王 偉,馮志娟,呂夢(mèng)嬌,張婭玲,侯佳威,李寶林

(陜西師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,陜西 西安 710119)

近年來(lái),隨著對(duì)腫瘤細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑研究的不斷深入,以酪氨酸激酶為靶點(diǎn)的治療成為癌癥治療效果較好的方法之一[1]。喹唑啉類化合物,如已上市的抗腫瘤藥物拉帕替尼(Lapatinib,圖1a)[2-3]、吉非替尼(Gefitinib,圖1b)[4-5]和埃羅替尼(Erlotinib,圖1c)[6]等,是活性較高、選擇性較好的一類小分子酪氨酸激酶抑制劑。其中,拉帕替尼是首個(gè)可口服的雙靶點(diǎn)小分子酪氨酸激酶抑制劑,它可以同時(shí)作用于表皮生長(zhǎng)因子受體EGFR和HER-2,抑制其活性,阻止表皮生長(zhǎng)因子受體過(guò)度表達(dá),抑制癌細(xì)胞增殖[7]。然而,上述抗腫瘤藥物在使用一段時(shí)間后會(huì)產(chǎn)生耐藥性,同時(shí)也具有一定的毒副作用,易引發(fā)腹瀉、惡心、嘔吐、皮疹及肝損傷等癥狀。

圖1 部分抗腫瘤化合物的結(jié)構(gòu)式

靛紅,又名1-氫-吲哚-2,3-二酮,是人體組織中一種內(nèi)源性雜環(huán)分子[8],也是海洋生物維持生存所必需的一種天然活性物質(zhì),具有多種藥理活性[9-10]。目前,對(duì)靛紅的研究包括1-位N原子上的取代、2-位和3-位羰基碳修飾以及苯環(huán)修飾,其中修飾3-位羰基碳所得化合物的抗腫瘤活性最高,如3-芳基亞甲基靛紅衍生物[11]、靛紅-3-腙衍生物[12]、靛紅-3-亞胺金屬配合物[13]和C3-靛紅螺環(huán)衍生物[14-15]等。研究表明,靛紅類化合物可作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體VEGFR-2、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體FGFR-1等,通過(guò)抑制其過(guò)度表達(dá)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[16]。已上市的含靛紅結(jié)構(gòu)單元的抗腫瘤藥物如舒尼替尼(Sunitinib,圖1d)[17-18]、托西尼布磷酸鹽(Toceranib phosphate)[18]可用于治療腎癌、胃腸道腫瘤等疾病,說(shuō)明靛紅衍生物在抗腫瘤方面具有藥用價(jià)值。

部分靶向藥物服用一段時(shí)間后會(huì)產(chǎn)生耐藥性,而將2個(gè)或2個(gè)以上具有不同藥效或互補(bǔ)藥效的生物片段進(jìn)行雜合,其協(xié)同作用能夠增強(qiáng)癌癥治療效果[19]。鑒于上述喹唑啉類化合物和靛紅衍生物在抗腫瘤方面的良好效果,本研究擬采用藥效基團(tuán)雜合的方式[20],在課題組前期工作的基礎(chǔ)上[21],以拉帕替尼的藥效基團(tuán)喹唑啉環(huán)為母核,4-位分別連接不同的芳氨基結(jié)構(gòu)單元,6-位連接呋喃甲醛基結(jié)構(gòu)單元,并進(jìn)一步在醛基上連接靛紅腙結(jié)構(gòu)單元?；谝陨显O(shè)計(jì)思路,進(jìn)行結(jié)構(gòu)新穎的N-取代靛紅雜合喹唑啉類化合物的合成,并對(duì)所合成化合物進(jìn)行初步的抗腫瘤活性研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

核磁共振儀,Bruker Avance 600 MHz,四甲基硅烷作為內(nèi)標(biāo);紅外光譜儀,Bruker Fensor 27;高分辨質(zhì)譜儀,Bruker Esquire 3000plus;顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀,X-6,北京泰克儀器有限公司。

所用試劑均為市售分析純。所用受試細(xì)胞株人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480、人皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞A431、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H1975和A549均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

本研究共合成9個(gè)結(jié)構(gòu)新穎的N-取代靛紅雜合喹唑啉類化合物(8a～8i),其合成路線如圖2所示。

A:CH3COOH,130 ℃,20 min;B:5% Pd/C,乙二醇二甲醚,MeOH,Et3N,50 ℃,3 h;C:CHCl3,H2O,K2CO3,40 ℃,4 h;D:CH3OH,65 ℃,30 min;E:C2H5OH,N,N-二甲基甲酰胺,CH3COOH,79 ℃,6 h。

