宋芷儀,王周平,馬小媛

(1 江南大學(xué) 食品科學(xué)與資源挖掘全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無(wú)錫 214122;2 江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無(wú)錫 214122)

表面增強(qiáng)拉曼(surface-enhanced Raman spectroscopy,SERS)是通過(guò)增強(qiáng)基底的表面等離子共振,引起電磁增強(qiáng),進(jìn)而將拉曼信號(hào)放大的一種技術(shù)[1-2]。它具有靈敏度高、破壞性小、預(yù)處理簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。對(duì)大多數(shù)水溶液樣品來(lái)說(shuō),表面增強(qiáng)拉曼技術(shù)可以大幅度減弱水拉曼散射對(duì)樣品造成的干擾,彌補(bǔ)紅外吸收光譜在這方面的不足。其中,具有特殊形貌的金屬納米粒子可極大地增強(qiáng)附著在金屬納米粒子表面的分子拉曼信號(hào),使表面增強(qiáng)拉曼技術(shù)能夠被廣泛應(yīng)用于化學(xué)、生物、醫(yī)藥、環(huán)境等領(lǐng)域[3-5]。

銅是大多數(shù)真核生物細(xì)胞生理過(guò)程的必需元素,但當(dāng)其濃度過(guò)高時(shí)可引起細(xì)胞氧化應(yīng)激,并通過(guò)形成自由基而對(duì)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA造成直接損傷,進(jìn)而對(duì)肝臟或大腦造成特定損傷[6-7]。研究表明,大腦或肝臟內(nèi)的銅元素穩(wěn)態(tài)失衡會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化,活性氧和丙二醇含量升高,谷胱甘肽含量下降,并對(duì)DNA造成氧化損傷[8-9]。因此,保護(hù)肝臟免受由銅離子濃度升高引起的氧化損傷十分必要。

當(dāng)前,細(xì)胞氧化損傷的傳統(tǒng)檢測(cè)方法主要包括細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)成分的變化檢測(cè)(如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、碳水化合物、DNA等的氧化損傷檢測(cè))、氧化受損細(xì)胞內(nèi)自由基的直接檢測(cè)(包括電子自旋共振法和化學(xué)發(fā)光法)、細(xì)胞內(nèi)總活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)測(cè)定、抗氧化酶測(cè)定等[10]。此外,高劑量ROS會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞壞死,低劑量ROS會(huì)引起細(xì)胞凋亡,因此還可以通過(guò)檢測(cè)氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡反應(yīng)間接判斷細(xì)胞的受損狀態(tài)[11]。然而,由于細(xì)胞受ROS損傷的機(jī)制較為復(fù)雜,目前還沒(méi)有形成標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞氧化損傷檢測(cè)方法。關(guān)于細(xì)胞生物學(xué)方向的氧自由基檢測(cè)還有待發(fā)展出靈敏度更高、選擇性更好的新方法。

基于此,本研究將以銅離子誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷為模型、表面增強(qiáng)拉曼技術(shù)為手段,旨在建立一種檢測(cè)細(xì)胞損傷的拉曼光譜表征法[12]。研究首先通過(guò)種子生長(zhǎng)法制備金納米花作為拉曼檢測(cè)基底,并篩選能增強(qiáng)拉曼信號(hào)的基底;再利用CCK-8法進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測(cè)及Cu2+對(duì)細(xì)胞造成的氧化損傷檢測(cè),建立氧化損傷模型;最后,通過(guò)SERS對(duì)細(xì)胞氧化損傷模型進(jìn)行檢測(cè),進(jìn)而建立一種新的細(xì)胞氧化損傷檢測(cè)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES,C8H18N2O4S)、氯金酸(HAuCl4)、抗壞血酸(AA,C6H8O6)、二水合檸檬酸三鈉(C6H5Na3·2H2O)、無(wú)水乙醇(C2H6O)、氫氧化鈉(NaOH)、二水合氯化銅(CuCl2·2H2O)均為分析純。

人體肝癌細(xì)胞HepG2,購(gòu)自中科院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所;CCK-8試劑,購(gòu)自上海生工生物工程有限公司;超純水,美國(guó)Millipore凈水系統(tǒng);DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素,購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司。

