楊 影, 陳東升, 趙艾艾, 何才蓉, 陳鳳嬌, 何運(yùn)雪, 鄭 梅, 陸 瑩, 丁 潔*

(1)貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院, 山地植物資源保護(hù)與保護(hù)種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴陽(yáng) 550025;2)貴州省人民醫(yī)院科研處, 貴陽(yáng) 550025;3)貴州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解刨學(xué)教研室, 貴陽(yáng) 550025)

皮膚是機(jī)體感知外界刺激的重要器官,當(dāng)皮膚的結(jié)構(gòu)完整性受損時(shí),身體防御機(jī)制的功能就會(huì)被破壞,引起嚴(yán)重的發(fā)病率和死亡率[1,2]。傷口愈合是一個(gè)復(fù)雜有序的生理過(guò)程,需要多種細(xì)胞和活性因子共同參與皮膚組織的修復(fù)和重建[3,4]。合理地調(diào)控炎癥和血管生成反應(yīng)是改善傷口愈合不良引起瘢痕疙瘩和增生性疤痕產(chǎn)生的有效手段。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cell, EPC)作為血管生成的主導(dǎo)細(xì)胞,通過(guò)動(dòng)員、歸巢、增殖和分化來(lái)介導(dǎo)血管損傷后的內(nèi)皮化過(guò)程,并利用旁分泌細(xì)胞因子募集單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞到創(chuàng)傷處,從而加速傷口愈合[5-7]。然而,臨床研究中由于自體EPC的數(shù)量有限,且遷移和歸巢等生理活性差導(dǎo)致新生血管形成效果不理想[8]。因此,擴(kuò)展EPC的獲取來(lái)源尤為重要,胚胎干細(xì)胞衍生的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞將成為傷口修復(fù)和組織再生的重要種子細(xì)胞源[9-11]。增強(qiáng)EPC生物學(xué)功能是改善EPC對(duì)急性/慢性傷口愈合治療的重要策略。

據(jù)報(bào)道,腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor- α, TNF-α)通過(guò)促進(jìn)炎癥反應(yīng),刺激血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (vascular endothelial growth factor, VEGF)介導(dǎo)毛細(xì)血管再生、幫助肉芽組織的構(gòu)建,改善傷口愈合過(guò)程[12-14]。低劑量促炎因子TNF-α預(yù)處理的EPC可顯著增加EPC的遷移歸巢活性和管腔形成能力[15,16]。VEGF是一種血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子,不僅能在體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為內(nèi)皮祖細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞,還是創(chuàng)面血管化的主要調(diào)控因子,具有促內(nèi)皮細(xì)胞遷移和新生血管形成的作用[17-19]?？梢?jiàn),TNF-α和VEGF在血管生成、血管通透性以及創(chuàng)面組織再生中發(fā)揮著重要作用。目前,TNF-α和VEGF協(xié)同處理對(duì)EPC功能的影響尚不清晰,雙因子與EPC協(xié)同治療創(chuàng)面修復(fù)的生物學(xué)效應(yīng)尚未見(jiàn)報(bào)道。

本文以mESC(mouse embryonic stem cells)分化獲得的EPC為研究材料,通過(guò)雙因子協(xié)同培養(yǎng)細(xì)胞,驗(yàn)證VEGF和TNF-α聯(lián)合作用可增強(qiáng)mESC衍生EPC的黏附、遷移和管腔形成能力。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步建立小鼠創(chuàng)傷模型,探究VEGF和TNF-α協(xié)同EPC促小鼠創(chuàng)傷愈合的可能性。本研究旨在利用細(xì)胞與生長(zhǎng)因子協(xié)同療法為在皮膚創(chuàng)傷的臨床治療中提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠胚胎干細(xì)胞(品系:RW.4)購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞庫(kù);無(wú)特定病原體級(jí)ICR雄性小鼠購(gòu)于長(zhǎng)沙市天勤技術(shù)有限公司。

主要試劑:DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Gbico);胎牛血清(Gbico);MEM非必需氨基酸(Gbico);L-谷氨酰胺(Gbico);青-鏈霉素(Gbico);胰酶(Gbico);β-巰基乙醇(Sigma);bFGF(R&D Systems);VEGF(R&D Systems);TNF-α(Peprotech);Matrigel基質(zhì)膠(BD Biosciences);4%多聚甲醛(Biosharp);CD34抗體(Servicebio);CD133抗體(Servicebio);VEGF抗體(Servicebio);TNF-α抗體(Servicebio);CD31抗體(BD Pharmingen);ANG1抗體(Affinity);ANG2抗體(Affinity);GAPDH抗體(Affinity)。