1.2.1 化合物3a～3c的合成

稱取N′-(2-氰基-4-碘苯基)-N,N-二甲基甲脒(2.99 g,10.0 mmol)和芳胺化合物2a～2c(11 mmol)于圓底燒瓶中,加入5 mL冰乙酸溶解,130 ℃反應(yīng)20 min,冷卻至室溫。減壓旋蒸除去冰乙酸,向體系中加入20 mL蒸餾水,并用濃氨水調(diào)節(jié)pH值為9～10,室溫下攪拌30 min。抽濾,水洗濾餅,所得濾餅經(jīng)硅膠柱色譜分離(洗脫劑中V乙酸乙酯∶V石油醚=1∶6),得到白色固體即為化合物3a～3c。

4-(3-乙炔基苯氨基)-6-碘喹唑啉(3a)[7],白色固體3.05 g,收率為83%。

4-(3-氯-4-氟苯氨基)-6-碘喹唑啉(3b)[7],白色固體3.48 g,收率為88%。

4-[3-氯-4-(3-氟芐氧基)苯氨基]-6-碘喹唑啉(3c)[7],白色固體4.55 g,收率為91%。

1.2.2 化合物4a～4c的合成

稱取化合物3a～3c(6 mmol)、5-甲?；秽?2-硼酸(1.12 g,8.0 mmol)、5% Pd/C (0.56 g)于圓底燒瓶中,加入40 mL乙二醇二甲醚和20 mL甲醇,并加入三乙胺(2.42 g,24 mmol),50 ℃反應(yīng)3 h。趁熱抽濾,濾餅用四氫呋喃洗滌,將濾液減壓旋蒸除去溶劑,所得濃縮物經(jīng)硅膠柱色譜分離(洗脫劑中V乙酸乙酯∶V氯仿=1∶15),得到橘黃色固體即為化合物4a～4c。

4-(3-乙炔基苯氨基)-6-(5-甲?；秽?2-基)喹唑啉(4a)[7],橘黃色固體1.44 g,收率為71%。

4-(3-氯-4-氟苯氨基)-6-(5-甲?；秽?2-基)喹唑啉(4b)[7],橘黃色固體1.85 g,收率為85%。

4-[3-氯-4-(3-氟芐氧基)苯氨基]-6-(5-甲?；秽?2-基)喹唑啉(4c)[22],橘黃色固體2.44 g,收率為86%。

1.2.3 化合物6a～6c的合成

稱取化合物5a～5c(10 mmol)、碳酸鉀(5.53 g,40 mmol)于圓底燒瓶中,加入10 mL氯仿;稱取N,N-二乙氨基氯乙烷鹽酸鹽(3.44 g,20 mmol)于另一個(gè)圓底燒瓶中,加入9 mL水。將N,N-二乙氨基氯乙烷鹽酸鹽水溶液加入裝有化合物5a～5c的圓底燒瓶中,室溫劇烈攪拌10 h。反應(yīng)完全后,用氯仿(30 mL)萃取2次,有機(jī)相合并,并用無(wú)水硫酸鎂干燥,減壓旋蒸除去溶劑,所得濃縮物經(jīng)硅膠柱色譜分離(洗脫劑中V甲醇∶V乙酸乙酯=1∶80),得到紅色油狀液體即為化合物6a～6c。

1-(2-二乙氨基乙基)-1-氫-吲哚-2,3-二酮(6a),紅色油狀液體1.55 g,收率為63%。

1-(2-二乙氨基乙基)-5-氟-1-氫-吲哚-2,3-二酮(6b),紅色油狀液體1.79 g,收率為68%。

1-(2-二乙氨基乙基)-5-氯-1-氫-吲哚-2,3-二酮(6c),紅色油狀液體2.34 g,收率為83%。

1.2.4 化合物7a～7c的合成

稱取化合物6a～6c (5 mmol)于圓底燒瓶中,加入15 mL甲醇和6.5 mL水合肼(80%),65 ℃回流30 min。待反應(yīng)液冷卻后,減壓旋蒸除去溶劑,所得濃縮物經(jīng)硅膠柱色譜分離(洗脫劑中V甲醇∶V乙酸乙酯=1∶80),得到亮黃色油狀液體即為化合物7a～7c。

