葉劍青, 胡雪峰

(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 福建省發(fā)育與神經(jīng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福州 350117)

顱縫是顱骨頂部扁平骨之間的纖維關(guān)節(jié),包括額縫(metopic suture)、冠狀縫(coronal suture)、人字縫(lambdoidal suture)和矢狀縫(sagittal suture)等。顱縫在分娩或咀嚼時(shí)輕微形變來發(fā)揮外力緩沖作用,并在個(gè)體發(fā)育期間充當(dāng)骨骼生長(zhǎng)延伸的區(qū)域[1]。顱縫和顱骨具有雙重起源,即中胚層來源和顱神經(jīng)嵴來源,盡管解剖位置和胚胎起源存在差異,但各個(gè)顱縫具有相似的基本特征,包括骨前沿、顱縫間充質(zhì)、上方骨膜和下方硬腦膜。相鄰的骨前沿由間充質(zhì)組織隔開,間充質(zhì)中含有助于顱骨持續(xù)生長(zhǎng)的骨祖細(xì)胞。隨著大腦和頭部結(jié)構(gòu)的發(fā)育,這些細(xì)胞通過膜內(nèi)成骨在相鄰顱骨前沿內(nèi)增殖分化為成骨細(xì)胞,持續(xù)產(chǎn)生新骨[2](Fig.1)。顱縫發(fā)育的過程涉及多種相互作用的信號(hào)通路,包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor beta,TGF-β)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor,FGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)和視黃酸(retinoic acid,RA)等[3]。遺傳或外界環(huán)境的異常則會(huì)引起這些通路的失調(diào),干擾正常的細(xì)胞增殖和分化,導(dǎo)致顱縫發(fā)育的障礙,例如骨之間的過早融合——顱縫早閉[4]。遺傳方面的異常會(huì)直接影響正常的成骨細(xì)胞分化或者引發(fā)微環(huán)境異常來間接影響。除此之外,機(jī)械力等表觀遺傳因素在顱縫融合中也發(fā)揮重要作用[5]。本文就顱縫微環(huán)境對(duì)顱縫發(fā)育的影響,以及機(jī)械刺激調(diào)控細(xì)胞分化的機(jī)制作歸納和綜述,為將來治療顱縫早閉的相關(guān)藥物研發(fā)提供新思路。

1 顱縫早閉類型

顱縫早閉的發(fā)生可受到遺傳因素、致畸物以及外界環(huán)境因素的影響,使得顱縫早閉表型種類和機(jī)制高度復(fù)雜。絕大多數(shù)顱縫早閉涉及單顱縫融合,少部分涉及多顱縫的融合。已經(jīng)確定了50多個(gè)與顱縫早閉有關(guān)的基因,其中常發(fā)生突變的基因包括FGFR(fibroblast growth factor receptor)家族基因、TWIST1(twist family bHLH transcription factor 1)和EFNB1(ephrin B1)等(Table1),在此本文將重點(diǎn)介紹與FGFR2和TWIST1這兩個(gè)基因突變相關(guān)的顱縫早閉。

Table1 Craniosynostosis associated genes and main clinical features in human

1.1 FGFR2突變相關(guān)的顱縫早閉

與FGFR變異相關(guān)的顱縫早閉綜合征類型最為廣泛,其中又以FGFR2研究最多。FGFR2功能獲得性突變導(dǎo)致受體的配體非依賴性激活,引發(fā)多種顱縫早閉綜合征,例如Crouzon、Apert、Pfeiffer、Antley-Bixler、Jackson-Weiss等[6]。Crouzon和Pfieffer具有相似的分子機(jī)制,Crouzon綜合征表型相對(duì)輕微,主要為雙冠狀縫的早閉,伴有前額扁平、眼球突出和眼距過寬[7, 8];Pfieffer綜合征的顱面特征分為3種類型:Ⅰ型通常伴有中度至重度中面發(fā)育不全,Ⅱ型有三葉草頭骨畸形和明顯的眼球突出,Ⅲ型無三葉草頭骨畸形和眼球突出[8, 9]。這2種綜合征最常見突變點(diǎn)位于Ig-Ⅲ結(jié)構(gòu)域,并且2種綜合征主要由Cys278Phe和Cys342Tyr錯(cuò)義突變引起[6]。Apert綜合征通常由FGFR2的Ig-Ⅱ和Ig-Ⅲ結(jié)構(gòu)域之間保守的接頭區(qū)域的錯(cuò)義突變引起,絕大數(shù)突變集中在Ser252Trp或Pro253Arg,主要表現(xiàn)為雙冠縫早閉和手腳并指畸形[6]。Shin等[10]的研究表明,Fgfr2Ser252Trp/+突變小鼠的成骨細(xì)胞RANKl表達(dá)增加,導(dǎo)致破骨細(xì)胞多度活化可能是這種手指畸形的原因。