1.2 內(nèi)皮祖細(xì)胞的體外分化及分組

加入0.05%含EDTA的胰酶消化mESC,待mESC與飼養(yǎng)層MEF細(xì)胞相分離脫落,用2～3倍胰酶體積的mESC培養(yǎng)液終止消化后收集細(xì)胞,800 r/min,離心3 min,并將細(xì)胞重懸液接入6 cm皿中,貼壁40 min后棄上清,沿壁加入4 mL EPC培養(yǎng)液,并添加10 ng/mL VEGF和5 ng/mL bFGF誘導(dǎo)3 d,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為3組:V組:10 ng/mL VEGF處理mESC衍生的EPC為對(duì)照組;T組:10 ng/mL TNF-α處理mESC衍生的EPC;VT組:10 ng/mL VEGF和10 ng/mL TNF-α協(xié)同處理mESC衍生的EPC。放置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,收集各組細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 RT-PCR

分別提取mESC和誘導(dǎo)3 d后EPC的總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,采用SYBR Green PCR試劑盒進(jìn)行RT-PCR檢測(cè),引物列于Table1。

Table 1 Primer sequences

1.4 Western 印跡檢測(cè)

在分別裝有mESC和mESC-EPC的EP管中加入RIPA裂解液,提取細(xì)胞總蛋白質(zhì),BCA法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度,根據(jù)不同蛋白質(zhì)分子量選擇合適的SDS-PAGE上樣凝膠,上樣、電泳、經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉、用一抗(CD34、CD133和GAPDH)4 ℃孵育轉(zhuǎn)膜過(guò)夜、經(jīng)洗滌、室溫二抗孵育1 h,隨后加入ECL化學(xué)發(fā)光液顯影并拍照。

1.5 黏附和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

黏附實(shí)驗(yàn):將實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞以1×105個(gè)/孔細(xì)胞量接種于預(yù)鋪0.1%明膠的24孔板中,37 ℃孵育4 h,棄去培養(yǎng)液,用PBS洗去懸浮細(xì)胞。倒置相差顯微鏡照相(20×),計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞數(shù)目。

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn):將mESC衍生的EPC接種于預(yù)鋪有0.1%明膠的6孔板中,待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%匯合率后用10 μL的移液槍頭劃痕。PBS清洗漂浮細(xì)胞,將細(xì)胞(繼續(xù))培養(yǎng)在含有10 ng/mL VEGF、10 ng/mL TNF-α和10 ng/mL VEGF+10 ng/mL TNF-α的EPC培養(yǎng)液中,在倒置顯微鏡下統(tǒng)計(jì)0 h、12 h、24 h細(xì)胞遷移率。

1.6 細(xì)胞管腔形成分析

將融化的Matrigel膠預(yù)鋪在預(yù)冷的24孔板中,放入37 ℃培養(yǎng)箱中30 min使膠凝固。10 ng/mL VEGF、10 ng/mL TNF-α、10 ng/mL TNF-α+ VEGF處理內(nèi)皮化2 d細(xì)胞經(jīng)24 h后消化收集,以5×105個(gè)/孔細(xì)胞量均勻接種到鋪有基質(zhì)膠的24孔板中,置于37 ℃培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)24 h后拍照。每組設(shè)置5個(gè)重復(fù),采用Image J圖像分析軟件計(jì)算管腔節(jié)點(diǎn)和分支長(zhǎng)度。

1.7 體內(nèi)小鼠傷口全層皮膚創(chuàng)傷檢測(cè)

1.7.1 動(dòng)物分組及小鼠創(chuàng)傷模型建立 動(dòng)物分組:將購(gòu)買的35只8周齡(33～37 g)ICR雄性小鼠分成5組;PBS組:陰性對(duì)照組;EPC組:mESC-EPC注射到小鼠皮膚創(chuàng)周處;VE組:10 ng/mL VEGF協(xié)同mESC-EPC注射到小鼠皮膚創(chuàng)周處;TE組:10 ng/mL TNF-α協(xié)同mESC-EPC注射到小鼠皮膚創(chuàng)周處;VTE組:10 ng/mL VEGF和10 ng/mL TNF-α協(xié)同mESC-EPC注射到小鼠皮膚創(chuàng)周處。