(Z)-1-(2-二乙氨基乙基)-3-腙吲哚啉-2-酮(7a),亮黃色油狀液體1.06 g,收率為82%。

(Z)-1-(2-二乙氨基乙基)-5-氟-3-腙吲哚啉-2-酮(7b),亮黃色油狀液體1.12 g,收率為80%。

(Z)-1-(2-二乙氨基乙基)-5-氯-3-腙吲哚啉-2-酮(7c),亮黃色油狀液體1.11 g,收率為76%。

1.2.5 化合物8a～8i的合成

稱取化合物4a～4c(0.3 mmol)、化合物7a～7c(0.3 mmol)于圓底燒瓶中,加入7 mL無(wú)水乙醇和0.1 mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解后,再加入0.3 mL冰乙酸,79 ℃回流6 h。冷卻至室溫,減壓旋蒸除去溶劑,所得濃縮物在甲醇-四氫呋喃(THF)混合物中重結(jié)晶,得到紅色固體即為化合物8a～8i。

(Z)-1-(2-(二乙氨基乙基))-3-(((E)-(5-(4-(3-乙炔苯氨基)喹唑啉-6-基)呋喃-2-基)亞甲基)亞肼基)吲哚啉-2-酮(8a),紅色固體0.136 g,收率為78%。熔點(diǎn):242.0～244.4 ℃; HRMS:C35H32N7O2,[M+H]+:582.261 4(計(jì)算值582.261 7);1H NMR (600 MHz,DMSO-d6) δ:10.16 (s,1H),9.05 (s,1H),8.74 (s,1H),8.69 (s,1H),8.48 (d,J=6.4 Hz,1H),8.36 (d,J=8.2 Hz,1H),8.09 (s,1H),8.03 (d,J=7.7 Hz,1H),7.93 (d,J=8.9 Hz,1H),7.66～7.65 (m,1H),7.54～7.49 (m,2H),7.47 (t,J=7.7 Hz,1H),7.29 (d,J=7.3 Hz,1H),7.25 (d,J=7.3 Hz,1H),7.22～7.17 (m,1H),4.26 (s,1H),4.12 (brs,2H),3.49 (brs,2H),3.24 (brs,4H),1.19 (brs,6H);13C NMR (151 MHz,DMSO-d6)δ:164.1,157.7,157.0,155.0,152.3,151.0,150.0,149.2,146.0,144.4,139.4,133.5,129.6,129.3,129.0,126.9,126.7,124.9,123.3,123.1,122.6,121.9,119.2,116.7,115.5,110.6,109.5,83.4,80.7,48.6,46.4,34.8,8.7; IRνmax(KBr) cm-1:3 448,2 929,1 714,1 608,1 533,1 384,1 161,842,746,590。

(Z)-1-(2-(二乙氨基乙基))-3-(((E)-(5-(4-(3-乙炔苯氨基)喹唑啉-6-基)呋喃-2-基)亞甲基)亞肼基)-5-氟吲哚啉-2-酮(8b),紅色固體0.134 g,收率為75%。熔點(diǎn):253.5～256.2 ℃; HRMS:C35H31FN7O2,[M+H]+:600.252 1 (計(jì)算值600.252 3);1H NMR(600 MHz,DMSO-d6) δ:10.11(s,1H),9.08(s,1H),8.77(s,1H),8.67(s,1H),8.32(d,J=8.6 Hz,1H),8.24(dd,J=8.0、2.0 Hz,1H),8.08 (s,1H),7.96(d,J=8.0 Hz,1H),7.90(d,J=8.6 Hz,1H),7.68(d,J=3.5 Hz,1H),7.50 (d,J=3.5 Hz,1H),7.45 (t,J=7.9 Hz,1H),7.41 (td,J=8.7、2.7 Hz,1H),7.29～7.28 (m,2H),4.21 (s,1H),4.14 (brs,2H),3.41 (brs,2H),3.29～3.22 (m,4H),1.22 (t,J=6.7 Hz,6H);13C NMR (151 MHz,DMSO-d6) δ:164.0,159.0,157.8,157.4,157.3,154.1 (d,1JC-F=270 Hz),150.8,149.9,149.1,140.6,139.2,129.1,128.9,128.7,127.1,126.7,125.2,123.7,123.0,121.8,119.6(d,2JC-F=23.4 Hz),119.4,117.3 (d,3JC-F=8.9 Hz),116.4 (d,2JC-F=26.1 Hz),115.5,110.8,110.7 (d,3JC-F=8.2 Hz),83.4,80.6,47.8,46.4,34.7,8.3; IRνmax(KBr) cm-1:3 490,2 974,1 716,1 573,1 533,1 384,1 164,1 028,847,574。

