羅 璇，馬才學(xué)，沈瑞敏

（武漢設(shè)計(jì)工程學(xué)院 食品與生物科技學(xué)院，湖北 武漢 430205）

魚(yú)類(lèi)食品是一種高蛋白、低脂肪的菜肴，深受消費(fèi)者喜愛(ài)[1-2]，鮮活魚(yú)類(lèi)容易腐敗，難以長(zhǎng)途運(yùn)輸，所以將魚(yú)肉進(jìn)行發(fā)酵制成魚(yú)腐乳，不僅可以提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，改善口感，形成特有的風(fēng)味，還能延長(zhǎng)食品的保藏期[3]。魚(yú)類(lèi)發(fā)酵食品有許多種類(lèi)，泰國(guó)魚(yú)膏是一種富含蛋白質(zhì)和多肽的佐餐食品[4]，貴州魚(yú)醬酸是一種開(kāi)胃的半固態(tài)調(diào)味料[5]，魚(yú)露是將原料魚(yú)和食鹽混合發(fā)酵三個(gè)月獲得的一種類(lèi)似于醬油的調(diào)味料[6-7]。

目前，有許多關(guān)于傳統(tǒng)豆腐乳理化指標(biāo)、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的研究報(bào)道[8-11]，但是以冷凍魚(yú)糜為原料制作魚(yú)腐乳的研究較少。大豆、玉米或紅花籽油可以提高金線魚(yú)魚(yú)糜的凝膠品質(zhì)和風(fēng)味[12]；盛宇華等[13]在白腐乳后發(fā)酵過(guò)程中，分別加入酸性、中性或堿性的蛋白酶，探究了不同發(fā)酵溫度下腐乳的理化性質(zhì)，且產(chǎn)品風(fēng)味較好。

生姜蛋白酶是一種易于獲取的天然植物蛋白酶[14]，其降解的水解物具有多種生物學(xué)效應(yīng)，包括抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶、促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和抗抑郁活性[15]，相比酸性和堿性蛋白酶，生姜蛋白酶制備的魚(yú)皮明膠水解物對(duì)二肽酶-IV的體外抑制活性更顯著，1,1-二苯基-2-苦基肼自由基清除活性也最高[16-17]。

本試驗(yàn)以金線魚(yú)魚(yú)糜為原料，接種雅致放射性毛霉（Actinomucor elegans）進(jìn)行發(fā)酵，輔助添加生姜蛋白酶制作金線魚(yú)腐乳，對(duì)其發(fā)酵工藝及理化性質(zhì)進(jìn)行研究，旨在為優(yōu)化酶促魚(yú)腐乳工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金線魚(yú)冷凍魚(yú)糜：購(gòu)于淘寶佰騰旗艦店；鮮生姜：市售；雅致放射性毛霉（Actinomucor elegans）：武漢設(shè)計(jì)工程學(xué)院食品與生物科技學(xué)院試驗(yàn)室保存。

L-酪氨酸、干酪素、福林酚、10%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、四甲基乙二胺、過(guò)硫酸銨、Tris-HCl、丙烯酰胺；三氯乙酸、乙酰丙酮、氫氧化鈉、冰乙酸、甲醛、無(wú)水碳酸鈉、三水合乙酸鈉：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

UV2150紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司；JP-031S超聲波清洗儀：深圳潔盟清洗儀器有限公司；DYCZ-24DN垂直板電泳儀：北京六一生物科技有限公司；PAL-1（NFC）型手持?jǐn)?shù)顯糖度計(jì)：浙江托普云農(nóng)科技股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 金線魚(yú)腐乳制備[18]

冷凍魚(yú)糜在室溫條件下解凍后添加少量蒸餾水，用玻璃棒擂潰5 min，轉(zhuǎn)移至燒杯，準(zhǔn)確稱質(zhì)量，加入其質(zhì)量3%的NaCl，鹽擂10 min，加入其質(zhì)量10%的淀粉攪拌，繼續(xù)擂潰10 min，將擂潰好的樣品裝入已消毒的長(zhǎng)方形鋁盒中，蓋上盒蓋，45 ℃水浴加熱1 h，再置于90 ℃水浴加熱20 min，取出迅速冷卻至室溫后，放入冰箱4 ℃冷藏12 h得到金線魚(yú)腐乳白坯。將金線魚(yú)腐乳白坯切成1×3×3 cm的方塊，刀口順直，規(guī)格整齊，擺放在經(jīng)體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇消毒的塑料盒中，碼放整齊，白坯四周留有空隙，在白坯表面均勻?yàn)⑸?%毛霉孢子懸液（6×107個(gè)/mL），27 ℃條件下培養(yǎng)72 h。將金線魚(yú)腐乳毛坯撮毛，記錄金線魚(yú)腐乳塊總質(zhì)量，加入豆腐塊總質(zhì)量12%的食鹽腌制，廣口瓶底層先灑一層鹽，然后一層豆腐塊一層鹽，越往上層鹽越多，碼完廣口瓶容積3/4即可撒上最后一層鹽。最后在瓶口處裹上保鮮膜。