顱縫中FGFR2主要在分化的成骨細(xì)胞和骨祖細(xì)胞中表達(dá),FGF/FGFR2通過下游通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)骨祖細(xì)胞增殖、分化和凋亡,Fgfr2功能獲得突變導(dǎo)致FGF/FGFR2信號(hào)活性增強(qiáng),激活一個(gè)或多個(gè)下游信號(hào)通路,ERK1/2是在FGFR2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中介導(dǎo)絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)[11]。最近的研究[12]證明,Fgfr2的突變會(huì)過度激活ERK1/2-MAPK的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),引起骨祖細(xì)胞過早成骨分化,導(dǎo)致顱縫早閉。正常FGFR2的補(bǔ)充可以緩解改善顱縫早閉發(fā)生[13]。

1.2 Saethre-Chotzen綜合征

不同于FGFR2的雜合激活突變,TWIST1的突變導(dǎo)致自身蛋白質(zhì)功能的喪失,特異性導(dǎo)致Saethre-Chotzen綜合征,主要表現(xiàn)為單側(cè)或雙側(cè)冠狀縫的融合以及上瞼下垂、寬鼻梁和寬眼距[23]。轉(zhuǎn)錄因子基因TWIST1或TCF12(transcription factor 12)中的單倍體不足是大多數(shù)Saethre-Chotzen綜合征的原因[6, 24]。近來研究表明,TWIST1基因附近非編碼區(qū)域的變異也會(huì)導(dǎo)致顱縫早閉[25, 26]。在斑馬魚中,TWIST1同源基因Twist1b丟失以及Tcf12的丟失會(huì)引發(fā)顱縫早閉,小鼠中只有Twist1的單倍體功能不足能導(dǎo)致顱縫早閉,Twist1+/-小鼠被認(rèn)為是研究Saethre-Chotzen綜合征的成熟模型[27, 28]。Twist1+/-突變小鼠表現(xiàn)為顱縫中成骨細(xì)胞過早分化導(dǎo)致骨生成增加,不同來源的成骨細(xì)胞的成骨貢獻(xiàn)是不同的,正常情況下神經(jīng)嵴來源成骨細(xì)胞比中胚層來源成骨細(xì)胞具有更強(qiáng)的成骨能力和增殖特性[29]。這種特性在Twist1+/-小鼠中發(fā)生了轉(zhuǎn)變,Quarto等人[30]對(duì)Twist1+/-突變小鼠體外成骨細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn),突變體的頂骨成骨能力增強(qiáng),而額骨的成骨能力受損。另外對(duì)中胚層或者神經(jīng)嵴來源的Twist1基因特異性失活會(huì)導(dǎo)致骨的相對(duì)增長(zhǎng),Wnt1-Cre;Twist1flox/+小鼠中額骨相對(duì)于頂骨過度生長(zhǎng),而在Mesp1-Cre;Twist1flox/+小鼠中,則導(dǎo)致中胚層衍生的頂骨相對(duì)于額骨的過度生長(zhǎng)[28]。

TWIST1通過與其他堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)轉(zhuǎn)錄因子同源或異源二聚化,并與啟動(dòng)子上CANNTG(E-box)保守基序結(jié)合,調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄活動(dòng)[31, 32]。在成骨細(xì)胞分化過程中,TWIST1主要作為轉(zhuǎn)錄抑制因子廣泛抑制骨骼發(fā)育相關(guān)的基因表達(dá)和信號(hào)通路[33-35]。近來研究也確定了最新的調(diào)控靶基因,Quarto等人[30]的研究發(fā)現(xiàn),Twist1+/-小鼠的FGF23表達(dá)下調(diào),并在Fgf23基因啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)E-box結(jié)合基序的存在,表明Fgf23直接受TWIST1調(diào)控。Camp等[36]研究表明,TWIST1直接與C-ROS-1(ROS proto-oncogene 1, receptor tyrosine kinase)基因近端啟動(dòng)子上2個(gè)E-box結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合;他們的另一項(xiàng)研究[37]表明,抑制Saethre-Chotzen患者的顱骨細(xì)胞中C-ROS-1的表達(dá)和活性,能改善體外TWIST1單倍體人顱骨細(xì)胞的成骨異常。