(Z)-1-(2-(二乙氨基乙基))-3-(((E)-(5-(4-(3-乙炔苯氨基)喹唑啉-6-基)呋喃-2-基)亞甲基)亞肼基)-5-氯吲哚啉-2-酮(8c),紅色固體0.141 g,收率為76%。熔點(diǎn):278.7～281.0 ℃;HRMS:C35H31ClN7O2,[M+H]+:616.221 8(計(jì)算值:616.222 8);1H NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ:10.13 (s,1H),9.09 (s,1H),8.80 (s,1H),8.67 (s,1H),8.55 (brs,1H),8.37 (d,J=8.6 Hz,1H),8.03 (s,1H),7.91 (d,J=8.2 Hz,2H),7.65 (d,J=3.1 Hz,1H),7.61 (d,J=7.9 Hz,1H),7.50 (d,J=3.1 Hz,1H),7.45 (t,J=8.0 Hz,1H),7.31～7.27 (m,2H),4.23 (s,1H),4.14 (brs,2H),3.40 (brs,2H),3.26 (brs,4H),1.21～1.20 (m,6H);13C NMR (151 MHz,DMSO-d6)δ:163.7,157.8,157.2,155.0,153.2,150.8,148.9,142.9,139.1,132.6,129.0,128.9,128.6,127.1,126.6,125.4,124.3,123.1,121.8,119.6,118.0,115.4,111.2,111.1,110.7,83.3,80.7,47.8,46.4,34.6,8.4; IRνmax(KBr) cm-1:3 490,2 974,1 716,1 573,1 533,1 384,1 164,1 028,847,574。

(Z)-1-(2-(二乙氨基乙基))-3-(((E)-(5-(4-(3-氯-4-氟苯氨基)喹唑啉-6-基)呋喃-2-基)亞甲基)亞肼基)吲哚啉-2-酮(8d),紅色固體0.153 g,收率為83%。熔點(diǎn):231.5～234.1 ℃; HRMS:C33H30ClFN7O2,[M+H]+:610.213 0(計(jì)算值:610.213 4);1H NMR (600 MHz,DMSO-d6) δ:10.21 (s,1H),9.01 (s,1H),8.74 (s,1H),8.68 (s,1H),8.47 (d,J=7.4 Hz,1H),8.36 (d,J=8.4 Hz,1H),8.20 (d,J=4.8 Hz,1H),7.93 (d,J=7.8 Hz,2H),7.65 (d,J=3.2 Hz,1H),7.55～7.47 (m,3H),7.27 (d,J=7.8 Hz,1H),7.19 (t,J=7.5 Hz,1H),4.15 (brs,2H),3.42 (brs,2H),3.29 (brs,4H),1.22 (t,J=6.8 Hz,6H);13C NMR (151 MHz,DMSO-d6)δ:164.1,157.7,156.9,154.9,154.3,152.7,152.2,150.0 (d,1JC-F=263 Hz),149.8,144.3,136.3 (d,4JC-F=1.8 Hz),133.5,129.6,129.4,128.9,126.8 (d,3JC-F=8.8 Hz),123.7,123.3,123.0,122.5 (d,3JC-F=6.8 Hz),119.1,118.9 (d,2JC-F=18.4 Hz ),116.7,116.6(d,2JC-F=21.4 Hz),115.4,110.7,109.6,47.9,46.4,34.5,8.3; IRνmax(KBr) cm-1:3 456,2 925,1 716,1 608,1 496,1 191,1 031,810,752,549。

(Z)-1-(2-(二乙氨基乙基))-3-(((E)-(5-(4-(3-氯-4-氟苯氨基)喹唑啉-6-基)呋喃-2-基)亞甲基)亞肼基)-5-氟吲哚啉-2-酮(8e),紅色固體0.152 g,收率為81%。熔點(diǎn):249.6～252.1 ℃; HRMS:C33H29ClFN7O2,[M+H]+:628.203 6 (計(jì)算值:628.203 9);1H NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ:10.12 (s,1H),8.98 (s,1H),8.74 (s,1H),8.64 (s,1H),8.27 (d,J=7.5 Hz,1H),8.23 (dd,J=8.2、2.4 Hz,1H),8.19 (d,J=4.8 Hz,1H),7.90 (d,J=7.8 Hz,1H),7.85 (d,J=8.6 Hz,1H),7.65 (d,J=3.6 Hz,1H),7.47～7.44 (m,2H),7.40 (td,J=9.0、2.7 Hz,1H),7.28 (dd,J=8.5、4.0 Hz,1H),4.13 (t,J=5.3 Hz,2H),3.47 (brs,2H),3.30 (brs,4H),1.23 (t,J=7.1 Hz,6H);13C NMR (151 MHz,DMSO-d6)δ:164.0,158.3 (d,1JC-F=215.4 Hz),157.4,157.2,154.8,153.5 (d,1JC-F=242.2 Hz),153.3,150.9 (d,4JC-F=2.2 Hz),149.8,149.0,140.5,136.2 (d,4JC-F=2.0 Hz),129.0,128.7,126.7,123.8 (d,3JC-F=7.3 Hz),123.7,122.5 (d,3JC-F=6.8 Hz),119.6 (d,2JC-F=23.4 Hz),119.2,118.8 (d,2JC-F=18.1 Hz),117.3 (d,3JC-F=9.2 Hz),116.5 (d,2JC-F=21.5 Hz),116.4,115.3,110.8,110.6 (d,3JC-F=7.4 Hz),48.6,46.4,34.6,8.4; IRνmax(KBr) cm-1:3 431,2 979,1 720,1 614,1 498,1 166,1 029,891,810,547。