腌制約22 h得到鹽坯，設(shè)置試驗(yàn)組和空白組，試驗(yàn)組向廣口瓶中添加生姜蛋白酶粗酶液（70 mL/500 g鹽坯），空白組加入等體積的10%食用乙醇，用保鮮膜包裹瓶口，分別在27 ℃和35 ℃條件下發(fā)酵。

1.3.2 金線魚(yú)腐乳前發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

試驗(yàn)分別考察前發(fā)酵時(shí)間（24 h、48 h、72 h、96 h、120 h）；發(fā)酵溫度（23 ℃、25 ℃、27 ℃、29 ℃、31 ℃）；菌懸液接種量（3%、4%、5%、6%、7%）對(duì)前發(fā)酵工藝條件的影響，以蛋白酶活力為指標(biāo)，確定影響響應(yīng)值的3個(gè)較優(yōu)試驗(yàn)因素參數(shù)范圍。

1.3.3 金線魚(yú)腐乳前發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

為確定金線魚(yú)腐乳前發(fā)酵最佳發(fā)酵工藝條件，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇金線魚(yú)腐乳前發(fā)酵時(shí)間（A）、發(fā)酵溫度（B）、菌懸液接種量（C）為影響因素，以蛋白酶活力（Y）為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，運(yùn)用Design-Expert 8.6.0.1軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，考察各因素間交互作用對(duì)金線魚(yú)腐乳前發(fā)酵條件的影響，響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 金線魚(yú)腐乳前發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for prefermentation conditions optimization of goldthread fish sufu

1.3.4 生姜蛋白酶粗酶液的制備

根據(jù)團(tuán)隊(duì)前期研究成果[21]，稱取外形完整、色澤均一的新鮮生姜50 g，削皮并切成小塊，放入研缽中，加入100 mL 0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）（pH=6.0），緩慢研磨20 min，過(guò)濾，再用250 mL燒杯收集濾液，放入冰箱冷藏，30 min后以6 000 r/min離心10 min，去除沉淀，合并上清液即為生姜蛋白酶粗酶液。

1.3.5 金線魚(yú)腐乳預(yù)處理

將腐乳在無(wú)菌條件下取樣，于-20 ℃的冰箱中冷凍12 h，然后在真空冷凍干燥機(jī)中干燥2 h，碾碎后過(guò)50 目篩，稱取1 g腐乳，玻璃棒搗碎，加入10 mL的磷酸緩沖液（pH=7.2），以8 000 r/min離心10 min，用膠頭滴管收集上清液后，于冰箱冷藏。

1.3.6 測(cè)定方法

毛坯氨基酸態(tài)氮的測(cè)定：依據(jù)GB/T 5009.235—2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》[19]中的比色法檢測(cè)腐乳樣品中的氨基酸態(tài)氮。

蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：用干燥潔凈的藥匙取間隔發(fā)酵1 d的腐乳，研磨均勻后準(zhǔn)確稱取2 g，加入4 mL的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液（pH=7.2），40 ℃超聲提取15 min，以8 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取1 mL沉淀物溶液于試管中，繪制考馬斯亮藍(lán)G-250標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算腐乳試樣中蛋白質(zhì)含量。

使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）分析腐乳中大分子蛋白質(zhì)的降解情況。配制5%濃縮膠4 mL和12%分離膠15 mL，上樣量為10 μL，考馬斯亮藍(lán)R-250避光染色12 h，脫色4 h。

