李江珂, 董恩恒, 張豐泉, 張俊強(qiáng), 伍 源

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院新鄉(xiāng)市大氣污染健康效應(yīng)與干預(yù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 新鄉(xiāng) 453003)

細(xì)顆粒物(fine particulate matter,PM2.5)是指空氣動(dòng)力學(xué)直徑不超過(guò)2.5 μm的微小顆粒物[1]。與較大的顆粒物相比,PM2.5粒徑小,活性強(qiáng),容易富集各種微生物和有害化學(xué)物質(zhì),這些特性能使PM2.5經(jīng)呼吸道透過(guò)肺泡并進(jìn)入血液,對(duì)人體健康產(chǎn)生不良影響[2]。有研究報(bào)道,孕前和妊娠早期PM2.5暴露被認(rèn)為是胎兒生長(zhǎng)的敏感時(shí)期[3]。此外,母體暴露在空氣污染物中也逐漸成為不良妊娠結(jié)局的一個(gè)關(guān)鍵因素[4]。近年來(lái),已有大量的流行病學(xué)調(diào)查證實(shí),孕產(chǎn)婦暴露于PM2.5可能導(dǎo)致妊娠并發(fā)癥和不良妊娠結(jié)局的風(fēng)險(xiǎn)增加,包括先兆子癇(preeclampsia,PE)[5,6]和低出生體重(low birth weight,LBW)[7]等。

顆粒物暴露可以引起機(jī)體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)等自由基的增加,同時(shí)抑制生物體內(nèi)抗氧化劑的產(chǎn)生,從而誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)。氧化和抗氧化之間的平衡在維持生物體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面有著至關(guān)重要的作用。由于機(jī)體對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的易感性,機(jī)體在面對(duì)外來(lái)物質(zhì)入侵時(shí)已經(jīng)形成了一套有效的抗氧化系統(tǒng),包括總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)、超氧化物歧化酶(super oxide dismutase,SOD)在內(nèi)的其它抗氧化劑。這些抗氧化物質(zhì)會(huì)以不同的方式阻止自由基對(duì)生物分子的有害攻擊,維持組織細(xì)胞功能的完整性[8]。富馬酸二甲酯(dimethyl fumarate,DMF)是一種非阿片類的口服藥物,常用于治療神經(jīng)性炎癥和線粒體功能障礙[9]。DMF目前已廣泛用于治療多發(fā)性硬化癥等相關(guān)疾病[10],且在神經(jīng)炎癥和毒性氧化應(yīng)激的臨床前模型中表現(xiàn)出良好的效果[11]。研究表明,DMF能夠激活核因子E2相關(guān)因子(NF-E2 related factor 2,Nrf2)信號(hào)通路[12],這是一個(gè)重要的機(jī)體防御系統(tǒng)。Nrf2是編碼許多抗氧化基因和解毒酶的主要調(diào)節(jié)者,可調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)[13]。當(dāng)機(jī)體受到外源性物質(zhì)脅迫時(shí),Nrf2會(huì)遷移到細(xì)胞核,與抗氧化反應(yīng)原件(antioxidant response element,ARE)啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合,來(lái)調(diào)控血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)、SOD等下游基因的表達(dá),以對(duì)抗ROS,從而保護(hù)正常細(xì)胞免受細(xì)胞毒效應(yīng)的影響[14]。在氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)中,Nrf2發(fā)揮著重要的作用。盡管目前有很多關(guān)于生殖方面的研究,但大多集中在流行病學(xué)和妊娠結(jié)局方面。胎盤作為胚胎發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵器官,對(duì)其進(jìn)行研究可以揭示出PM2.5對(duì)胎鼠健康的潛在風(fēng)險(xiǎn),這有助于更深入地了解PM2.5對(duì)大鼠生殖系統(tǒng)的影響。因此,本文研究選用不同劑量的PM2.5,探究孕前PM2.5暴露對(duì)大鼠胎盤損傷及可能的機(jī)制,并評(píng)估DMF對(duì)孕前PM2.5暴露生殖損傷的抑制效果,從而對(duì)PM2.5誘導(dǎo)的生殖毒性的預(yù)防與干預(yù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

