜平均殘留量高達100 kg·hm-2以上[19]。城市化、工業(yè)化快速發(fā)展以及農(nóng)膜、農(nóng)藥包裝等塑料制品的大量使用,使Cd和MPs復合污染問題逐漸引起人們廣泛關注和重視。MPs可以作為Cd載體共同進入植物體,對其生長發(fā)育、生理特征產(chǎn)生負面效應[20]。目前有關重金屬Cd與PS-MPs復合影響的研究相對較少,Cd和PS-MPs在植物體內(nèi)的復合效應及機制仍不明晰。

小油菜(Brassicachinensis)是廣受人們喜愛的廣譜蔬菜,在國內(nèi)外多地均有種植。如何減少小油菜等蔬菜產(chǎn)品中重金屬Cd和MPs污染物含量,控制Cd和MPs污染物向食物鏈遷移,繼而保障農(nóng)產(chǎn)品質量安全成為一個重要的科學問題,也是一個亟待解決的技術難題。有關小油菜等蔬菜中Cd與PS-MPs復合脅迫的報道相對較少,其響應Cd與PS-MPs脅迫的生理機制仍不明晰。因此,系統(tǒng)研究Cd與PS-MPs對小油菜生長發(fā)育及生理特征的影響效應,對保護生態(tài)環(huán)境及人體健康安全意義重大。基于此,以小油菜為研究對象,采用室內(nèi)水培實驗,以Cd和PS-MPs為外源脅迫因子,系統(tǒng)探究Cd和2種粒徑(100 nm和1 000 nm)PS-MPs復合脅迫對小油菜生長發(fā)育、光合生理、抗氧化酶活性、葉片解剖結構、營養(yǎng)品質、冠層溫度等生理特征的影響,以期為闡明小油菜在Cd和PS-MPs共存脅迫下的毒理學應激響應機制、環(huán)境風險評估以及Cd與MPs污染治理提供理論參考和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與方法

供試小油菜為目前市場上廣泛種植的常規(guī)品種“五月慢”(購自上海申耕農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司)。該品種全生育期150 d左右,適應性強,品質好,株型高大,在全國范圍均可種植。氯化鎘(CdCl2,分析純)購自福晨(天津)化學試劑有限公司,其純度w高于99%。聚苯乙烯微塑料(PS-MPs)購于上海輝質生物科技有限公司,PS-MPs顆粒的粒徑分別為100和1 000 nm。

水培實驗于河南農(nóng)業(yè)大學水培實驗室進行。選取籽粒飽滿、大小均一的小油菜種子,先用w=15%的H2O2浸泡15 min,再用蒸餾水洗凈后放入30 ℃左右的溫水中浸泡20 min,最后放入裝有少量水的專用育苗盤內(nèi),置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)120 h后轉入人工氣候室。待小油菜長至兩葉一心時,選取長勢一致的幼苗移植到1/8 Hoagland′s營養(yǎng)液的黑色塑料盒中進行培養(yǎng)。隨小油菜幼苗長勢增大,每隔3 d逐步將營養(yǎng)液濃度調整為1/4、1/2和全量Hoagland′s濃度。水培試驗均在人工氣候室進行,晝夜時間為16 h∶8 h, 晝夜溫度均保持在20 ℃,相對濕度為55%～65%。

1.2 實驗設計

根據(jù)課題組前期預實驗及相關研究結果,確定小油菜中等和高Cd脅迫濃度范圍分別為10～30和150～250 μmol·L-1;中等和高PS-MPs脅迫濃度范圍則分別為0.5～1.5和15～25 mg·L-1?；诖?將Cd和PS-MPs脅迫梯度分別設為0、20、200 μmol·L-1(分別記為Cd0、Cd20、Cd200)和0、1、20 mg·L-1(分別記為MPs0、MPs1、MPs20)。待小油菜第3片心葉完全展開時,澆灌添加Cd和2種粒徑PS-MPs復合脅迫處理的Hogland′s營養(yǎng)液。共設置9個處理, 分別為Cd0-MPs0(CK)、Cd0-MPs1、Cd0-MPs20、Cd20-MPs0、Cd20-MPs1、Cd20-MPs20、Cd200-MPs0、Cd200-MPs1、Cd200-MPs20。每3 d更換1次營養(yǎng)液,同時控制營養(yǎng)液的pH值在6.0左右。每個處理設5次重復。