2 顱縫微環(huán)境異常影響顱縫發(fā)育

2.1 成體顱縫間充質(zhì)干細(xì)胞保證顱縫開放

顱縫間充質(zhì)干細(xì)胞是一種異質(zhì)性干細(xì)胞群,屬于間充質(zhì)干細(xì)胞或骨骼干細(xì)胞,具有自我更新和多向分化的能力,對(duì)顱骨的穩(wěn)態(tài)和修復(fù)至關(guān)重要。已經(jīng)表明,在顱縫早閉小鼠的顱縫中植入Gli1+間充質(zhì)干細(xì)胞群能改善顱縫早閉[38]。成體顱縫干細(xì)胞已在小鼠中被各種報(bào)告基因標(biāo)記,例如Gli1+、Axin2+、Prrx1+細(xì)胞以及CD51+;CD200+細(xì)胞,各種被標(biāo)記的干細(xì)胞之間存在密切聯(lián)系,但它們?cè)陲B縫中定位并不完全重疊,體現(xiàn)了這些干細(xì)胞的異質(zhì)性。Axin2+細(xì)胞與Gli1+細(xì)胞空間分布動(dòng)態(tài)重疊:顱骨的Gli1+細(xì)胞廣泛存在于出生時(shí)的整個(gè)骨膜、硬腦膜和顱縫間充質(zhì)中,在隨后的個(gè)體發(fā)育成熟中逐步收斂限制在顱縫中[39];相比于Gli1+細(xì)胞,Axin2+細(xì)胞分化速度較慢,對(duì)骨骼貢獻(xiàn)也相對(duì)較低,Axin2+細(xì)胞在早期被限制在顱縫間充質(zhì)中線處,并隨著個(gè)體發(fā)育逐步擴(kuò)展至骨膜和硬腦膜中[40, 41],兩者呈現(xiàn)出此消彼長(zhǎng)的趨勢(shì)。Twist1+/-小鼠中顱縫Gli1+細(xì)胞數(shù)量明顯下降,無法維持顱縫開放性[39];Twist1+/-小鼠模型中Axin2+細(xì)胞是否減少仍未知,但已知Axin2基因突變會(huì)導(dǎo)致顱縫早閉,并且閉合顱縫中細(xì)胞軸蛋白抑制蛋白2(axis inhibition protein 2,AXIN2)表達(dá)明顯低于顱縫開放處細(xì)胞[42, 43]。Axin2+細(xì)胞中Bmpr1a敲除會(huì)引起干細(xì)胞的過度成骨分化導(dǎo)致顱縫早閉,但Gli1+細(xì)胞中Bmpr1a的敲除卻不會(huì)導(dǎo)致顱縫早閉,這與Gli1+細(xì)胞不與骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體1A(bone morphogenetic protein receptor type 1A,BMPR1A)共定位有一定聯(lián)系[44, 45]。Prrx1+細(xì)胞會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而減少,這被認(rèn)為是由于Prrx1+細(xì)胞中含有大量骨祖細(xì)胞和轉(zhuǎn)運(yùn)放大細(xì)胞。另外,Prrx1+細(xì)胞也表達(dá)AXIN2,并在Wnt激動(dòng)劑的刺激下增加,因此,Prrx1+細(xì)胞可能是Axin2+干細(xì)胞的一個(gè)子集[46]。CD51+;CD200+細(xì)胞同樣被發(fā)現(xiàn)在Twist1+/-小鼠中顯著減少,Twist1+/-小鼠中Axin2基因的失活則可以恢復(fù)CD51+;CD200+細(xì)胞的數(shù)量,并改善顱縫早閉[47]。