前發(fā)酵時(shí)期蛋白酶的提取及活力測(cè)定：將毛坯取樣后置于-20 ℃冰箱24 h，干燥后粉碎，稱取1 g樣品，加入10 mL磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.2），玻璃棒攪拌均勻，40 ℃水浴超聲提取30 min，經(jīng)8 000 r/min離心10 min，取上清液備用。參照GB/T 23527.1—2023《酶制劑質(zhì)量要求第1部分：蛋白酶制劑》[20]中的福林法檢測(cè)腐乳中的蛋白酶活，將在40 ℃水浴中1 g樣品1 min內(nèi)水解酪蛋白產(chǎn)生酪氨酸的微克數(shù)，定義為1個(gè)酶活單位，U/g。

后發(fā)酵時(shí)期腐乳理化指標(biāo)的測(cè)定：用pH計(jì)測(cè)定處理后的腐乳樣品，手持糖度儀測(cè)定試樣可溶性固形物含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 金線魚(yú)腐乳前發(fā)酵時(shí)期氨基酸態(tài)氮的測(cè)定

由圖1可知，金線魚(yú)腐乳發(fā)酵前的氨基酸態(tài)氮含量極低，為0.13%，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，金線魚(yú)腐乳白坯的氨基酸態(tài)氮含量明顯增加，前發(fā)酵72 h時(shí)，上升至最高值8.04%，說(shuō)明毛霉在適宜環(huán)境下生長(zhǎng)并分泌了許多蛋白酶，充分水解金線魚(yú)腐乳中的蛋白質(zhì)，使得氨基酸態(tài)氮含量持續(xù)上升。根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)資料得知腐乳前發(fā)酵的時(shí)間在60～84 h比較合理[18]，如果前發(fā)酵時(shí)間超過(guò)84 h，繼續(xù)發(fā)酵，不但會(huì)使氨基酸態(tài)氮含量降低，毛霉菌絲也會(huì)出現(xiàn)老化，造成腌坯時(shí)腐乳塊硬度小，易碎不成形的現(xiàn)象，影響后發(fā)酵進(jìn)程，所以選擇72 h為最佳發(fā)酵時(shí)間。

圖1 金線魚(yú)腐乳前發(fā)酵過(guò)程氨基酸態(tài)氮含量的變化Fig.1 Changes of amino acid nitrogen contents during pre-fermentation process of goldthread fish sufu

2.2 金線魚(yú)腐乳前發(fā)酵時(shí)期SDS-PAGE結(jié)果分析

從圖2可以看出，發(fā)酵24 h和48 h的金線魚(yú)腐乳中仍有肌動(dòng)蛋白，而發(fā)酵至72 h的金線魚(yú)腐乳中肌動(dòng)蛋白條帶基本看不清，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，25～35 kDa的小分子蛋白條帶明顯增多，說(shuō)明毛霉在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生了大量蛋白酶，快速提升水解大分子蛋白質(zhì)的速率。經(jīng)過(guò)發(fā)酵，蛋白質(zhì)被分解成小分子肽或氨基酸。

圖2 金線魚(yú)腐乳前發(fā)酵過(guò)程蛋白質(zhì)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果Fig.2 SDS-PAGE results of protein during pre-fermentation of goldthread fish sufu

2.3 金線魚(yú)腐乳前發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)蛋白酶活力的影響

由圖3可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，金線魚(yú)腐乳蛋白酶活力呈先上升后下降的趨勢(shì)，72 h時(shí)達(dá)到峰值，之后快速下降，發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)使得菌絲開(kāi)始老化，分泌蛋白酶的性能大幅下降，其他代謝產(chǎn)物的積累改變了菌液的pH值，超出了菌體生長(zhǎng)的最適pH范圍，最終影響菌體的代謝機(jī)制和產(chǎn)物活性，所以應(yīng)該將發(fā)酵時(shí)間控制在72 h為宜。

圖3 前發(fā)酵時(shí)間對(duì)蛋白酶活力的影響Fig.3 Effect of pre-fermentation time on protease activity

2.3.2 發(fā)酵溫度對(duì)蛋白酶活力的影響

由圖4可知，隨發(fā)酵溫度的升高，金線魚(yú)腐乳蛋白酶活力呈先上升后下降的趨勢(shì)，27 ℃時(shí)達(dá)到最大值，之后呈下滑趨勢(shì)，說(shuō)明升高溫度會(huì)影響菌體自身的生理代謝和分泌機(jī)制，各種蛋白酶的分泌受到了阻礙，其他代謝產(chǎn)物累積，縮短了菌體生長(zhǎng)曲線中的穩(wěn)定期，所以發(fā)酵溫度應(yīng)控制在27 ℃。