40只6周齡的SPF級(jí)雌性SD大鼠,體重為160～200 g,14只6周齡的SPF級(jí)雄性SD大鼠,體重為240 g～340 g,均購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2021-0011;動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(京)2022-0052]。所有實(shí)驗(yàn)大鼠都在室內(nèi)溫度22～24 ℃,標(biāo)準(zhǔn)飲水、進(jìn)食及明暗交替的SPF級(jí)屏障環(huán)境中飼養(yǎng)。本研究已獲得新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(XYLL-20210521)。

1.2 主要試劑與儀器

DMF購(gòu)于美國(guó)MCE生物科技公司(HY-17363);SOD、丙二醛(malondialehyde,MDA)試劑盒購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司(BC0175,BC0025);BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司(PC0020);T-AOC試劑盒購(gòu)于武漢伊萊瑞特生物科技公司(E-BC-K136-M);白細(xì)胞介素-6(interleukin 6,IL-6)和白細(xì)胞介素-10(interleukin,IL-10)試劑盒購(gòu)于武漢伊萊瑞特生物科技公司(E-EL-R0015c,E-EL-R0016c);Nrf2、HO-1、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體購(gòu)于江蘇親科生物有限公司(AF0639,AF5393,AF7018)。大流量粉塵采樣器(Tisch Environmental美國(guó));真空冷凍干燥機(jī)(2-4LD Plus,德國(guó)Marin Christ公司);電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS,美國(guó)Thermo公司);酶標(biāo)儀(Enspire,美國(guó)PerkinElmer公司);凝膠成像系統(tǒng)(Fluor Chem R,美國(guó)Protein Simple)。

1.3 PM2.5的檢測(cè)

使用聚四氟乙烯濾膜采集2022年4月17日至2022年9月17日新鄉(xiāng)市的PM2.5樣本。本文通過(guò)ICP-MS對(duì)染毒所用的PM2.5進(jìn)行了金屬成分分析。取1 mg的PM2.5粉末,加入3 mL HNO3和2 mL H2O2進(jìn)行混勻。使用微波消解儀充分消解。消解完成進(jìn)行趕酸,用超純水稀釋趕酸液,采用ICP-MS分析PM2.5中的各金屬元素含量。

1.4 動(dòng)物分組及染毒方法

采用隨機(jī)數(shù)字法將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為對(duì)照組(生理鹽水,Cont)、低劑量PM2.5組(1.5 mg/kg bw PM2.5,L-Exp)、高劑量PM2.5組(7.5 mg/kg bw PM2.5, H-Exp)、DMF對(duì)照組(生理鹽水+50 mg/kg bw DMF,DMF Cont)和DMF干預(yù)組(7.5 mg/kg bw PM2.5+50 mg/kg bw DMF,H-Exp+DMF)。將收集的PM2.5用生理鹽水配置成不同濃度的混懸液,采用吸入式氣管滴注法進(jìn)行大鼠PM2.5染毒。具體實(shí)驗(yàn)操作方法可見課題組前期研究?jī)?nèi)容[15]。30 min時(shí),對(duì)照組、低劑量PM2.5組和高劑量PM2.5組大鼠灌胃生理鹽水,DMF對(duì)照組與DMF干預(yù)組大鼠灌胃DMF。染毒結(jié)束時(shí),將大鼠放回鼠籠,自由飲水和進(jìn)食,每2 d染毒1次,共持續(xù)染毒40 d。之后,將雄雌大鼠按照1∶2的比例進(jìn)行合籠。當(dāng)妊娠第19 d時(shí),將雌鼠麻醉并解剖,通過(guò)心血管采血法收集血液,同時(shí)立即收集胎盤組織樣本。

1.5 胎盤病理組織觀察

將取出的新鮮胎盤組織用PBS充分漂洗,固定樣本,包埋后制作(5～6 μm)的石蠟切片,H&E染色,觀察大鼠胎盤組織病理學(xué)變化。

1.6 胎盤組織超氧化物歧化酶、丙二醛、總抗氧化能力含量測(cè)定

取0.1 g新鮮胎盤組織,按1∶5～10的比例加入提取液,冰上剪碎組織,用高速低溫組織研磨儀制備組織勻漿液,8 000×g/4 ℃離心10 min,取組織上清液,置冰上待測(cè)。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明,采用微量法檢測(cè)SOD活性及MDA含量,分別在560 nm、532 nm及600 nm波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀測(cè)量吸光度。取0.1 g新鮮胎盤組織,按1∶5比例加入(0.5 mL)PBS,勻漿離心后,取組織上清液待測(cè)。采用比色法試劑盒檢測(cè)T-AOC含量,于520 nm波長(zhǎng)處測(cè)量測(cè)定孔和對(duì)照孔的吸光度。