1.2 設(shè)備與儀器

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋,常州市榮冠實(shí)驗(yàn)分析儀器廠;全自動(dòng)雪花制冰機(jī),常熟市雪科電器有限公司;高速離心機(jī),安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;注射泵,保定蘭格恒流泵有限公司;Shimadzu MV-1800型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì),島津(上海)實(shí)驗(yàn)器材有限公司;JEM-2100(200 kV)透射電子顯微鏡,日本電子公司;LabRAM HR 800 共聚焦顯微拉曼光譜儀,法國(guó)HORIBA公司;超純水儀,美國(guó)Millipore公司;恒溫油浴鍋、電熱式磁力攪拌器,鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;超聲波清洗儀,無(wú)錫市科潔超聲電子設(shè)備有限公司;電熱鼓風(fēng)干燥箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;電子天平,奧豪斯儀器(上海)有限公司;SpectraMax M5/M5e酶標(biāo)儀,美國(guó)Molecular Device公司;微量移液器,德國(guó)Eppendorf股份公司;超凈工作臺(tái),蘇州尚田潔凈技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 金種子的合成[13]

所用玻璃器皿及攪拌棒用王水(V濃硝酸∶V鹽酸=1∶3)浸泡12 h以上,超純水沖洗后烘箱烘干。配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的檸檬酸三鈉水溶液和1%的HAuCl4水溶液,備用。三頸燒瓶中加入0.5 mL上述HAuCl4水溶液和49.5 mL去離子水,安裝冷凝回流裝置后,置于120 ℃油浴鍋中加熱并攪拌。待溶液沸騰后繼續(xù)加熱10 min,迅速加入2.5 mL上述檸檬酸三鈉水溶液,加熱攪拌至溶液變?yōu)榫萍t色。撤去熱源,繼續(xù)攪拌冷卻至室溫,得到球狀金種子(AuNPs)。改變檸檬酸三鈉水溶液的添加量,以制備不同尺寸的AuNPs,并用紫外分光光度計(jì)和透射電鏡表征。金種子置于棕色瓶中,于4 ℃冰箱中避光保存。

1.3.2 金納米花的合成[13]

配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的抗壞血酸水溶液和物質(zhì)的量濃度為20 mmol/L的HEPES水溶液(pH為7.4),備用。在50 mL燒杯中依次加入3 mL粒徑為15 nm的金種子、8 mL HEPES水溶液和400 μL抗壞血酸水溶液,冰浴攪拌均勻。另取680 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的HAuCl4水溶液,用去離子水稀釋至10 mL,使用注射泵逐滴加入燒杯中,流速控制在30 滴/min,并保持冰浴攪拌。繼續(xù)冰浴攪拌2 h以上,得到藍(lán)紫色的金納米花膠體溶液。增加HEPES水溶液的添加量至12 mL,得到支角更多、更尖銳的金納米花(AuNFs)。取10 mL金納米花膠體溶液在3 000 r/min條件下離心15 min,去上清液并用1 mL去離子水重懸,使用紫外分光光度計(jì)和透射電鏡表征。

1.3.3 人體肝癌細(xì)胞HepG2的培養(yǎng)

人體肝癌細(xì)胞HepG2使用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 g/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%左右時(shí),進(jìn)行傳代培養(yǎng):將培養(yǎng)皿中原有的細(xì)胞液吸去,加入2 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)進(jìn)行洗滌,重復(fù)2次后加入2 mL胰酶消化液(含0.25%胰蛋白酶、1 mmol/L EDTA和25 mmol/L HEPES的PBS),輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿使消化液均勻鋪在細(xì)胞上層,消化2～3 min,用顯微鏡觀察到細(xì)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大時(shí)吸去消化液,加入2 mL完全培養(yǎng)基終止消化。吸取1～2 mL培養(yǎng)液將培養(yǎng)皿底部貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞全部吹打下后,以1∶2的比例傳代接種細(xì)胞于新培養(yǎng)皿中。

1.3.4 SERS探針和Cu2+的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

取1 mL金納米花重懸液,加入10 μL多肽,搖床中孵育8 h以上,使金納米花被肽鏈修飾。在3 000 r/min條件下離心15 min,去上清液并用1 mL去離子水重懸,備用。將生長(zhǎng)至指數(shù)期的細(xì)胞用胰酶消化,在培養(yǎng)皿中加入2 mL培養(yǎng)基,用移液槍輕輕吹打混勻,得到細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液以每孔100 μL接種至96孔板中,置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h,備用。