圖4 前發(fā)酵溫度對(duì)蛋白酶活力的影響Fig.4 Effect of pre-fermentation temperature on protease activity

2.3.3 菌懸液接種量對(duì)蛋白酶活力的影響

由圖5可知，隨菌懸液接種量的增加，金線魚(yú)腐乳蛋白酶活力呈先上升后下降的趨勢(shì)，接種量為5%時(shí)達(dá)到最大值，此后接種量加大，即每毫升液體中孢子數(shù)增多，金線魚(yú)腐乳蛋白酶活力數(shù)值逐步降低?？赡苁蔷鶠榫w生長(zhǎng)需要消耗大量的營(yíng)養(yǎng)，有許多次級(jí)代謝產(chǎn)物生成，破環(huán)了毛霉適宜的生長(zhǎng)環(huán)境，菌體提前進(jìn)入穩(wěn)定期或衰亡期，對(duì)蛋白酶活力有一定的負(fù)面影響，所以菌懸液接種量應(yīng)控制在5%左右。

圖5 菌懸液接種量對(duì)蛋白酶活力的影響Fig.5 Effect of bacterial suspension inoculum on protease activity

2.4 金線魚(yú)腐乳前發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面結(jié)果與分析

以金線魚(yú)腐乳前發(fā)酵時(shí)間（A）、發(fā)酵溫度（B）、菌懸液接種量（C）為評(píng)價(jià)因素，以蛋白酶活力（Y）為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 金線魚(yú)腐乳前發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface tests for pre-fermentation conditions optimization of goldthread fish sufu

對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸擬合，得到多項(xiàng)式方程為：

Y=-1 629.734+2.439A+93.361B+119.105C-0.003AB+0.049AC-0.346BC-0.017A2-1.674B2-10.565C2

從表3可知，失擬項(xiàng)P=0.104 2＞0.05，不顯著，模型P值＜0.001，顯著，相關(guān)系數(shù)R2=0.988 5，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.973 8，兩數(shù)之差的絕對(duì)值小于0.2，可用來(lái)預(yù)測(cè)實(shí)際操作中響應(yīng)值的變化情況。試驗(yàn)中的3個(gè)因素對(duì)模型3D曲面的影響皆為極顯著（P＜0.01）。由F值可知，3個(gè)因素對(duì)蛋白酶活力的影響次序?yàn)椋壕鷳乙航臃N量＞發(fā)酵時(shí)間＞發(fā)酵溫度。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

3個(gè)因素間交互作用對(duì)蛋白酶活力影響的響應(yīng)面及等高線見(jiàn)圖6。

圖6 發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度和菌懸液接種量間交互作用對(duì)金線魚(yú)腐乳蛋白酶活力影響的響應(yīng)面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between fermentation time, temperature and inoculum of bacterial suspension on protease activity

由圖6可知，3個(gè)因素交互作用結(jié)果與方差分析的結(jié)論一致。預(yù)測(cè)優(yōu)化金線魚(yú)腐乳前發(fā)酵條件為：發(fā)酵時(shí)間78.34 h，發(fā)酵溫度27.25 ℃，菌懸液接種量5.37%。在此條件下，金線魚(yú)腐乳蛋白酶活力的預(yù)測(cè)值為57.62 U/g。

為驗(yàn)證軟件的預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)實(shí)際值之間的相似度，同時(shí)顧及實(shí)際生產(chǎn)狀況，調(diào)整前發(fā)酵條件為：發(fā)酵時(shí)間、溫度和菌懸液接種量分別為78 h、27 ℃和5.4%。在此優(yōu)化條件下，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得到蛋白酶活力實(shí)際值為55.46 U/g，與預(yù)測(cè)值相差不大，證明了此模型的合理性和可行性。