2.2 胚胎期骨祖細(xì)胞規(guī)范早期顱縫發(fā)育

胚胎時(shí)期顱縫間充質(zhì)起源于表達(dá)GLI1的細(xì)胞,這些細(xì)胞在胚胎日E7.5 d遷移離開近軸頭中胚層,并在E12.5 d開始向頂部擴(kuò)展至外側(cè)真皮間充質(zhì)層和內(nèi)側(cè)腦膜層之間[48, 49]。各種出生后的干細(xì)胞標(biāo)志物,例如GLI1和配對(duì)相關(guān)同源框 1(paired related homeobox 1,PRRX1)廣泛標(biāo)記胚胎時(shí)期的顱縫,并不適用胚胎期的顱縫間充質(zhì)干細(xì)胞的識(shí)別。最近,對(duì)E15.5和E17.5的小鼠冠狀縫轉(zhuǎn)錄物組研究[50]將Six2+細(xì)胞鑒定為胚胎冠狀縫中的骨祖細(xì)胞,譜系追蹤顯示,它們貢獻(xiàn)了出生后的顱縫間充質(zhì),Six2+細(xì)胞沿著額骨和頂骨的前沿表面從顱縫中心延伸開來呈現(xiàn)出不對(duì)稱的分布,并且發(fā)現(xiàn)由Six2+細(xì)胞分化的兩種分別定位在骨尖和遠(yuǎn)處骨膜的前成骨細(xì)胞,可能分別有助于骨長(zhǎng)度和厚度的增加;在另一項(xiàng)研究中[24]也觀察到,Grem1+骨祖細(xì)胞在冠狀縫中的不對(duì)稱分布——大部分細(xì)胞分布在額骨外表面和頂骨內(nèi)表面,而這種不對(duì)稱性被認(rèn)為可以保證頂骨始終重疊在額骨上方;Holmes等[51]在E16.5和E18.5的額縫中發(fā)現(xiàn)了Npnt+骨祖細(xì)胞,Npnt+骨祖細(xì)胞未呈現(xiàn)出與冠狀縫中的骨祖細(xì)胞類似的不對(duì)稱分布,但在額縫中由前到后逐漸表達(dá)減少。胚胎時(shí)期的骨祖細(xì)胞在顱縫發(fā)育中發(fā)揮儲(chǔ)備以及維持顱縫開放性的作用,突變小鼠的顱縫骨祖細(xì)胞明顯減少且存在過度的成骨分化。在Twist1+/-;Tcf12+/-小鼠中Six2+細(xì)胞和Grem1+細(xì)胞都顯著減少,并且不對(duì)稱結(jié)構(gòu)消失,導(dǎo)致額骨與頂骨的接觸融合[24];另一個(gè)對(duì)E16.5和E18.5小鼠冠狀縫的研究[52]顯示,將Hhip+細(xì)胞確定為冠狀縫獨(dú)有的骨祖細(xì)胞,它們同樣貢獻(xiàn)了出生后的顱縫干細(xì)胞,Hhip-/-小鼠中顱縫間充質(zhì)干細(xì)胞減少并且頂骨與額骨處于同一水平,表明在胚胎發(fā)育后期階段,可能需要Hedgehog相互作用蛋白(hedgehog interacting protein,HHIP)的抑制來防止過早成骨分化。Twist1和Hhip的突變改變了顱縫干細(xì)胞和增殖性成骨細(xì)胞及其直接祖細(xì)胞之間的平衡,成骨細(xì)胞數(shù)量的早期增加將以長(zhǎng)期祖細(xì)胞的損失為代價(jià),從而導(dǎo)致之后的骨骼無法持續(xù)生長(zhǎng)及出生后顱縫干細(xì)胞的減少。鑒于顱縫早閉的胚胎病因?qū)W數(shù)據(jù)越來越多,識(shí)別胚胎時(shí)期顱縫中細(xì)胞種類多樣性有助于理解胚胎時(shí)期祖細(xì)胞功能障礙導(dǎo)致顱縫早閉的深層機(jī)制。