(Z)-1-(2-(二乙氨基乙基))-3-(((E)-(5-(4-(3-氯-4-氟苯氨基)喹唑啉-6-基)呋喃-2-基)亞甲基)亞肼基)-5-氯吲哚啉-2-酮(8f),紅色固體0.152 g,收率為79%。熔點(diǎn):251.6～252.7 ℃; HRMS:C33H29Cl2FN7O2,[M+H]+:644.173 1 (計(jì)算值:644.174 4);1H NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ:10.05 (s,1H),8.95 (s,1H),8.73 (s,1H),8.61 (s,1H),8.47 (m,1H),8.27 (d,J=8.7 Hz,1H),8.13 (d,J=4.5 Hz,1H),7.84～7.80 (m,2H),7.59 (d,J=3.6 Hz,1H),7.57 (dd,J=8.5、1.8 Hz,1H),7.46 (t,J=9.0 Hz,1H),7.42 (d,J=3.6 Hz,1H),7.27 (d,J=8.4 Hz,1H),4.10 (brs,2H),3.49 (brs,2H),3.27 (brs,4H),1.21 (t,J=6.9 Hz,6H);13C NMR (151 MHz,DMSO-d6)δ:163.8,157.6,157.1,154.9,154.3,153.3,152.7,149.8 (d,1JC-F=278.3 Hz),148.9,142.8,136.1,132.5,129.0,128.9,128.6,127.1,126.6,124.2,124.0,122.8 (d,3JC-F=6.7 Hz),119.4,118.8(d,2JC-F=18.1 Hz),117.9,116.5(d,2JC-F=21.6 Hz),115.3,111.1,110.6,47.8,46.4,34.7,8.8; IRνmax(KBr) cm-1:3 525,2 935,1 722,1 608,1 496,1 365,1 031,804,630,547。

(Z)-1-(2-(二乙氨基乙基))-3-(((E)-(5-(4-(3-氯-4-(3-氟芐氧基)苯氨基)喹唑啉-6-基)呋喃-2-基)亞甲基)亞肼基)吲哚啉-2-酮(8g),紅色固體0.139 g,收率為65%。熔點(diǎn):174.5～176.9 ℃; HRMS:C40H36ClFN7O3,[M+H]+:716.255 6 (計(jì)算值:716.255 2);1H NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ:10.23 (s,1H),9.26 (s,1H),9.06 (s,1H),8.74 (s,1H),8.65 (s,1H),8.47 (d,J=7.2 Hz,1H),8.36 (d,J=8.6 Hz,1H),8.04 (s,1H),7.93 (d,J=8.7 Hz,1H),7.83 (d,J=8.8 Hz,1H),7.65 (d,J=2.8 Hz,1H),7.54～7.45 (m,3H),7.35～7.31(m,3H),7.28 (d,J=7.8 Hz,1H),7.19 (t,J=7.0 Hz,2H),5.29 (s,2H),4.16 (brs,2H),3.41 (d,J=4.3 Hz,2H),3.27～3.26(m,4H),1.22 (t,J=6.8 Hz,6H);13C NMR (151 MHz,DMSO-d6)δ:163.8,162.2 (d,1JC-F=243.1 Hz),157.6,157.0,155.0,152.0,151.0,149.9,149.7,149.1,144.7,139.6 (d,3JC-F=7.6 Hz),133.4,133.1,130.5 (d,3JC-F=9.1 Hz),129.6,129.0,128.7,126.6,124.4,123.9,123.3 (d,4JC-F=1.5 Hz),123.1,122.7,122.1,121.1,119.1,116.5,115.4,114.6 (d,2JC-F=21.1 Hz),114.3,114.0 (d,2JC-F=22.6 Hz),110.5,109.8,109.5,69.4,48.4,46.5,35.9,9.9; IRνmax(KBr) cm-1:3 654,2 968,1 714,1 604,1 382,1 267,1 024,794,750,513。