小鼠創(chuàng)傷模型建立:用腹腔注射200～300 μL 4%水合氯醛麻醉小鼠,剃去背部毛發(fā),用眼科剪切除全層皮膚,以形成1.5 cm直徑的創(chuàng)面。碘伏消毒但不包扎,在圓形創(chuàng)周處3個(gè)位點(diǎn)各注射100 μL添加不同因子處理的細(xì)胞懸液(1×106個(gè)),PBS組和EPC組小鼠創(chuàng)周處注射300 μL的PBS或EPC細(xì)胞懸液。

1.7.2 傷口愈合率分析 每天觀察小鼠創(chuàng)面的愈合情況并拍照記錄,統(tǒng)計(jì)各組小鼠d0、d3、d7和d13的背部創(chuàng)口面積,通過(guò)Image J軟件分析計(jì)算傷口愈合率(創(chuàng)口愈合率=d0的傷口面積-dn的傷口面積)/d0的傷口面積×100%)。

1.7.3 小鼠皮膚傷口愈合組織學(xué)分析 HE染色:待小鼠皮膚傷口愈合,取皮膚創(chuàng)面組織固定于10%多聚甲醛溶液中,HE染色后置于顯微鏡下觀察組織的病理變化。

免疫組化:取13 d的創(chuàng)面組織切片、脫蠟、復(fù)水后浸泡于0.01 mol/L 檸檬酸鈉抗原修復(fù)液中熱修復(fù)。用含5% BSA的PBST封閉30 min,加入一抗(TNF-α、CD31、VEGF)4 ℃孵育過(guò)夜,二抗室溫避光孵育1 h,經(jīng)DAB顯色劑顯色,用中性樹(shù)脂封片,顯微鏡下拍照并記錄內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白質(zhì)VEGF、CD31和炎癥因子TNF-α的表達(dá)情況,在同一圖像中隨機(jī)截取5個(gè)視野,使用Image Pro Plus軟件進(jìn)行平均光密度(Mean optical density; MOD)分析。

1.7.4 傷口炎癥細(xì)胞生成和新生血管的差異分析 不同處理組的組織病理切片中隨機(jī)選取5個(gè)視野,觀察并計(jì)算視野中新生血管和炎癥細(xì)胞的數(shù)量。同時(shí),觀察TE組7 d和13 d炎癥細(xì)胞生成情況。

1.7.5 Western印跡檢測(cè)相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)水平 將創(chuàng)面皮膚組織用液氮研磨,加入RIPA裂解液,提取總蛋白質(zhì)并測(cè)濃度。檢測(cè)皮膚樣本中ANG1、ANG2和TNF-α蛋白質(zhì)表達(dá)水平,使用Image J軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)灰度值分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 小鼠胚胎干細(xì)胞體外分化3 d的細(xì)胞鑒定為內(nèi)皮祖細(xì)胞

mESC克隆團(tuán)呈圓形或橢圓形,邊界清晰(Fig.1A)。經(jīng)胰酶消化的mESC接種于6 cm皿中,采用含10 ng/mL VEGF和5 ng/mL bFGF培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),內(nèi)皮化3 d的細(xì)胞呈現(xiàn)典型的梭形、多邊形或圓形的內(nèi)皮祖細(xì)胞樣形態(tài),以鋪路石狀鋪展于皿底(Fig.1B)。

Fig.1 The endothlialization of mESC over a 3-day period was verified as EPC (A) Observation on the cell morphology of mESC, scale bar: 100 μm; (B) Analysis of cells on day 3 of EPC differentiation, scale bar: 100 μm ; (C) RT-PCR assessment of the expression of marker genes for mESC (Oct4, KIF4, Sox2 and Nanog) and EPC (CD133 and CD34) ; (D) The expression of CD133, CD34 in each group examined by Western blotting