2.3 硬腦膜與顱縫相互影響保證正常發(fā)育

腦膜的發(fā)育與顱骨相同都是雙重起源(神經(jīng)嵴或中胚層來源)。腦膜由3個(gè)不同的層組成:外層的硬腦膜、中間的蛛網(wǎng)膜和內(nèi)部的軟腦膜。硬腦膜是附著在顱骨內(nèi)表面的厚而致密的膠原膜。在發(fā)育末期,硬腦膜的外層在顱骨的內(nèi)表面形成骨膜,使得顱骨和腦膜連續(xù)。早期的研究[53]通過切除硬腦膜證實(shí)了其在顱骨修復(fù)和重新骨化的重要性;最近的研究[38]發(fā)現(xiàn),硬腦膜來源的間充質(zhì)干細(xì)胞在外源植入的Gli1+干細(xì)胞的誘導(dǎo)下有助于顱縫的愈合再生,這進(jìn)一步表明,顱縫與硬腦膜之間的密切交流對(duì)于顱縫發(fā)育和愈合至關(guān)重要。硬腦膜來源的多種信號(hào)通路配體對(duì)顱骨發(fā)育具有指導(dǎo)作用。Kou等人[54]研究的表明,將大鼠人字縫旋轉(zhuǎn)使之位于非顱縫處的硬腦膜上方,導(dǎo)致硬腦膜Twist1表達(dá)下調(diào)并且顱縫提早閉合。Ang等[55]構(gòu)建了Fgfr2基因突變的硬腦膜細(xì)胞并與成骨細(xì)胞共培養(yǎng),明顯提高成骨細(xì)胞增殖水平;Dong等[56]的研究則進(jìn)一步表明,硬腦膜細(xì)胞可能通過Hippo/Yap-PI3K-AKT信號(hào)通路來影響成骨細(xì)胞的增殖和分化。Ferguson等人[57]的研究發(fā)現(xiàn),利用RA處理顱縫可以上調(diào)抗成骨基因的表達(dá)以抑制成骨分化;值得注意的是腦膜中RA在E12.5 d表達(dá),而顱縫間充質(zhì)在E14.5 d表達(dá)RA 降解酶——細(xì)胞色素P450家族成員26B1蛋白(cytochrome P450 family 26 subfamily B member 1,CYP26B1)[53];并且有研究[58]表明,CYP26B1表達(dá)上升導(dǎo)致RA過度分解會(huì)導(dǎo)致小鼠顱縫早閉。以上證據(jù)表明,硬腦膜對(duì)于顱骨早期發(fā)育的指導(dǎo)一部分體現(xiàn)在防止過度的成骨分化。除此之外,有研究[59]顯示,在矢狀縫顱縫早閉患者中發(fā)現(xiàn)了SIX1基因的多種突變,對(duì)SIX1的定位顯示它在硬腦膜中表達(dá);對(duì)腦膜的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄物組分析也顯示硬腦膜中Six1的高表達(dá)[60]。這些都提示,Six基因可能在維持硬腦膜與顱縫之間正常的信號(hào)通路交流中發(fā)揮作用。顱縫早閉的患者通常會(huì)表現(xiàn)出其他癥狀,例如智力障礙、社交問題以及注意力缺陷,并表現(xiàn)出壓抑孤僻的性格。由于顱骨過早融合會(huì)阻礙大腦正常生長(zhǎng),眾多顱縫早閉的患者表現(xiàn)出不同程度的顱內(nèi)壓(intracranial pressure,ICP)升高,即使在手術(shù)治療后也可能存在顱內(nèi)后期壓慢性升高的風(fēng)險(xiǎn),導(dǎo)致認(rèn)知和智力的受損。有證據(jù)表明,他們升高的顱內(nèi)壓與靜脈畸形存在密切聯(lián)系[61]。Twist1基因是Saethre-Chotzen綜合征的關(guān)鍵致病基因,Twist1基因的突變同樣會(huì)導(dǎo)致硬腦膜中靜脈畸形,Tischfield等[62]研究表明,利用Pdgfrb-Cre或Sm22a-Cre條件性敲除顱骨和硬腦膜的Twist1基因足以導(dǎo)致靜脈畸形,來自于顱骨的前成骨細(xì)胞和硬腦膜Twist1基因調(diào)控的旁分泌BMP信號(hào)有助于靜脈血管發(fā)育,表明顱縫也積極的影響著硬腦膜的正常發(fā)育。Ang等[63]研究表明,Sm22a-Cre條件性敲除小鼠由于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C(vascular endothelial growth factor C,VEGFC)表達(dá)下調(diào)以及硬腦膜發(fā)育不全和細(xì)胞外基質(zhì)缺失也會(huì)導(dǎo)致硬腦膜中腦膜淋巴管出現(xiàn)異常,值得注意的是淋巴系統(tǒng)的異常會(huì)影響神經(jīng)系統(tǒng)中無用代謝物的清除,所以顱縫早閉患者認(rèn)知能受損與淋巴系統(tǒng)異常也存在一定聯(lián)系。