表1 Cd和PS-MPs復合脅迫下小油菜生長發(fā)育響應特征

表3 Cd和PS-MPs復合脅迫下小油菜葉片抗氧化酶活性

表4 Cd和PS-MPs復合脅迫條件下小油菜葉片品質特征

表5 Cd和PS-MPs復合脅迫條件下小油菜葉片解剖結構的特征

1.3 指標測定

1.3.1表型生長指標測定

分別于小油菜四葉期、六葉期和八葉期,使用直尺(精確到0.1 cm)測量小油菜株高,采用數(shù)碼相機拍照法無損測試葉面積。將小油菜地上部和根稱重后,置于105 ℃烘箱中殺青30 min,然后降溫至70 ℃烘干至恒重,稱其干重。

1.3.2葉片葉綠素含量測定

分別于上述小油菜生育期,各處理選取第3片完全展開葉(自上而下),采用丙酮浸提、分光光度法測試葉片葉綠素〔Chl-a、Chl-b和Car(類胡蘿卜素〕含量[21]24-26。

1.3.3抗氧化酶活性測定

分別采用碘量法測定過氧化氫酶(CAT)活性,愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶(POD)活性,硫代巴比妥酸法測定丙二醛(MDA)含量,抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性參考侯福林[21]30-32的方法測定。CAT酶活性用1 g鮮重樣品1 min內(nèi)分解H2O2的質量表示。POD酶活性以1 min氧化1 nmol愈創(chuàng)木酚定義為1個酶活力單位。APX活性以1 min氧化1 nmol抗壞血酸定義為1個酶活力單位。

1.3.4品質指標測定

采用蒽酮比色法測試小油菜葉片可溶性糖含量,考馬斯亮藍法測定葉片可溶性蛋白含量,2,6-二氯酚靛酚滴定法測定葉片維生素C含量[21]54-56。

1.3.5葉片解剖結構測定

于各生育期選取小油菜第1片完全展開葉,在距離主葉脈0.5 cm左右處剪取1 cm×3 cm大小葉片,采用石蠟樹脂包埋、甲苯胺藍染色法制作切片。在OLYMPUS BH2型植物顯微成像分析系統(tǒng)中選取5個視野清晰的位置拍攝,拍攝倍數(shù)為200倍。利用Image-Pro Plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件測定葉片解剖結構指標。

1.3.6植物熱成像指標測定

采用Fluke TiX650型紅外熱成像儀測定小油菜冠層溫度。將紅外相機固定在小油菜植株上方約1.0 m高度,45°觀察角俯視拍攝。每次重復拍攝4張照片, 采用SmartView軟件對小油菜冠層溫度進行分析。

1.3.7Cd濃度和積累量測定

稱取烘干并磨碎的植物樣10.0 mg置于消煮管中,采用HNO3-HClO4(體積比3∶1)混合液浸提,原子吸收光譜儀測定小油菜根和葉片Cd含量,并計算各部位Cd積累量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007軟件進行基礎數(shù)據(jù)輸入和分析,采用SPSS 25.0軟件進行方差分析,利用Origin 2018軟件作圖。

2 結果與討論

2.1 Cd與PS-MPs復合脅迫對小油菜生長發(fā)育的影響

植株生長發(fā)育受其體內(nèi)化學過程控制,故其能夠在外界脅迫時作出敏感反應[22]。實驗結果(表1)顯示,Cd脅迫顯著抑制小油菜生長發(fā)育,低PS-MPs濃度(1 mg·L-1)可有效緩解Cd脅迫毒害效應,而高PS-MPs濃度(20 mg·L-1)則加劇Cd脅迫效應(表1)。20 和200 μmol·L-1Cd與不同粒徑PS-MPs共存對小油菜各生育期脅迫效應表現(xiàn)為:低濃度PS-MPs(1 mg·L-1)下小油菜株高、葉面積、根干重和葉干重顯著增加,Cd脅迫毒害效應降低;高濃度PS-MPs(20 mg·L-1)下小油菜上述生長發(fā)育指標與對照(MPs0)相比整體呈降低趨勢。已有研究表明,MPs對植物生長不僅具有直接危害,同時也可作為重金屬載體對植物產(chǎn)生間接毒性,導致重金屬Cd與MPs聯(lián)合污染產(chǎn)生協(xié)同效應[17, 23],影響植物正常生長發(fā)育[24-26]。WANG等[27]研究認為,聚乳酸微塑料(PLA-MPs)可增強Cd的生物毒性,激活氧化還原系統(tǒng),抑制玉米生長。該實驗結果與上述結論不盡一致,即PS-MPs與Cd互作呈“低促高抑”的變化趨勢,表明MPs對Cd毒性的影響因MPs類型、粒徑和濃度等而異。