將孔板中的培養(yǎng)基吸出,每孔加入100 μL不同質(zhì)量濃度的被多肽修飾的金納米花(0、80、160、240和360 μg/mL),混合均勻。培養(yǎng)8 h后,每孔再加入10 μL CCK-8試劑,輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。最后,將孔板置于450 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)。用同樣方法檢測(cè)不同物質(zhì)的量濃度的Cu2+(0、50、100、150、200 μmol/L)對(duì)細(xì)胞的氧化損傷。細(xì)胞存活率計(jì)算公式為:細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組吸光值-CCK-8本底吸光值)/(對(duì)照組吸光值-CCK-8本底吸光值)×100%。

1.3.5 Cu2+誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷的SERS檢測(cè)

貼壁生長(zhǎng)的HepG2細(xì)胞在加入金納米花的培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h后,將CuCl2溶液加入培養(yǎng)基,使其Cu2+物質(zhì)的量濃度分別為0、50、100、150和200 μmol/L,在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h后,用共聚焦顯微拉曼光譜儀進(jìn)行表征。拉曼光譜儀的參數(shù)設(shè)置如下:激發(fā)波長(zhǎng)為633 nm,掃描范圍為400～1 800 cm-1,物鏡放大倍數(shù)為50,掃描時(shí)間為10 s,循環(huán)次數(shù)為1次,每個(gè)樣品上隨機(jī)選取10個(gè)測(cè)試點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,獲取平均SERS光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 金種子(AuNPs)的表征

圖1是AuNPs的表征結(jié)果。圖1a顯示,AuNPs的紫外吸收峰分別在521 nm (15 nm)和523 nm (25 nm)左右,隨著AuNPs粒徑的增大,能級(jí)間隔減小,對(duì)應(yīng)的吸收峰位將靠近較長(zhǎng)波段,即表面等離子體共振(LSPR)吸收峰會(huì)出現(xiàn)一定程度的紅移,符合AuNPs直徑與其LSPR吸收峰之間的變化規(guī)律[14]。圖1b、1c表明,AuNPs呈尺寸均勻的圓形,且分散性良好。使用Nano Measure對(duì)AuNPs進(jìn)行粒徑統(tǒng)計(jì),結(jié)果如圖1d、1e所示。15 nm AuNPs平均粒徑為15.1±1.1 nm,25 nm AuNPs平均粒徑為25.1±1.5 nm。對(duì)AuNPs進(jìn)行Zeta電位表征,電位值為-25.3 mV,這是因?yàn)闄幟仕岣x子在合成AuNPs的過(guò)程中起到還原劑和穩(wěn)定劑的作用,并使納米顆粒表面帶負(fù)電荷,防止它們?cè)谌芤褐邪l(fā)生聚集。

圖1 金種子表征結(jié)果

2.2 金納米花(AuNFs)的表征

AuNFs的透射電鏡表征結(jié)果如圖2a～2c所示。在支角生長(zhǎng)階段,Au以AuNPs為基礎(chǔ)在表面異向生長(zhǎng),當(dāng)AuNPs粒徑較大時(shí),隨之合成的AuNFs尺寸較大。HEPES作為形貌誘導(dǎo)劑,能夠控制AuNPs表面支角的生長(zhǎng),當(dāng)HEPES濃度較高時(shí),AuNFs表面支角數(shù)量增多,長(zhǎng)度增大。

圖2 金納米花表征結(jié)果

使用Nano Measure對(duì)AuNFs進(jìn)行粒徑統(tǒng)計(jì),結(jié)果如圖2d～2f所示。25 nm AuNPs在高濃度HEPES中介導(dǎo)合成的AuNFs平均粒徑為94.1±1.7 nm,15 nm AuNPs在低濃度HEPES中介導(dǎo)合成的AuNFs平均粒徑為55.3±1.5 nm,15 nm AuNPs在高濃度HEPES中介導(dǎo)合成的AuNFs平均粒徑為74.3±1.9 nm。對(duì)AuNFs進(jìn)行Zeta電位表征,電位值為-29.4 mV。