2.4 顱縫細(xì)胞響應(yīng)細(xì)胞外基質(zhì)信號(hào)保證顱縫正常發(fā)育

細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境的變化會(huì)影響細(xì)胞功能,例如黏附、遷移、增殖和分化,因此對(duì)這些細(xì)胞外基質(zhì)功能的研究將有助于對(duì)顱縫發(fā)育和顱縫早閉的進(jìn)一步了解。Bala等[64]研究發(fā)現(xiàn),成骨細(xì)胞和終末分化細(xì)胞階段,閉合顱縫的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白表達(dá)也與開放顱縫的存在差異,其中核心蛋白聚糖、光蛋白聚糖和白脂素差異最為顯著。骨膜蛋白也是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,在閉合的顱縫中表達(dá)降低[65];Bai等[66]研究發(fā)現(xiàn),重組骨膜蛋白治療可以抑制冠狀縫細(xì)胞增殖和遷移,改善了Twist1+/-敲除小鼠的冠狀縫早閉表型。牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1(dentin matrix protein 1,DMP1)的蛋白多糖形式(DMP1-PG)在顱縫的骨前沿高度表達(dá),DMP1-PG可通過調(diào)節(jié)骨間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化來防止顱縫過早融合,DMP1糖基化位點(diǎn)突變小鼠則表現(xiàn)出顱縫早閉[67]。骨骼中細(xì)胞外基質(zhì)可以通過與細(xì)胞表面的外基質(zhì)受體結(jié)合來影響細(xì)胞活動(dòng),破壞整合素(integrin)等外基質(zhì)響應(yīng)受體與細(xì)胞外基質(zhì)間正常的相互作用會(huì)導(dǎo)致眾多人類骨骼疾病,包括骨骼發(fā)育不良、軟骨發(fā)育不良、骨關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)疏松癥。已經(jīng)有體外實(shí)驗(yàn)證明光蛋白聚糖在顱骨前成骨細(xì)胞中依賴結(jié)合整合素α2β1下游的ERK信號(hào)刺激細(xì)胞的分化[68];Jiang等[69]研究發(fā)現(xiàn),顱縫中結(jié)蹄組織生長(zhǎng)因子依賴整合素α5介導(dǎo)來促進(jìn)前成骨細(xì)胞往成骨前沿的聚集與成骨分化;Gilbert等[70]在顱縫早閉兔模型中確定了一個(gè)與整合素α3相關(guān)的非編碼突變,對(duì)顱縫早閉患者的數(shù)據(jù)分析也顯示整合素α3基因ITGA3表達(dá)在冠狀縫早閉患者的顯著降低,但需要進(jìn)一步的研究確定其在顱縫發(fā)育的功能;黏著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)可接收來自整合素的信號(hào)以激活下游骨形成相關(guān)信號(hào),有研究發(fā)現(xiàn)FAK在顱縫早閉的大鼠中表達(dá)上升[54]。以上研究皆表明,整合素介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)在顱縫發(fā)育中的重要性。盤基蛋白結(jié)構(gòu)域受體2 (discoidin domain receptor2,DDR2) 是另一種膠原蛋白受體,人類和小鼠DDR2與細(xì)胞外基質(zhì)中膠原蛋白相互作用從而調(diào)控細(xì)胞增殖和分化。Binrayes等[71]研究發(fā)現(xiàn),DDR2功能喪失小鼠顱骨中骨祖細(xì)胞和成骨細(xì)胞增殖分化減少,引發(fā)嚴(yán)重的顱面和骨骼缺陷,過表達(dá)DDR2則會(huì)刺激細(xì)胞的增殖分化;另一項(xiàng)研究[72]則發(fā)現(xiàn),顱骨中DDR2表達(dá)區(qū)域與Gli1+細(xì)胞重疊,Gli1+細(xì)胞依靠DDR2的正常功能開始成骨譜系分化。

3 機(jī)械刺激調(diào)控顱縫發(fā)育

顱縫上的壓力主要來自不斷增長(zhǎng)的大腦。分娩、擠壓和創(chuàng)傷性沖擊等外部刺激以及咀嚼等正常生理過程也會(huì)在顱骨上施加壓力,臨床實(shí)踐已經(jīng)證實(shí)了適當(dāng)?shù)臋C(jī)械力有利于骨愈合和再生[73]。機(jī)械拉伸促進(jìn)顱縫中Gli1+干細(xì)胞成骨分化,進(jìn)而促進(jìn)成骨[40]。機(jī)械刺激激活多種成骨分化信號(hào)通路(Fig.2)。有研究[74]表明,機(jī)械拉伸會(huì)激活胞內(nèi)ROCK-TAZ通路來促進(jìn)Runx2轉(zhuǎn)錄,影響顱縫間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化;Li等[75]研究發(fā)現(xiàn),激活非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路可增強(qiáng)RhoA-ROCK信號(hào)通路介導(dǎo)的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo);機(jī)械拉伸也會(huì)刺激VGLL3的表達(dá)上調(diào),VGLL3與TEAD結(jié)合作用于Runx2促進(jìn)轉(zhuǎn)錄[76]。機(jī)械刺激還會(huì)影響其他細(xì)胞的活動(dòng),成纖維細(xì)胞在機(jī)械拉伸作用下被激活,可促進(jìn)顱縫中血管生成[77];機(jī)械刺激使得大量巨噬細(xì)胞聚集在縫合血管周圍,隨后促進(jìn)顱縫間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[78]。