通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、RT-PCR和Western 印跡分析驗(yàn)證內(nèi)皮化3 d細(xì)胞為內(nèi)皮祖細(xì)胞。內(nèi)皮化3 d細(xì)胞低表達(dá)mESC的干性基因Oct4、Klf4、Sox2和Nanog,高表達(dá)EPC的標(biāo)志基因CD133和CD34(Fig.1C)。內(nèi)皮化3 d細(xì)胞中CD133和CD34在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)顯著高于mESC (Fig.1D)。結(jié)果表明,mESC經(jīng)過(guò)10 ng/mL VEGF和5 ng/mL bFGF誘導(dǎo)培養(yǎng)3 d后穩(wěn)定分化為EPC,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 VEGF和TNF-α協(xié)同作用促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的黏附能力和遷移能力

通過(guò)黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)VEGF和TNF-α單獨(dú)或協(xié)同對(duì)EPC體外黏附能力的影響。與V組(60.78 ± 1.499個(gè))和T組(72.53 ± 4.096個(gè))相比,VT協(xié)同處理組(101.56 ± 5.814個(gè))的EPC黏附能力明顯增強(qiáng),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01, Fig.2A和2C)。

Fig.2 Comparison of adhesion and migration ability in different treatment groups (A) Adhesion ability of EPC in different treatment groups after 4 hours, scale bar: 100 μm; (B) Cell migration at 0 hours, 12 hours and 24 hours from the scrape margin, scale bar: 100 μm; (C, D) Quantitative analysis of migration rates and adhesion in V (the VEGF group), T (the TNF-α group) and VT (the VEGF and TNF-α combination group). Mean ± SD (n = 3).*P <0.05,**P <0.01,***P <0.001

通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同處理組EPC的遷移能力,劃痕12 h,聯(lián)合處理組(46.71 ± 14.73%)的EPC遷移能力顯著高于V組(20.22 ± 1.83%)和T組(17.04 ± 3.67%);劃痕24 h時(shí),VT組(63.62 ± 7.70%)仍具有較好的遷移能力,細(xì)胞遷移差異相比于12 h更為明顯,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01, Fig.2B和2D)。上述結(jié)果表明,VEGF和TNF-α協(xié)同比單因子處理較好地促進(jìn)mESC-EPC的黏附和遷移功能。

2.3 TNF-α促進(jìn)VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮祖細(xì)胞管腔形成能力

驗(yàn)證了VEGF和TNF-α協(xié)同作用促進(jìn)EPC的黏附能力和遷移能力的基礎(chǔ)之上,進(jìn)一步檢測(cè)VEGF和TNF-α協(xié)同處理對(duì)EPC管腔形成能力的影響。結(jié)果正如Fig.3所示,各組都具有管腔形成能力,各組分支節(jié)點(diǎn)數(shù)和總分支長(zhǎng)度的趨勢(shì)為VT (152.75 ± 8.44; 9.51×103± 0.39) >T (144.25 ± 18.90; 9.10×103± 1.17) >V (108 ± 7.50; 5.12×103± 0.29)。其中T組和VT組的管腔總分支長(zhǎng)度和分支節(jié)點(diǎn)數(shù)明顯高于V組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05, Fig.3B),結(jié)果表明,TNF-α可增強(qiáng)VEGF介導(dǎo)的EPC管腔形成能力。

Fig.3 Comparison of lumen formation capablilty in different treatment groups (A) A tube formation assay was performed on EPCs seeded on Matrigel with different treatments for 24 hours, and subsenquently observed under a light microscope, scale bar : 100 μm. Note: The regions marked by the red arrows represent sites of luminal formation; (B) Statistical analysis of the total lumen branch length and number of branch nodes within V (the VEGF group), T (the TNF-α group) and VT (the VEGF and TNF-α combination group). Mean ± SD (n = 4).*P <0.05,**P <0.01,***P <0.001

2.4 VEGF和TNF-α協(xié)同小鼠胚胎干細(xì)胞衍生的內(nèi)皮祖細(xì)胞促小鼠皮膚傷口愈合

2.4.1 血管生成因子VEGF和促炎因子TNF-α的協(xié)同作用促傷口愈合 小鼠皮膚創(chuàng)傷建模后,連續(xù)觀察13 d,拍照記錄結(jié)果正如Fig.4A所示。傷口愈合率趨勢(shì)為:VTE >TE >VE >EPC >PBC。其中VTE組的創(chuàng)面愈合率:4 d (36.54±1.41%)、8 d (62.78 ± 1.20%)、10 d (88.69 ± 0.58%)和13 d (96.82 ± 0.11%)傷口愈合率均顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組,第10 d極為顯著,均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05, Fig.4B)。由此可見(jiàn),VEGF和TNF-α協(xié)同EPC處理能加速小鼠皮膚傷口愈合。