(Z)-1-(2-(二乙氨基乙基))-3-(((E)-(5-(4-(3-氯-4-(3-氟芐氧基)苯氨基)喹唑啉-6-基)呋喃-2-基)亞甲基)亞肼基)-5-氟吲哚啉-2-酮(8h),紅色固體0.141 g,收率為64%。熔點(diǎn):196.7～197.3 ℃; HRMS:C40H35ClF2N7O3,[M+H]+:734.246 4 (計(jì)算值:734.245 8);1H NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ:10.00 (s,1H),8.98 (s,1H),8.72 (s,1H),8.60 (s,1H),8.25 (d,J=8.8 Hz,1H),8.18 (d,J=6.4 Hz,1H),8.03 (s,1H),7.83 (d,J=8.6 Hz,1H),7.79 (d,J=8.7 Hz,1H),7.63 (d,J=2.0 Hz,1H),7.52～7.46 (m,1H),7.44 (d,J=2.6 Hz,1H),7.37～7.32 (m,3H),7.28 (d,J=9.0 Hz,1H),7.22～7.17 (m,2H),5.27 (s,2H),3.95 (brs,2H),2.99 (brs,4H),1.06 (brs,6H);13C NMR (151 MHz,DMSO-d6)δ:163.7,162.2 (d,1JC-F=244.6 Hz),158.8 (d,1JC-F=238.6 Hz),157.6,157.2 (d,3JC-F=6.0 Hz),155.1,153.0,150.9 (d,4JC-F=3.0 Hz),149.9,149.8,149.0,145.8,141.0,139.6 (d,3JC-F=7.5 Hz),132.9,130.5 (d,3JC-F=7.5 Hz),128.8,128.7,126.5,124.4,124.1,123.5,123.3 (d,4JC-F=3.0 Hz),122.6,122.3,121.0,119.5 (d,2JC-F=24.2 Hz),119.2,116.4 (d,2JC-F=25.7 Hz),115.3,114.7 (d,2JC-F=21.1 Hz),114.2,114.0 (d,2JC-F=21.1 Hz),110.6 (d,3JC-F=9.1 Hz),69.4,48.4,46.5,36.0,10.0; IRνmax(KBr) cm-1:3 332,2 636,1 710,1 617,1 498,1 417,1 269,1 028,810,518。

(Z)-1-(2-(二乙氨基乙基))-3-(((E)-(5-(4-(3-氯-4-(3-氟芐氧基)苯氨基)喹唑啉-6-基)呋喃-2-基)亞甲基)亞肼基)-5-氯吲哚啉-2-酮(8i),紅色固體0.138 g,收率為61%。熔點(diǎn):199.3～200.9 ℃; HRMS:C40H35Cl2FN7O3,[M+H]+:750.216 6 (計(jì)算值:750.216 2);1H NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ:10.16 (s,1H),9.03 (s,1H),8.77 (d,J=4.6 Hz,1H),8.62 (s,1H),8.52 (d,J=5.4 Hz,1H),8.33 (t,J=7.7 Hz,1H),7.97 (s,1H),7.85 (t,J=8.3 Hz,1H),7.73 (d,J=8.3 Hz,1H),7.68～7.56 (m,2H),7.52～7.42 (m,2H),7.33 (dd,J=27.2、8.6 Hz,4H),7.20 (t,J=8.3 Hz,1H),5.28 (s,2H),4.13 (brs,2H),3.40 (brs,2H),3.28 (brs,4H),1.22 (t,J=7.0 Hz,6H);13C NMR (151 MHz,DMSO-d6)δ:163.8,162.2 (d,1JC-F=244.6 Hz),157.9,157.1,154.8,153.2,150.7,150.1,148.9,142.9,139.6 (d,3JC-F=7.5 Hz),132.6,130.5 (d,3JC-F=7.5 Hz),129.0,127.9,127.1,126.7,125.9,124.6,124.3,123.3 (d,4JC-F=3 Hz),122.8,122.6,121.1,119.5,118.0,115.2,114.7 (d,2JC-F=21.1 Hz),114.3,114.0 (d,2JC-F=21.1 Hz),111.5,111.2,110.7,69.4,47.8,46.4,34.6,8.3; IRνmax(KBr) cm-1:3 422,2 640,1 714,1 598,1 382,1 261,1 026,981,798,513。