1.7 胎盤組織IL-6、IL-10含量測(cè)定

取0.1 g新鮮胎盤組織,按1∶5的比例加入PBS,冰上剪碎組織,將胎盤組織用高速低溫組織研磨儀制備成組織勻漿液。8 000×g/4 ℃離心15 min,取組織上清液,置冰上待測(cè)。嚴(yán)格按照試劑盒的說(shuō)明,采用雙抗體夾心法檢測(cè)IL-6和IL-10的含量,酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)酶標(biāo)板中的標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔吸光度,在雙對(duì)數(shù)坐標(biāo)軸上分別繪制出IL-6和IL-10的四參數(shù)邏輯函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算樣品中IL-6和IL-10的濃度。

1.8 胎盤組織核因子E2相關(guān)因子、血紅素加氧酶-1的蛋白質(zhì)水平測(cè)定

取40 mg新鮮胎盤組織,按1∶10的比例加入400 μL RIPA裂解液和4.0 μL的PMSF,冰上剪碎組織,將胎盤組織用高速低溫組織研磨儀制備成組織勻漿液,70Hz研磨3～5 min,置冰上30 min,12 000 r/min,4 ℃離心15 min,取組織上清液,分裝保存,用BCA法定量總蛋白質(zhì)濃度。制備濃度為8%的分離膠和5%的濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,按照30 μg蛋白質(zhì)樣品準(zhǔn)確上樣,轉(zhuǎn)膜,封閉,加入一抗Nrf2(1∶2 000)、HO-1(1∶1 000)、β-肌動(dòng)蛋白(1∶3 000),80 r/min室溫?fù)u2 h。洗膜后加入二抗(1∶4 000),80 r/min室溫?fù)u1 h。洗膜后,ECL發(fā)光,多功能成像系統(tǒng)成像,用ImageJ軟件進(jìn)行灰度比值分析。以β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參蛋白質(zhì),比較Nrf2、HO-1蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 新鄉(xiāng)地區(qū)細(xì)顆粒物中鋁、鎂、鈣、鐵、鋅5種元素質(zhì)量濃度最高

PM2.5對(duì)機(jī)體健康的影響受到多種因素作用,與其組分濃度密不可分。ICP-MS結(jié)果顯示:新鄉(xiāng)地區(qū)夏秋季PM2.5中的鋁(aluminum,Al)、鎂(magnesium, Mg)、鈣(calcium, Ca)、鐵(iron,Fe)、鋅(zinc, Zn)等這5種元素的質(zhì)量濃度最高,分別為32.94834、14.59629、7.415467、3.89415、3.52989 μg/mg (Table 1)。

Table 1 Analysis of the metal composition in PM2.5

2.2 富馬酸二甲酯對(duì)大鼠的胚胎發(fā)育具有保護(hù)作用

研究結(jié)果與對(duì)照組相比,高劑量PM2.5組的胎鼠數(shù)量降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與高劑量PM2.5組相比,DMF干預(yù)組的胎鼠數(shù)量明顯增多,是高劑量PM2.5組的1.16倍(P<0.05)。胚胎體長(zhǎng)是很多研究常用的指標(biāo),可作為胚胎發(fā)育狀況的參考指標(biāo)。與對(duì)照組相比,低劑量PM2.5組(P<0.05)和高劑量PM2.5組(P<0.01)的胎鼠平均體長(zhǎng)都有不同程度的降低;與高劑量PM2.5組相比,DMF干預(yù)組的胎鼠平均體長(zhǎng)明顯增高,為高劑量PM2.5組的1.10倍(P<0.001)。上述結(jié)果表明,PM2.5可以通過(guò)胎盤屏障導(dǎo)致胚胎毒性的發(fā)生,DMF能抑制由PM2.5帶來(lái)的胚胎毒性,對(duì)胚胎發(fā)育具有保護(hù)作用(Fig.1)。

Fig.1 The effect of PM2.5 exposure in different doses and DMF intervention in fetal rats (A) Analysis of the number of fetal rats among different groups. (B) ImageJ software analysis of the average body length of fetal rats among groups. Data were presented as mean ± SD (n = 8).**P<0.01,*P<0.05 vs Control group; ###P<0.001,#P<0.05 vs H-Exp group