Fig.4 Detection of mouse skin wounds in different treatment groups (A) Photographic documentation of wound progression on the dorsal surface of mice at different time intervals; (B) Percentage of wound healing at different posttraumatic time points, with the order of efficacy being: VTE >TE >VE >EPC >PBS. Mean ± SD (n = 5).*P <0.05,**P <0.01,***P <0.001

2.4.2 VEGF和TNF-α協(xié)同促傷口組織再生 創(chuàng)傷治療13 d時(shí),取不同組小鼠創(chuàng)周處組織切片進(jìn)行HE染色,觀察病理學(xué)差異。結(jié)果如Fig.5A和5B所示,VTE組(271.22 ± 21.19 μm)和TE組(220.24 ± 14.52 μm)的皮膚再生真皮層相較PBS組(132.72 ± 8.55 μm)、EPC組(156.42 ± 6.13 μm)和VE組(156.61 ± 5.75 μm)明顯增厚。VTE組與TE組也具有極顯著差異性(P<0.001)。相比于VE組和TE組,VTE組小鼠創(chuàng)面覆蓋有連續(xù)且完整的表皮層,新生毛囊增多,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少,毛細(xì)血管豐富且管腔粗大。結(jié)果表明:VEGF和TNF-α協(xié)同EPC能有效促進(jìn)小鼠皮膚損傷后的愈合和組織再生。

Fig.5 Pathological alterations in mouse skin wounds among different treatment groups (A) Representative images of HE staining of wound skin tissue sections 13 days after surgery, scale bar : 100 μm. Note: black double arrow = dermal thickness; Dark blue arrow = skin appendage; Red arrow = new blood vessels; Green arrow = inflammatory cells. (B, C) The thickness of new dermis and the number of new blood vessels in different treatment groups: VTE >TE >VE >EPC >PBS; (D) The number of new inflammatory cells in different treatment groups: VTE

2.4.3 VEGF和TNF-α協(xié)同促新生血管生成率和早期炎癥反應(yīng) 進(jìn)一步評(píng)估PBS組、EPC組、VE組、TE組和VTE組的新生血管量和炎癥反應(yīng),VTE組(72.8 ± 13.17)的新生血管數(shù)顯著高于PBS組(3.2 ± 1.94)、EPC組(15 ± 4.20)、VE組(15.6 ± 2.24)和TE組(21.6 ± 10.97),具有統(tǒng)計(jì)意義(P< 0.001, Fig.5C)。各組創(chuàng)周處炎癥細(xì)胞數(shù)目差異趨勢(shì)為VTE (29.4 ± 7.39)

2.4.4 CD31和VEGF在VTE組表達(dá)量增加 在HE染色的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步通過(guò)免疫組化染色分析TNF-α、CD31和VEGF蛋白質(zhì)在傷口愈合過(guò)程中炎癥反應(yīng)和血管生成的差異。結(jié)果如Fig.6A所示,建模13 d時(shí),TNF-α蛋白的表達(dá)定位于毛囊中。相比于VE組和TE組,PBS組和EPC組呈強(qiáng)陽(yáng)性,VTE組呈弱陽(yáng)性;不同處理組的平均光密度趨勢(shì)為VTE

Fig.6 Immunohistochemistry analysis of TNF-α, CD31 and VEGF in the skin wound area of mice (A) Immunohistochemistry stanining of TNF-α (50×), CD31(50×) and VEGF (100×) conducted after 13 days of wound healing in each group, scale bar : 20 μm.; (B) Variations in the mean optical density of TNF-α among different treatment groups: VTE VE >TE >EPC >PBS. Mean±SD (n = 5).*P <0.05,**P <0.01,***P <0.001