1.2.6 抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)

利用MTT法測(cè)定化合物8a～8i對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制活性。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)狀態(tài)良好的人腫瘤細(xì)胞SW480、A431、NCI-H1975和A549,用0.25%的胰酶消化液消化細(xì)胞,離心收集,重懸計(jì)數(shù)后,制備成細(xì)胞懸液,并調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為2×104～5×104個(gè)/mL。隨后將細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(100 μL/孔),并將其置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用培養(yǎng)基將受試化合物稀釋至相應(yīng)濃度,并將其加入上述已接種人腫瘤細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(100 μL/孔),調(diào)整二甲基亞砜(DMSO)的最終體積分?jǐn)?shù)為0.5%,隨后將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。72 h后,在培養(yǎng)板中加入噻唑藍(lán)溴化四唑(MTT,20 μL/孔),混勻后,繼續(xù)在培養(yǎng)箱中反應(yīng)。4 h后取出培養(yǎng)板,棄去孔內(nèi)上清液,加入DMSO(150 μL/孔),將培養(yǎng)板置于搖床上震蕩10 min。待充分溶解甲臜后,用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處的吸光度,同時(shí)以630 nm處的吸光度作為參比,計(jì)算腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。

腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率= 1—[(DS-DNC)/

(DPC-DNC)]× 100%。

(1)

其中:DS為樣品孔的吸光度(細(xì)胞+待測(cè)化合物+MTT);DNC為調(diào)零孔的吸光度(培養(yǎng)基DMSO+MTT);DPC為對(duì)照孔的吸光度(細(xì)胞+DMSO+MTT)。

受試化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制曲線采用Graphpad Prism 5軟件擬合,得到IC50值,每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與討論

本研究所述的9個(gè)N-取代靛紅雜合喹唑啉類化合物8a～8i的合成路線如圖2所示。先是由化合物N′-(2-氰基-4-碘苯基)-N,N-二甲基甲脒分別與3種不同的芳胺類化合物2a～2c進(jìn)行Dimroth重排反應(yīng)生成3種喹唑啉類化合物3a～3c;所得3a～3c在鈀碳的催化下分別與5-甲?；秽?2-硼酸進(jìn)行Suzuki偶聯(lián)生成化合物4a～4c。同時(shí),分別通過(guò)3種靛紅衍生物5a～5c與N,N-二乙氨基氯乙烷鹽酸鹽之間的親核取代反應(yīng)得到靛紅1-位接入親水基團(tuán)的衍生物6a～6c;而化合物6a～6c與水合肼之間加成消去得到化合物7a～7c。最后,4a～4c分子中的醛基分別與7a～7c分子中的氨基通過(guò)先加成再消去反應(yīng)生成目標(biāo)產(chǎn)物8a～8i。

2.1 化合物6a～6c的合成

化合物6a～6c的制備參考文獻(xiàn)[23-24]的方法,以5-取代靛紅和N,N-二乙氨基氯乙烷鹽酸鹽為原料通過(guò)親核取代反應(yīng)合成。分別對(duì)堿的種類、反應(yīng)溶劑、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果列于表1。結(jié)果表明:1)由實(shí)驗(yàn)1、2可知,當(dāng)其他條件一定,V氯仿∶V水=1∶1.8時(shí),改變反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)率的影響較小。2)由實(shí)驗(yàn)3、4可知,當(dāng)其他條件一定,V氯仿∶V水=1∶0.9時(shí),室溫反應(yīng)10 h,產(chǎn)率明顯提高。3)由實(shí)驗(yàn)4、5可知,以NaH作堿、DMF作反應(yīng)溶劑,后處理中會(huì)有大部分產(chǎn)物溶在DMF中,產(chǎn)率較低;而以K2CO3作堿、氯仿-水作溶劑,后處理用氯仿萃取,產(chǎn)率較高。

2.2 目標(biāo)化合物8a～8i的合成及結(jié)構(gòu)確定

目標(biāo)化合物8a～8i參考文獻(xiàn)[25]的方法,以4-芳氨基-6-(5-甲?；秽?2-基)喹唑啉和(Z)-1-(二乙氨基乙基)-3-腙-5-取代吲哚啉-2-酮為原料,通過(guò)先親核加成再消去反應(yīng)得到。選擇冰乙酸作為催化劑而不用鹽酸等強(qiáng)酸,是由于酸給出的氫離子不僅能夠和羰基結(jié)合,增加羰基的親電性,也能與氨基結(jié)合,使氨基喪失親核能力。冰乙酸為弱酸,其在使羰基親電性增加的同時(shí),能夠避免胺類化合物過(guò)度質(zhì)子化。選擇無(wú)水乙醇和DMF作為反應(yīng)溶劑,后處理只需要旋蒸除去溶劑,用甲醇-四氫呋喃重結(jié)晶即可得到目標(biāo)化合物。該方法操作簡(jiǎn)單,處理方便。