2.3 富馬酸二甲酯減輕PM2.5暴露對(duì)胎盤組織的病理?yè)p傷

由病理結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,低劑量PM2.5組和高劑量PM2.5組胎盤的迷路區(qū)血細(xì)胞有不同程度的減少,給予DMF干預(yù)后,與高劑量PM2.5組相比,DMF干預(yù)組胎盤迷路區(qū)的血細(xì)胞增多。且與對(duì)照組和DMF干預(yù)組相比,高劑量PM2.5組的血管脈徑不清晰,結(jié)果表明,PM2.5暴露可導(dǎo)致胎盤組織結(jié)構(gòu)發(fā)生病理改變,而DMF可以改善因PM2.5暴露導(dǎo)致的胎盤病理?yè)p傷(Fig.2)。

Fig.2 Effects of PM2.5 exposure and DMF intervention on placental pathology Pathological changes in placental tissues were detected using the H&E staining method. (A) The impact on blood cells is indicated by the black arrow, which indicated blood cells. (B) The impact on the vascular vein. The blue arrow indicates the vascular vein. Scale bar, 20 μm or 40 μm as described in figures

2.4 富馬酸二甲酯減輕PM2.5暴露誘導(dǎo)的胎盤氧化應(yīng)激反應(yīng)

由氧化應(yīng)激結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,高劑量PM2.5組的MDA含量顯著增高(16.5 ± 2.85,P<0.05)。與對(duì)照組相比,高劑量PM2.5組SOD活性(41.34±8.36)和T-AOC含量(0.75 ± 0.17)明顯降低(P<0.05),經(jīng)DMF處理后,DMF干預(yù)組的T-AOC顯著高于高劑量PM2.5組(1.32 ± 0.38,P<0.01)。結(jié)果表明,PM2.5暴露可以導(dǎo)致機(jī)體抗氧化能力降低,通過(guò)DMF進(jìn)行干預(yù)能有效的提高機(jī)體的抗氧化能力(Fig.3)。

Fig.3 Indicators related to placental oxidative stress (A) SOD activity in placental tissues was detected by the microassay. (B) The content of MDA in placental tissues was detected by the micromethod. (C) T-AOC was detected by colorimetry. Data were presented as mean ± SD (n = 6).**P<0.01,*P<0.05 vs Control group;##P<0.01,#P<0.05 vs H-Exp group

2.5 PM2.5暴露能導(dǎo)致機(jī)體抗炎水平降低

由炎癥因子檢測(cè)的結(jié)果顯示,PM2.5暴露后,與對(duì)照組相比,不同劑量組的IL-6含量隨著PM2.5濃度的增加而增加,呈現(xiàn)劑量效應(yīng)的趨勢(shì),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組相比,低劑量PM2.5組IL-10含量(2 714.74 ± 501.28)、高劑量PM2.5組的IL-10含量(2 657.66 ± 279.64)都明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與高劑量PM2.5組相比,DMF干預(yù)組的IL-10水平增高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這表明PM2.5暴露能導(dǎo)致機(jī)體抗炎能力下降,但DMF的干預(yù)在提高機(jī)體的抗炎能力方面并未表現(xiàn)出顯著的效果(Fig.4)。

2.6 富馬酸二甲酯增高Nrf2/HO-1信號(hào)通路的胎盤蛋白質(zhì)表達(dá)水平

為了研究Nrf2/HO-1信號(hào)通路在PM2.5誘導(dǎo)的胎盤氧化應(yīng)激中的作用,本文用Western印跡法檢測(cè)了Nrf2和HO-1蛋白質(zhì)的表達(dá)量。結(jié)果顯示,低劑量PM2.5組Nrf2(0.99 ± 0.17)和高劑量PM2.5組Nrf2(0.86 ± 0.11)、低劑量PM2.5組HO-1(0.95 ± 0.16)和高劑量PM2.5組HO-1(0.85 ± 0.06)的蛋白質(zhì)水平都明顯低于對(duì)照組(P<0.01);與高劑量PM2.5組相比,DMF干預(yù)組的Nrf2(1.06 ± 0.10)、HO-1(1.04 ± 0.17)蛋白質(zhì)的表達(dá)量都明顯增高(P<0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明,PM2.5暴露能使Nrf2、HO-1蛋白質(zhì)的含量降低,而DMF干預(yù)組的Nrf2、HO-1蛋白質(zhì)的含量增高,提示DMF可能通過(guò)Nrf2/HO-1信號(hào)通路提高機(jī)體抗氧化酶的蛋白質(zhì)水平(Fig.5)。