圖3為不同實(shí)驗(yàn)條件下制備的AuNFs紫外可見(jiàn)吸收光譜圖。通過(guò)比較AuNFs最大吸收峰的位置可知,當(dāng)HEPES的添加量增加后,未離心組的LSPR吸收峰由579 nm紅移至585 nm,離心組的LSPR吸收峰由570 nm紅移至583 nm,符合AuNFs形貌與LSPR吸收峰位置之間的關(guān)系。對(duì)于不規(guī)則的金納米花顆粒,其形貌越復(fù)雜,表面支角越多、越尖銳,LSPR吸收峰紅移越明顯。離心后的AuNFs出現(xiàn)微小的藍(lán)移,同時(shí)吸光度有所下降,這可能是因?yàn)殡x心后除去了粒徑較小的AuNFs以及反應(yīng)后多余的試劑。此外,在未離心組的光譜圖中可以看到,530 nm左右有1個(gè)小峰,這可能是由溶液中殘余的AuNPs造成,也有可能是AuNFs核心等離子體共振與支角等離子體共振模式雜交,從而出現(xiàn)2個(gè)LSPR吸收峰。

圖3 金納米花的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖(15 nm金種子)

由于制備的納米顆粒最終需要進(jìn)入細(xì)胞,材料粒徑過(guò)大不利于細(xì)胞胞吞且容易發(fā)生聚集,故選用15 nm AuNPs在低濃度HEPES中介導(dǎo)的AuNFs作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)材料。

2.3 金納米花SERS探針和Cu2+的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

利用種子生長(zhǎng)法制備的金納米花經(jīng)離心濃縮后質(zhì)量濃度為1 600 μg/mL,將其加入完全DMEM高糖培養(yǎng)基中混勻,分別配制成質(zhì)量濃度為0(空白對(duì)照)、80、160、240、320 μg/mL的細(xì)胞培養(yǎng)液,與指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞混合培養(yǎng)8 h,用CCK-8法進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測(cè),計(jì)算細(xì)胞存活率。由圖4a可知,當(dāng)金納米花質(zhì)量濃度較低時(shí),細(xì)胞存活率較高,金納米花質(zhì)量濃度增加,細(xì)胞存活率逐漸降低,說(shuō)明材料本身也對(duì)細(xì)胞具有一定程度的生長(zhǎng)抑制作用。由于金納米花是拉曼增強(qiáng)基底,為了獲得較高的拉曼信號(hào)并盡量降低對(duì)細(xì)胞的損傷,故選擇質(zhì)量濃度為160 μg/mL的金納米花作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)材料。

圖4 CCK-8細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果

以Cu2+作為細(xì)胞的氧化損傷誘導(dǎo)劑,分別配置Cu2+物質(zhì)的量濃度為0、50、100、150、200 μmol/L的完全DMEM高糖培養(yǎng)基,與細(xì)胞共培養(yǎng)8 h后進(jìn)行CCK-8細(xì)胞毒性檢測(cè),計(jì)算細(xì)胞存活率。由圖4b可知,Cu2+的存在對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生顯著損傷,隨著Cu2+物質(zhì)的量濃度的升高,細(xì)胞存活率大大降低,這可能是由于Cu2+破壞了細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡,誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng),進(jìn)而造成不可逆損傷。因此,可以利用Cu2+誘導(dǎo)的細(xì)胞作為氧化損傷模型,用于進(jìn)一步的拉曼檢測(cè)。

2.4 Cu2+誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷的SERS檢測(cè)分析

由圖5可知,HepG2細(xì)胞使用不含金納米花的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h后,基本無(wú)明顯拉曼信號(hào)峰,金納米花本身也無(wú)明顯拉曼信號(hào)峰。將一定濃度的金納米花加入到培養(yǎng)基中,與HepG2細(xì)胞共同培養(yǎng)6 h后進(jìn)行拉曼信號(hào)檢測(cè),得到數(shù)個(gè)較為明顯的信號(hào)峰。這表明細(xì)胞對(duì)金納米花進(jìn)行胞吞,使金納米花成功進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部。同時(shí),信號(hào)峰反映出細(xì)胞內(nèi)的部分物質(zhì),HepG2細(xì)胞的各拉曼光譜峰所對(duì)應(yīng)的物質(zhì)歸屬如表1所示。

表1 拉曼光譜峰對(duì)應(yīng)的物質(zhì)歸屬[15]

圖5 HepG2細(xì)胞的拉曼光譜圖

2.5 Cu2+誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷的SERS表征

分別用Cu2+物質(zhì)的量濃度為0、50、100、150、200 μmol/L的DMEM完全培養(yǎng)基處理細(xì)胞6 h和12 h,并進(jìn)行拉曼光譜表征,結(jié)果如圖6所示?？梢钥闯?不同Cu2+處理時(shí)間的HepG2細(xì)胞的平均拉曼光譜圖存在較大差異,相比于6 h的處理時(shí)間,處理12 h細(xì)胞的SERS峰強(qiáng)度整體偏弱,說(shuō)明隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞的受損程度隨之變大。