2.4.5 VTE組的ANG1、ANG2和TNF-α蛋白表達(dá)增高更多 血管生成素ANG1和ANG2是血管重塑和成熟的重要調(diào)節(jié)因子,過(guò)度的炎癥反應(yīng)將影響血管形成以及傷口愈合重塑階段,通過(guò)Western 印跡檢測(cè)各組治療13 d后創(chuàng)周處ANG1、ANG2和促炎因子TNF-α的表達(dá)情況。與PBS組、EPC組、VE組和TE組相比,VTE組的新生皮膚組織高表達(dá)ANG1 (1.80 ± 0.58)和ANG2 (1.92 ± 0.71),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí),各創(chuàng)周治療組TNF-α蛋白表達(dá)趨勢(shì)為VTE(0.34 ± 0.03)

Fig.7 Differences of TNF-α, ANG1 and ANG2 protein levels in each group (A) Protein levels of TNF-α, ANG1 and ANG2 in each group were determined using Western blotting, with GAPDH serving as a control. (B, C) Changes in protein expression contents were analyzed by gray values (using Image J) of each band and compared to the control group. Mean±SD (n =3).*P <0.05,**P <0.01,***P <0.001

3 討論

有效的皮膚傷口愈合需要協(xié)調(diào)凝血級(jí)聯(lián)、免疫細(xì)胞流入、上皮和血管形成以及組織重塑,還需多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞外信號(hào)創(chuàng)造的有利微環(huán)境[4,20,21]。其中炎癥反應(yīng)和血管生成在傷口修復(fù)過(guò)程中相互串?dāng)_。創(chuàng)傷后的微血管網(wǎng)絡(luò)形成有助于將炎癥細(xì)胞募集到傷口處清除碎片,提供維持肉芽組織再生的氧氣和營(yíng)養(yǎng),而炎癥細(xì)胞分泌的急性因子(TNF-α)和血管生成因子(VEGF)進(jìn)一步刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞遷移到損傷部位,參與血管生成和組織修復(fù)[22-24]。然而,機(jī)體內(nèi)源性內(nèi)皮祖細(xì)胞來(lái)源和數(shù)量少,導(dǎo)致血管生成不足,延遲傷口愈合。體外分化的EPC移植可彌補(bǔ)內(nèi)源性內(nèi)皮祖細(xì)胞不足,在一定程度上促進(jìn)血管生成以加速小鼠皮膚創(chuàng)傷愈合[5,9]。干細(xì)胞的研究和發(fā)展為基于細(xì)胞移植和組織再生提供了充足的細(xì)胞來(lái)源,本論文將mESC在10 ng/mL VEGF和5ng/mL bFGF的作用下分化為高表達(dá)CD34和CD133的 “鋪路石樣”內(nèi)皮祖細(xì)胞樣細(xì)胞,并具有一定的遷移和管腔形成能力。然而,植入的外源性EPC在新生血管中的黏附率和滲入率低,血管的成熟和數(shù)目直接影響創(chuàng)傷部位的愈合效率。