Fig.5 Indicators related to placental protein expression The expression levels of Nrf2 and HO-1 in placental tissues were detected by Western blotting. Data were presented as the mean ± SD of three independent experiments (n=6).**P<0.01,*P<0.05 vs Control group;##P<0.01,#P<0.05 vs H-Exp group

3 討論

空氣污染是一個(gè)重大的全球公共衛(wèi)生問(wèn)題,由環(huán)境污染物引起的健康問(wèn)題不容小覷。目前越來(lái)越多的數(shù)據(jù)表明,孕期接觸環(huán)境空氣污染與早產(chǎn)、LBW等一系列不良妊娠結(jié)局密切相關(guān)[16,17]。一項(xiàng)新的研究[18]甚至發(fā)現(xiàn),孕婦產(chǎn)前PM2.5暴露每增加1 μg/m3,胎兒死亡的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加8%。盡管與空氣污染有關(guān)的不良妊娠結(jié)局的機(jī)制尚未完全闡明,但有研究提示胎盤是受空氣污染直接影響的主要器官[19]。一項(xiàng)針對(duì)健康孕婦的研究發(fā)現(xiàn),產(chǎn)前PM2.5暴露與胎盤整體DNA甲基化呈正相關(guān)[20]。此外,血液中的環(huán)境污染物也可能直接穿過(guò)胎盤屏障,引發(fā)缺氧或免疫介導(dǎo)的損傷,最終導(dǎo)致胎兒死亡[21]。在一項(xiàng)對(duì)PM2.5金屬成分和死產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)之間關(guān)系的評(píng)估中,研究觀察到鋅的含量與死產(chǎn)密切相關(guān)[22]。隨后,本文采用ICP-MS分析新鄉(xiāng)地區(qū)PM2.5的金屬成分,發(fā)現(xiàn)PM2.5中不同金屬元素質(zhì)量濃度差異較大,其Al、Mg、Ca、Fe、Zn含量較高,Al和Fe是地殼中含量代表性元素,而Zn元素是由車輛輪胎磨損產(chǎn)生[23]。這表明揚(yáng)塵風(fēng)沙可能是構(gòu)成新鄉(xiāng)細(xì)顆粒物的主要貢獻(xiàn)者。

研究證實(shí),氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和DNA損傷等是PM2.5導(dǎo)致機(jī)體損害的主要機(jī)制[24]。通常情況下,機(jī)體內(nèi)的氧化和抗氧化水平是保持動(dòng)態(tài)平衡的,但當(dāng)受到外來(lái)物質(zhì)入侵時(shí),機(jī)體內(nèi)自由基水平會(huì)顯著升高,導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)。通過(guò)檢測(cè)MDA水平和SOD活性來(lái)評(píng)估PM2.5誘導(dǎo)的氧化損傷和抗氧化能力是一個(gè)重要的手段[25]。本研究發(fā)現(xiàn),高劑量PM2.5組SOD活性與對(duì)照組相比明顯降低,高劑量PM2.5組的MDA與對(duì)照組相比,含量顯著增高,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。T-AOC是反映機(jī)體的總抗氧化能力,本文所測(cè)T-AOC指標(biāo)結(jié)果顯示,高劑量PM2.5組的抗氧化能力減弱,而DMF干預(yù)組的總抗氧化能力與高劑量PM2.5組相比顯著增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,高濃度PM2.5的暴露會(huì)引起大鼠胎盤組織發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),通過(guò)DMF給藥可以逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象,使機(jī)體的抗氧化能力增高。研究表明,短期給予DMF能顯著抑制巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[26]。根據(jù)本文的研究結(jié)果,促炎因子IL-6的水平隨著PM2.5暴露濃度的增加呈劑量效應(yīng)性增高的趨勢(shì),然而并未顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL-10是反映機(jī)體抗炎能力的指標(biāo),與對(duì)照組相比,低劑量PM2.5組、高劑量PM2.5組顯著降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這與文獻(xiàn)中研究結(jié)果一致[27]。與高劑量PM2.5組相比,DMF干預(yù)組IL-10含量有增高的趨勢(shì)。這表明機(jī)體的抗炎能力受到PM2.5的暴露而減弱,然而,就提升機(jī)體的抗炎機(jī)能而言,DMF的效果并不明顯。