2.2 Cd與PS-MPs復合脅迫對小油菜Cd積累效應的影響

在Cd濃度為20 μmol·L-1時,小油菜單株根和葉Cd積累量均隨PS-MPs濃度增加呈先升高后降低的變化趨勢;在Cd濃度為200 μmol·L-1時,小油菜單株根和葉Cd積累量均隨PS-MPs濃度增加呈降低趨勢(圖1)。研究表明,MPs可吸附眾多微量元素,如Cd、Al、Cu等,其中Cd因其污染范圍廣、移動性大等特點極易和MPs形成Cd-MPs復合體[28]。Cd-MPs復合體可顯著提高Cd的生物積累,并增強Cd對生物體的毒性。寧瑞艷等[14]研究顯示,MPs的添加促進了東南景天和葉芽鼠耳芥對Cd的吸收,增強了Cd對東南景天生長的抑制作用,但當MPs質量濃度為500 mg·L-1時Cd對葉芽鼠耳芥的毒害作用有所減弱。筆者研究同樣表明,低濃度PS-MPs可緩解Cd對小油菜的毒害作用,高濃度PS-MPs則與此相反,主要原因可能是PS-MPs吸附了溶液中的Cd2+,導致Cd2+濃度降低,進而降低了小油菜幼苗根部對Cd2+的吸收[29]。

Cd0、Cd20、Cd200分別表示Cd濃度為0、20、200 μmol·L-1;MPs0、MPs1、MPs20分別表示PS-MPs質量濃度為0、1和20 mg·L-1。同一列數(shù)據(jù)后小寫字母不同表示相同Cd濃度下不同PS-MPs處理之間某指標差異顯著(P<0.05), 大寫字母不同表示相同PS-MPs濃度下不同Cd處理之間某指標差異顯著(P<0.05)。

2.3 Cd與PS-MPs復合脅迫對小油菜葉綠素含量的影響

葉綠素是植物進行光合作用的主要色素,為生命活動提供能量來源。由表2可知,2種粒徑PS-MPs與Cd的復合脅迫效應均表現(xiàn)為隨Cd濃度增加, 小油菜Chl-a、Chl-b和類胡蘿卜素含量逐步下降;外源添加低濃度(1 mg·L-1)PS-MPs可有效緩解Cd毒害效應,提高葉綠素含量。隨PS-MPs濃度升高(20 mg·L-1),其與Cd復合脅迫呈協(xié)同趨勢變化,即進一步加劇毒害脅迫,降低葉綠素含量。研究表明,環(huán)境脅迫可引起植物葉片葉綠體中色素蛋白脂質復合物的弱化甚至解體,或是與葉綠素分子合成有關的蛋白酶受到限制,進而導致葉綠素含量降低[30]。目前,Cd和MPs復合脅迫對植物生長表現(xiàn)出2種效應。一是協(xié)同效應,即MPs脅迫增強Cd對植物生長的抑制效應。MPs吸附Cd后聚集在根系表面,較大粒徑的MPs容易造成根細胞孔堵塞,影響根對水分及營養(yǎng)物質的吸收,同時也增加根系與Cd的接觸,便于更多的Cd進入植物根部,加重對植物生長的抑制作用。二是拮抗效應,MPs較多的吸附位點無法直接進入植物體內(nèi),使營養(yǎng)液中Cd含量減少,導致Cd生物利用性降低,同時較高濃度MPs相互吸附發(fā)生團聚,產(chǎn)生濃度聚集效應,導致粒徑變大,吸附位點增加,從而降低Cd的生物利用性。

2.4 Cd與PS-MPs復合脅迫對小油菜抗氧化酶活性的影響

抗氧化防御體系是植物調節(jié)細胞代謝平衡的重要屏障[31]。當植物受到環(huán)境脅迫時,細胞內(nèi)可產(chǎn)生大量的ROS,如超氧陰離子(O2-)、過氧化氫(H2O2)和羥基(OH-)等,破壞植物細胞膜、蛋白質和DNA,造成細胞損傷[32-33]。研究表明,少量ROS作為信號分子可誘導植物對外界脅迫產(chǎn)生應激響應,使其體內(nèi)抗氧化酶活性增強,SOD將O2-歧化為H2O2,POD、CAT和APX則將H2O2還原為H2O和O2[34]。表3顯示,20 μmol·L-1Cd與不同粒徑PS-MPs脅迫下小油菜呈現(xiàn)較低的脅迫效應,當PS-MPs質量濃度為1 mg·L-1時POD、APX和CAT酶活性顯著降低;20 μmol·L-1Cd與高濃度(20 mg·L-1)PS-MPs共存時,CAT、POD和APX酶活性顯著高于對照,進一步表明低濃度PE-MPs可緩解Cd毒害效應,高濃度PE-MPs則加劇Cd毒害程度。