圖3 化合物8b的1H NMR譜

2.3 抗腫瘤活性

以上市的抗腫瘤藥物拉帕替尼(Lapatinib)和吉非替尼(Gefitinib)為陽(yáng)性對(duì)照,以SW480、A431、NCI-H1975和A549為受試細(xì)胞,用MTT法對(duì)合成的目標(biāo)化合物8a～8i進(jìn)行抗腫瘤活性測(cè)試,結(jié)果如表2所示。化合物8a、8b、8e、8g、8h對(duì)A431增殖具有明顯抑制作用,化合物8a、8b、8c、8d、8e、8g對(duì)A549和NCI-H1975增殖具有明顯抑制作用,化合物8a、8b、8c、8d、8e、8f、8g對(duì)SW480增殖具有明顯抑制作用。綜上所述,化合物8a、8b、8e、8g對(duì)4種受試細(xì)胞均表現(xiàn)出良好的增殖抑制作用,優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照拉帕替尼和吉非替尼。此外,當(dāng)喹唑啉4-位引入3-乙炔基苯氨基時(shí),抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性較好;引入3-氯-4-氟苯氨基和3-氯-4-(3-氟芐氧基)苯氨基時(shí),抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性次之。靛紅5-位無(wú)取代基或被F取代時(shí),抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性較好;被Cl取代時(shí),抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性較差。

表2 目標(biāo)化合物對(duì)4種受試腫瘤細(xì)胞的體外抑制活性(IC50)

根據(jù)合成化合物的結(jié)構(gòu)及其抗腫瘤活性測(cè)試結(jié)果,分析出可能存在的構(gòu)效關(guān)系:在喹唑啉4-位引入芳氨基能夠增強(qiáng)化合物對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體HER-2的親和力,抑制表皮生長(zhǎng)因子受體過(guò)度表達(dá);且由于與酪氨酸激酶結(jié)合的ATP疏水性口袋空間比較大,即使在喹唑啉4-位引入如芳氨基這樣較大的基團(tuán),也能夠通過(guò)旋轉(zhuǎn)的方式深入親脂性口袋與激酶結(jié)合。此外,4-芳氨基C3、C4位的取代基與激酶表面非常相近,在4-芳氨基C3、C4位上引入—F、—Cl、—C≡CH這樣的小基團(tuán)可能更有利于化合物與激酶結(jié)合[26]。在靛紅1-位引入親水基團(tuán)N,N-二乙氨基乙基可以調(diào)節(jié)化合物的水溶性,且通過(guò)與前期實(shí)驗(yàn)室抗腫瘤活性數(shù)據(jù)[21]的比較,證明引入親水基團(tuán)可以提高化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制活性。綜上所述,喹唑啉母核上引入的芳氨基、靛紅結(jié)構(gòu)單元和親水基團(tuán)協(xié)同作用,能夠更大程度地發(fā)揮喹唑啉類化合物的抗腫瘤作用。

3 結(jié)論

本研究在保留上市藥物拉帕替尼、吉非替尼和埃羅替尼結(jié)構(gòu)單元的基礎(chǔ)上,與具有抗腫瘤活性的靛紅結(jié)構(gòu)單元雜合,同時(shí)引入親水基團(tuán),經(jīng)5步反應(yīng)合成了9個(gè)結(jié)構(gòu)新穎的N-取代靛紅雜合喹唑啉類化合物。利用NMR、IR和HRMS對(duì)反應(yīng)中間體及目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行確定,同時(shí)以4種人腫瘤細(xì)胞為受試細(xì)胞,采用MTT法對(duì)合成的9個(gè)新化合物進(jìn)行了體外抗腫瘤活性測(cè)試。結(jié)果表明,9個(gè)化合物均具有一定的腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性。其中,化合物8a、8b、8e、8g對(duì)4種受試細(xì)胞均表現(xiàn)出較好的增殖抑制作用,優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照拉帕替尼和吉非替尼;其合成原料易得,步驟較為簡(jiǎn)單,路線較為成熟,是具有開發(fā)潛力的抗腫瘤化合物。