Nrf2是堿性亮氨酸拉鏈(basic leucine zipper,bZip)轉(zhuǎn)錄因子的家族成員[28],它在抗氧化防御、氧化信號(hào)傳導(dǎo)、代謝、細(xì)胞增殖等方面發(fā)揮重要作用。在生理?xiàng)l件下,自噬、壞死和細(xì)胞程序性死亡均受抗氧化系統(tǒng)的調(diào)節(jié),而抗氧化系統(tǒng)則受到Nrf2/HO-1的調(diào)節(jié),但這種保護(hù)作用主要發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中[29]。當(dāng)機(jī)體組織中Keap1表達(dá)缺失或降低,會(huì)導(dǎo)致Nrf2泛素化-蛋白酶體降解失衡,從而增加細(xì)胞內(nèi)Nrf2蛋白的含量,將Nrf2移位到細(xì)胞核,進(jìn)而激活其下游HO-1的表達(dá)[30]。HO-1是血紅素加氧酶的一個(gè)亞型,參與了游離鐵誘導(dǎo)的血紅素分解為膽紅素。作為ARE調(diào)控的主要抗氧化劑基因,HO-1及其代謝產(chǎn)物具有抗氧化、抗炎和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能,并在人體各種器官中廣泛表達(dá)[14]。盡管有許多研究對(duì)DMF作為Nrf2激活劑的作用和有效性進(jìn)行了廣泛探討,但只有少數(shù)數(shù)據(jù)評(píng)估了DMF的作用[31]。Sun等人[32]發(fā)現(xiàn),口服DMF可減輕神經(jīng)炎癥,并提高Nrf2和抗氧化酶(例如SOD、HO-1)的水平。但因其在生殖系統(tǒng)較少涉及,通過(guò)查閱文獻(xiàn)我們發(fā)現(xiàn),目前,仍未見因DMF導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局的相關(guān)研究[33]。由此本文假設(shè),DMF給藥可以緩解胎盤氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。通過(guò)Western 印跡檢測(cè),本文測(cè)定了Nrf2及其下游因子HO-1的蛋白質(zhì)含量。本文結(jié)果顯示,低劑量PM2.5組和高劑量PM2.5組的Nrf2、HO-1明顯低于對(duì)照組,與高劑量PM2.5組相比,DMF干預(yù)組Nrf2、HO-1蛋白質(zhì)含量增多,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本文觀察到DMF逆轉(zhuǎn)了PM2.5誘導(dǎo)的Nrf2的下調(diào)。根據(jù)Fan[34]等人報(bào)告,PM2.5暴露后Nrf2蛋白量減少,而其他研究則表明,Nrf2含量被PM2.5上調(diào)[35]。這些相互矛盾的發(fā)現(xiàn)可以用以下原因解釋,當(dāng)PM2.5誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)隨著時(shí)間的推移而逐漸發(fā)展且代償能力不足時(shí),Nrf2蛋白的含量及表達(dá)可能會(huì)降低。在本文的研究中發(fā)現(xiàn),PM2.5暴露導(dǎo)致Nrf2蛋白的含量減少,同時(shí)抑制了參與細(xì)胞防御系統(tǒng)的抗氧化因子HO-1的表達(dá),DMF的干預(yù)增高了Nrf2和HO-1在大鼠胎盤的表達(dá)水平。

本文研究發(fā)現(xiàn),環(huán)境中PM2.5的暴露可導(dǎo)致胎鼠數(shù)量減少、胎鼠平均體長(zhǎng)較短,胎盤結(jié)構(gòu)發(fā)生改變等。這表明PM2.5的暴露可能對(duì)機(jī)體產(chǎn)生一定程度的胚胎毒性,而DMF的給予明顯的緩解了這種胚胎毒性。研究結(jié)果顯示,孕前PM2.5暴露能夠引起胎盤組織氧化損傷及抗炎因子水平的降低,而DMF的干預(yù)能夠明顯的減輕因PM2.5暴露對(duì)大鼠胎盤造成的氧化損傷,提高機(jī)體的抗氧化能力。這些數(shù)據(jù)表明,通過(guò)改善Nrf2及其下游因子HO-1的蛋白質(zhì)水平,DMF可能保護(hù)組織細(xì)胞免受PM2.5誘導(dǎo)的氧化損傷。因此,我們推測(cè),Nrf2/HO-1信號(hào)通路可能參與了DMF對(duì)PM2.5誘發(fā)的生殖毒性的抗氧化保護(hù)作用。