Fig.2 Regulation of cranial suture cells by mechanical forces (A) Internal expansion from brain growth and external mechanical force is transmitted to cells in the cranial suture mesenchyma, which affects skull development.(B) Hh binds to Patch1 receptor and activates Hh signal to promote transcription of related genes. Integrins and DDR2 sense mechanical signals from the extracellular matrix and activate downstream signals to promote transcription. PC1 and PC2 are located in the primary cilia and act synergistically, sensing external mechanical stimuli and activating downstream signals to promote transcription. Piezo1 senses the external mechanical stimulus, which causes the inflow of Ca2+, activating a downstream signaling pathway that promotes transcription

3.1 細(xì)胞外基質(zhì)介導(dǎo)的機(jī)械調(diào)控

近來的單細(xì)胞數(shù)據(jù)表明,顱縫間充質(zhì)是一種機(jī)械反應(yīng)性結(jié)締組織,并在冠狀縫上方識(shí)別出一種富含與韌帶形成、細(xì)胞收縮和機(jī)械感覺相關(guān)基因表達(dá)的韌帶層,該層與成骨細(xì)胞之間有著強(qiáng)烈的配體-受體相互作用[50, 51]。細(xì)胞外基質(zhì)在結(jié)締組織中最為豐富,并能夠響應(yīng)外界的機(jī)械刺激來改變自身的硬度。然而,目前許多有關(guān)細(xì)胞外基質(zhì)機(jī)械傳導(dǎo)的研究廣泛集中在軀干骨上而非顱骨上。Barreto等[79]研究表明,細(xì)胞外基質(zhì)硬度的增加可以提高細(xì)胞成骨譜系分化和骨形成,來自閉合處的顱縫細(xì)胞比開放處的顱縫細(xì)胞具有更高的硬度敏感性,表明細(xì)胞外基質(zhì)的硬度與顱縫早閉有著密切聯(lián)系。顱骨中的機(jī)械刺激傳導(dǎo)與整合素也有著密切關(guān)聯(lián)。Jin等[80]的體外研究表明,流體剪切力可以提高顱骨中成骨細(xì)胞表面整合素的表達(dá)量。細(xì)胞在響應(yīng)機(jī)械刺激后也會(huì)反過來改造細(xì)胞外基質(zhì)的機(jī)械和結(jié)構(gòu)特性,機(jī)械刺激允許細(xì)胞通過表達(dá)生長(zhǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)分泌物改變其微環(huán)境。Jiang等[69]研究發(fā)現(xiàn),顱縫中結(jié)蹄組織生長(zhǎng)因子在機(jī)械力作用下高表達(dá);Takeshita等[81]研究同樣發(fā)現(xiàn),機(jī)械環(huán)境下顱縫中結(jié)蹄組織生長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的高表達(dá);Li等[77]研究發(fā)現(xiàn),顱縫中成纖維細(xì)胞在機(jī)械應(yīng)變下表達(dá)了許多細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因。

3.2 初級(jí)纖毛介導(dǎo)的機(jī)械調(diào)控

初級(jí)纖毛(primary cilia)是一種存在于大多數(shù)細(xì)胞表面類似天線的細(xì)胞器,參與細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)、感受環(huán)境機(jī)械刺激。前成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞頂端表面突出的初級(jí)纖毛能夠通過特定的受體和機(jī)械敏感通道感知骨誘導(dǎo)刺激并轉(zhuǎn)導(dǎo)它們以激活細(xì)胞內(nèi)成骨級(jí)聯(lián)反應(yīng)[82, 83]。纖毛內(nèi)的結(jié)構(gòu)變異會(huì)導(dǎo)致顱面畸形,比如Bardet-Biedl綜合征(Bardet-Biedl syndrome,BBS)主要由編碼BBS蛋白質(zhì)復(fù)合體BBSome的基因突變引發(fā)。從非綜合征顱縫早閉患者中分離出的間充質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出BBS9的表達(dá)失調(diào),導(dǎo)致纖毛無法正確感知和響應(yīng)來自周圍環(huán)境的機(jī)械刺激[84];Fuz蛋白參與鞭毛內(nèi)運(yùn)輸過程,Fuz的突變會(huì)干擾Hh通路的正常傳導(dǎo),引發(fā)顱縫早閉等表型[85];對(duì)顱縫早閉中鑒定的基因的研究也將91個(gè)基因中的18個(gè)映射到纖毛功能中[86]。因此,纖毛功能障礙似乎與顱縫病變密切相關(guān),特別是顱縫早閉。多囊蛋白(polycystin,PC)是一種定位于初級(jí)纖毛的跨膜蛋白家族,由PC1和PC2組成,可感知機(jī)械信號(hào)并轉(zhuǎn)化為胞質(zhì)內(nèi)生化信號(hào),激活多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[87]。PC1和PC2在小鼠成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞表達(dá),PC1缺陷小鼠在外力刺激下骨生成受限[88, 89]。有研究[90-92]表明,機(jī)械負(fù)荷通過增強(qiáng)PC1-JAK2-STAT3、PC1-CaN-NFAT以及PC1-AKT-β-Catenin信號(hào)軸,促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和骨形成。最近,對(duì)人顱縫早閉細(xì)胞的體外研究[93]中發(fā)現(xiàn),被抑制的PC1還可激活PI3K-AKT-mTOR2通路來抑制顱縫細(xì)胞增殖和遷移;另外一項(xiàng)研究[94]則發(fā)現(xiàn),對(duì)PC1激活則增強(qiáng)了ERK信號(hào)來提高RUNX2基因表達(dá)促進(jìn)成骨分化。