2.5 Cd與PS-MPs復合脅迫對小油菜品質的影響

由表4可知,Cd和PS-MPs復合脅迫對小油菜葉片維生素、可溶性糖和可溶性蛋白含量產(chǎn)生先升后降的脅迫效應。四葉期,Cd(20 μmol·L-1)和PS-MPs(1 mg·L-1)共存時小油菜葉片可溶性糖、可溶性蛋白、維生素含量皆高于Cd單一處理,分別為0.37、6.29、70.91 mg·g-1(100 nm PS-MPs)和0.30、5.63、46.52 mg·g-1(1 000 nm PS-MPs)。

當PS-MPs質量濃度達20 mg·L-1時,葉片可溶性糖、可溶性蛋白、維生素含量低于Cd單一處理,即低濃度(1 mg·L-1)PS-MPs提升了小油菜品質,而高濃度(20 mg·L-1)PS-MPs對葉片上述指標產(chǎn)生負面效應,表現(xiàn)為“低促高抑”現(xiàn)象。

2.6 Cd與PS-MPs復合脅迫對小油菜葉片解剖結構的影響

外源脅迫會導致植物葉片結構、形態(tài)和功能產(chǎn)生改變。Cd進入植物體會導致葉片葉綠素分解、細胞膜破損、細胞質流失、細胞核空心化、葉片柵海比異常以及葉片變厚[35-36]。趙素貞等[37]研究表明,Cd脅迫下葉片變薄,柵欄組織產(chǎn)生明顯應激反應,排列更為緊密,細胞間隙縮小。表5顯示,當Cd濃度分別為0、20和200 μmol·L-1時,隨PS-MPs濃度增加,小油菜葉片葉厚、柵欄組織、海綿組織厚度呈先升高后降低的變化趨勢。即低濃度PS-MPs(1 mg·L-1)可有效緩解Cd對小油菜的毒害效應,提高葉片厚度;而Cd與高濃度PS-MPs(20 mg·L-1)復合脅迫呈協(xié)同疊加抑制效應。高濃度PS-MPs與Cd復合脅迫導致葉片抗性增加,在一定程度上會加劇消耗海綿體內(nèi)水分,降低光合效能。

2.7 Cd與PS-MPs復合脅迫對小油菜冠層溫度的影響

葉片溫度反映作物生長的生理過程和能量交換,是作物生長發(fā)育及響應脅迫效應的重要指標。研究表明,作物群體溫度與其光合作用密切相關。作物受外界脅迫效應較弱時,生長發(fā)育較好,葉片葉綠素含量升高,光合作用增強,呈現(xiàn)出明顯的蒸騰吸熱現(xiàn)象,使群體溫度降低;反之,則溫度升高[38]。圖2表明,小油菜植株群體溫度受Cd及PS-MPs復合脅迫影響顯著,其變化趨勢與生長發(fā)育、理化指標變化趨勢一致。徐小龍[39]研究發(fā)現(xiàn),患病黃瓜葉片和對照相比有1 ℃的溫差,感病番茄葉片溫度比正常葉片低0.5～1.2 ℃,表明植株在受到外界脅迫時溫度呈降低趨勢。筆者研究中,與對照相比,小油菜受Cd與PS-MPs復合脅迫后,生長發(fā)育延緩,光合色素含量減少,葉片產(chǎn)生應激反應,氣孔關閉,水分蒸發(fā)減少,導致植株冠層溫度升高。

Cd0、Cd20、Cd200分別表示Cd濃度為0、20、200 μmol·L-1;MPs0、MPs1、MPs20分別表示PS-MPs質量濃度為0、1和20 mg·L-1。

3 結論

低濃度PS-MPs (1 mg·L-1)可有效緩解小油菜Cd毒害效應,促進小油菜生長發(fā)育,增加葉片光合色素、品質和葉片厚度等生理特征,降低抗氧化酶活性和冠層溫度。與此相反, Cd與高濃度PS-MPs (20 mg·L-1)復合脅迫則加劇小油菜毒害效應,兩者呈協(xié)同疊加的抑制作用。總體而言,Cd與PS-MPs復合脅迫對小油菜生長的影響呈“低促高抑”的變化趨勢。研究結果可為小油菜Cd與MPs污染治理提供重要實驗參考和理論支撐。