對(duì)相同物質(zhì)的量濃度Cu2+處理不同時(shí)間的HepG2細(xì)胞進(jìn)行拉曼光譜檢測(cè),所得拉曼光譜作歸一化處理,進(jìn)行差譜分析,結(jié)果如圖7所示。可以看出,經(jīng)不同物質(zhì)的量濃度Cu2+處理后,HepG2細(xì)胞均出現(xiàn)了不同程度的損傷。

糖類的變化:細(xì)胞中糖原(490 cm-1)和碳水化合物(1 153 cm-1)的含量均發(fā)生變化,隨著細(xì)胞氧化損傷程度的加深,糖類物質(zhì)含量不斷減少。

核酸的變化:相比于6 h處理時(shí)間,經(jīng)12 h處理的HepG2細(xì)胞在1 083 cm-1、788 cm-1處的光譜強(qiáng)度均有所減弱。1 083 cm-1處的峰代表DNA骨架磷酸二酯基團(tuán)的對(duì)稱伸縮振動(dòng),788 cm-1處的峰代表DNA骨架磷酸根的對(duì)稱伸縮振動(dòng)?？梢?jiàn),隨著細(xì)胞氧化損傷程度的加深,DNA骨架斷裂,雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,核酸含量減少。

脂類的變化:1 450 cm-1處的峰代表脂質(zhì)CH2和CH3的振動(dòng)峰,從拉曼光譜圖中可以看出,細(xì)胞中脂質(zhì)含量相對(duì)較少且變化不大。這可能是因?yàn)镠epG2細(xì)胞本身生長(zhǎng)迅速、耗能快,脂質(zhì)提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需能量,難以在癌細(xì)胞內(nèi)積累。

蛋白質(zhì)的變化:蛋白質(zhì)分子的苯丙氨酸和酪氨酸殘基中的C—O伸縮振動(dòng)峰出現(xiàn)在1 174 cm-1附近,蛋白酰胺Ⅰ的α螺旋結(jié)構(gòu)出現(xiàn)在1 655 cm-1處,肽鏈骨架C—C鍵振動(dòng)峰位于937 cm-1處,這些峰均出現(xiàn)了相應(yīng)的變化,說(shuō)明細(xì)胞氧化損傷對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)生了氫鍵破壞、二硫鍵斷裂和脫酰胺作用等,蛋白質(zhì)發(fā)生空間結(jié)構(gòu)改變,造成了生物活性功能的改變。

糖類、核酸、脂類和蛋白質(zhì)的變化均可能改變細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能,使之無(wú)法維持正常生理活動(dòng),從而引發(fā)各種疾病。

3 結(jié)論

本研究建立了一種基于無(wú)標(biāo)記納米材料增強(qiáng)拉曼光譜對(duì)細(xì)胞氧化損傷進(jìn)行檢測(cè)的方法。制備出有多肽修飾的金納米花作為拉曼增強(qiáng)基底,成功觀察到金納米花進(jìn)入細(xì)胞,且達(dá)到信號(hào)增強(qiáng)的效果。利用CCK-8法進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測(cè),確定金納米花作為拉曼增強(qiáng)基底可以在盡量不損傷細(xì)胞的情況下達(dá)到良好的拉曼增強(qiáng)效果,其適宜的質(zhì)量濃度為160 μg/mL。進(jìn)一步檢測(cè)Cu2+對(duì)HepG2細(xì)胞造成的氧化損傷,發(fā)現(xiàn)經(jīng)Cu2+誘導(dǎo)后,細(xì)胞出現(xiàn)明顯損傷和死亡,且隨著Cu2+物質(zhì)的量濃度的提高,細(xì)胞受損程度增大。最后,建立了Cu2+誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷模型,并獲得不同Cu2+處理?xiàng)l件下細(xì)胞的拉曼光譜,發(fā)現(xiàn)經(jīng)氧化處理后的細(xì)胞均受到不同程度的損傷,細(xì)胞內(nèi)的糖類、核酸、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等物質(zhì)均出現(xiàn)了一定程度的改變,對(duì)機(jī)體造成了損傷。