3.3 Piezo1機(jī)械敏感蛋白介導(dǎo)的機(jī)械調(diào)控

Piezo1是一個(gè)精密的機(jī)械敏感陽離子通道,能被各種形式的機(jī)械刺激激活,有助于細(xì)胞對(duì)周圍組織的觸摸、壓力或拉伸做出反應(yīng)[95]。激活狀態(tài)下的Piezo1介導(dǎo)Ca2+流入胞質(zhì)以啟動(dòng)下游Ca2+信號(hào)傳導(dǎo),Ca2+內(nèi)流可導(dǎo)致CaMKII磷酸化并激活CREB,促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。Sun等[96]研究發(fā)現(xiàn),Piezo1有助于成骨細(xì)胞對(duì)顯微鏡探針戳的機(jī)械刺激做出反應(yīng),特異性敲除成骨細(xì)胞中Piezo1的小鼠(OC-Cre;Piezo1f/f)表現(xiàn)出顱骨閉合不完全,發(fā)育遲緩。此外,敲除小鼠的成骨細(xì)胞中CaMKII和CREB的磷酸化明顯降低,參與成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RUNX2和ATF4在敲除小鼠成骨細(xì)胞中被下調(diào)。目前,在小鼠四肢的研究[97]中發(fā)現(xiàn),Piezo1/2依賴于NFAT-YAP1-?-catenin信號(hào)通路傳遞介導(dǎo)骨形成所必需的機(jī)械信號(hào),由于Piezo1敲除小鼠具有顱骨缺陷,推測(cè)在小鼠顱骨中可能存在相同的機(jī)制來介導(dǎo)骨形成,并且通過抑制Piezo1機(jī)械感知可能有助于改善顱縫早閉。

4 問題與展望

顱縫早閉發(fā)生可被多種內(nèi)外因素誘導(dǎo),因此顱縫早閉分為多種類型。絕大多數(shù)顱縫早閉患者的共性表現(xiàn)為顱縫處骨生成增加,過度的成骨細(xì)胞分化導(dǎo)致顱縫間充質(zhì)干細(xì)胞儲(chǔ)備的下降被認(rèn)為是主要原因。一方面,內(nèi)在遺傳因素直接影響干細(xì)胞規(guī)范和分化,另一方面,來自硬腦膜和細(xì)胞外基質(zhì)的信號(hào)失衡也可間接影響細(xì)胞活動(dòng),進(jìn)一步加重顱縫微環(huán)境的紊亂。規(guī)范顱縫發(fā)育的重要因素不止如此,最近的研究[98]表明,顱骨中的神經(jīng)系統(tǒng)也積極影響著顱縫發(fā)育。因此,探究其他組織對(duì)顱縫的潛在影響有助于將來更全面的認(rèn)識(shí)顱縫微環(huán)境中的相互聯(lián)系。

顱縫已被證明是一個(gè)典型的模型來研究細(xì)胞外力如何與細(xì)胞骨架或內(nèi)在力相作用。機(jī)械信號(hào)由細(xì)胞外基質(zhì)傳遞,并由細(xì)胞膜上特殊蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)感知,轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)化學(xué)信號(hào),引發(fā)細(xì)胞反應(yīng)?；诟杉?xì)胞的治療已被證明有助于顱縫的通暢,阻斷成骨傾向的藥物治療效果顯著以及經(jīng)縫牽引成骨技術(shù)也被用于顱縫早閉的矯正,盡管研究和技術(shù)進(jìn)步改善了顱縫早閉的臨床治療,但這種疾病的治療仍具有挑戰(zhàn)性。鑒于顱縫早閉的病因復(fù)雜,需要進(jìn)行更多的研究來闡明這一重要關(guān)系。