VEGF作為皮膚傷口愈合過(guò)程中主要的促血管生成因子,通過(guò)刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的活力、遷移和分化以促進(jìn)新生血管形成和維持血管內(nèi)皮的連續(xù)性和完整性[9,18,25]。VEGF參與傷口愈合的增殖和重塑階段,由骨髓樣細(xì)胞(單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)、內(nèi)皮祖細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌[26]。研究表明,通過(guò)局部使用重組VEGF或病毒載體提高小鼠傷口中VEGF水平,能加速早期的血管生成,增強(qiáng)結(jié)締組織,提高愈合傷口的質(zhì)量[17,27,28]。因此,VEGF被認(rèn)為是促傷口愈合的潛在療法。然而,當(dāng)VEGF介導(dǎo)的新生血管形成不適當(dāng)或不完全時(shí),將引起傷口水腫,從而延遲傷口愈合[29,30]。本研究中發(fā)現(xiàn),VEGF單獨(dú)誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞樣細(xì)胞形成的管腔少且不成熟,說(shuō)明僅用單一生長(zhǎng)因子VEGF不足以形成具有循環(huán)功能的成熟血管結(jié)構(gòu),達(dá)不到預(yù)期治療皮膚創(chuàng)傷的臨床效果。Bruna Eibel等人[31]研究表明,VEGF質(zhì)粒基因治療患者后,EPC的動(dòng)員和TNF-α之間有很強(qiáng)的正相關(guān)性。揭示EPC血管生成與急性炎癥水平相關(guān),促炎因子TNF-α通過(guò)激活VCAM1/VLA4和NF-kB介導(dǎo)的CADM1,以增強(qiáng)EPC和內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附、血管樣結(jié)構(gòu)的遷移和整合[15,16]。同時(shí),間接誘導(dǎo)細(xì)胞分泌VEGF,促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞分化為功能性內(nèi)皮細(xì)胞[32,33]。TNF-α進(jìn)一步調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞,血管內(nèi)皮細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞的活性,以及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)和基質(zhì)金屬蛋白酶的合成,它們與損傷組織的愈合密切相關(guān)[34]。本文驗(yàn)證了mESC-EPC在VEGF和TNF-α雙因子的協(xié)同作用下較好地提高EPC的黏附、遷移和管腔形成能力,彌補(bǔ)單因子作用的局限性。同時(shí),在創(chuàng)面愈合過(guò)程中觀察到VEGF和TNF-α的協(xié)同作用。VEGF有助于愈合早期的血管通透性,募集適當(dāng)數(shù)目的單核/巨噬細(xì)胞、EPC和內(nèi)皮細(xì)胞遷移到創(chuàng)傷處,加速傷口愈合進(jìn)程[35,36]。TNF-α引起的炎癥反應(yīng)驅(qū)動(dòng)旁分泌信號(hào)在祖細(xì)胞歸巢和血管形成中發(fā)揮重要作用,實(shí)現(xiàn)血管生成與炎癥協(xié)同調(diào)控傷口愈合[37,38]。本研究發(fā)現(xiàn),VEGF和TNF-α雙因子協(xié)同能提高EPC的滲入率、遷移和分化,顯著加速小鼠傷口閉合,增加膠原沉積和毛囊,改善血管生成不足的問(wèn)題。通過(guò)免疫組化和Western 印跡檢測(cè)驗(yàn)證在傷口愈合過(guò)程中,血管生成素(ANG1和ANG2)蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào),介導(dǎo)VEGF+CD31+內(nèi)皮細(xì)胞重塑的血管網(wǎng)絡(luò)成熟,從而促進(jìn)傷口愈合。同時(shí),TNF-α在愈合前期加速免疫細(xì)胞在傷口處的浸潤(rùn),創(chuàng)造有利于啟動(dòng)和促進(jìn)新生血管形成的炎癥微環(huán)境[39]。然而,考慮到TNF-α的促炎特性,可能影響血管形成和使組織纖維化,延遲傷口愈合進(jìn)程[40]。在傷口修復(fù)的后期,雙因子協(xié)同EPC治療組的TNF-α蛋白的表達(dá)下調(diào),說(shuō)明TNF-α在整個(gè)研究中嚴(yán)格調(diào)控炎癥反應(yīng)進(jìn)程,適當(dāng)劑量的TNF-α對(duì)傷口愈合的益處是不可忽視的。本文采用的細(xì)胞和雙因子協(xié)同療法兼顧了傷口愈合過(guò)程中復(fù)雜微環(huán)境需要涉及的免疫反應(yīng)、血管生成和細(xì)胞歸巢的“多因素”協(xié)調(diào),為皮膚缺損和組織再生的臨床應(yīng)用提供科學(xué)的理論基礎(chǔ)與新策略。

綜上所述,VEGF和TNF-α能有效改善EPC的生物學(xué)功能,通過(guò)雙因子協(xié)同EPC可促進(jìn)創(chuàng)傷周圍組織的血管重塑,改善炎癥環(huán)境,加速傷口愈合。因此,協(xié)同調(diào)節(jié)炎癥和血管生成可提高傷口愈合率,細(xì)胞和因子協(xié)同療法是促進(jìn)傷口愈合的有效途徑。本研究?jī)H初步探究了雙因子對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能以及協(xié)同EPC治療傷口愈合后期的生物學(xué)效應(yīng),仍需進(jìn)一步探索VEGF和TNF-α協(xié)同促進(jìn)EPC功能的分子機(jī)制,全面分析雙因子協(xié)同EPC對(duì)傷口愈合的各個(gè)階段的生理影響,以及炎癥-血管生成協(xié)同促傷口愈合的分子串?dāng)_機(jī)制,以便為開(kāi)發(fā)臨床級(jí)細(xì)胞與因子療法治療急性/慢性傷口患者提供有力證據(jù)。