2.5 金線魚(yú)腐乳后發(fā)酵時(shí)期理化指標(biāo)的變化

2.5.1 金線魚(yú)腐乳后發(fā)酵時(shí)期氨基酸態(tài)氮含量變化

由圖7可知，后發(fā)酵1～6 d內(nèi)添加了生姜蛋白酶的兩個(gè)試驗(yàn)組的氨基酸態(tài)氮含量明顯高于兩組對(duì)應(yīng)溫度的空白組，說(shuō)明生姜蛋白酶粗酶液的添加，加快了酶促反應(yīng)，促進(jìn)了蛋白質(zhì)的水解，提高了氨基酸態(tài)氮含量。而6～8 d內(nèi)，27 ℃的生姜蛋白酶添加試驗(yàn)組顯著高于35 ℃的試驗(yàn)組和其他兩組空白組，分析原因是較高的發(fā)酵溫度影響了生姜蛋白酶的活力，進(jìn)而影響其催化功效。27 ℃的生姜蛋白酶添加試驗(yàn)組在8 d后發(fā)酵后氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到最高值9.05%，說(shuō)明生姜蛋白酶實(shí)驗(yàn)組在27 ℃進(jìn)行后發(fā)酵有利于金線魚(yú)腐乳中蛋白質(zhì)的水解，提高了氨基酸態(tài)氮含量，縮短發(fā)酵周期。

圖7 金線魚(yú)腐乳后發(fā)酵時(shí)期氨基酸態(tài)氮含量變化Fig.7 Changes of amino acid nitrogen contents during postfermentation process of goldthread fish sufu

2.5.2 金線魚(yú)腐乳后發(fā)酵時(shí)期pH值的變化

由圖8可知，后發(fā)酵溫度為27 ℃或35 ℃時(shí)，添加了生姜蛋白酶的試驗(yàn)組腐乳樣品的pH值幾乎都低于空白組，說(shuō)明生姜蛋白酶加快咸坯中的蛋白質(zhì)分解成谷氨酸、天冬氨酸等酸性氨基酸，生成精氨酸、賴氨酸和亮氨酸等堿性氨基酸的含量較少，此外脂肪的分解會(huì)產(chǎn)生蘋(píng)果酸、延胡索酸、檸檬酸、琥珀酸、乙酸等酸性物質(zhì)導(dǎo)致pH值下降[22-25]。隨著發(fā)酵天數(shù)的增加，部分氨基酸發(fā)生脫氨反應(yīng)，對(duì)pH值有一定的影響。35 ℃后發(fā)酵條件下腐乳的pH值較27 ℃發(fā)酵時(shí)高，添加生姜蛋白酶組的腐乳pH值較未添加組的低。

圖8 金線魚(yú)腐乳后發(fā)酵時(shí)期pH值的變化Fig.8 Changes of pH during post-fermentation process of goldthread fish sufu

2.5.3 金線魚(yú)腐乳后發(fā)酵時(shí)期可溶性固形物含量變化

由圖9可知，在27 ℃和35 ℃的后發(fā)酵溫度條件下，空白組和試驗(yàn)組的腐乳可溶性固形物含量的變化趨于一致，試驗(yàn)組腐乳中的蛋白質(zhì)被快速降解成小分子氨基酸和多肽，比空白組的降解速率快，所以添加了生姜蛋白酶的試驗(yàn)組的可溶性固形物含量相對(duì)較高。

圖9 金線魚(yú)腐乳后發(fā)酵時(shí)期可溶性固形物含量變化Fig.9 Changes of the soluble solid contents during post-fermentation process of goldthread fishsufu

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以金線魚(yú)魚(yú)糜為原料，制作成金線魚(yú)腐乳，檢測(cè)氨基酸態(tài)氮含量，分析腐乳中蛋白質(zhì)降解情況，優(yōu)化前發(fā)酵工藝參數(shù)，在后發(fā)酵時(shí)期加入生姜蛋白酶液，分別在27 ℃和35 ℃下發(fā)酵，探究氨基酸態(tài)氮、pH值、可溶性固形物的變化規(guī)律，為優(yōu)化金線魚(yú)腐乳前發(fā)酵工藝和酶促后發(fā)酵提供理論依據(jù)。結(jié)果表明，前發(fā)酵時(shí)期，金線魚(yú)腐乳的氨基酸態(tài)氮含量逐漸增加，用凝膠成像系統(tǒng)觀察SDS-PAGE的電泳結(jié)果可知：發(fā)酵72 h的腐乳中分子質(zhì)量較大的蛋白條帶明顯減弱。以毛坯中蛋白酶活力為因變量，先開(kāi)展單因素試驗(yàn)，再運(yùn)用Design Expert 12.0響應(yīng)面法優(yōu)化前發(fā)酵條件，得到最優(yōu)前發(fā)酵條件為：發(fā)酵時(shí)間78 h，發(fā)酵溫度27 ℃和菌懸液接種量5.4%。在此優(yōu)化條件下，蛋白酶活力為55.46 U/g。后發(fā)酵階段，添加生姜蛋白酶試驗(yàn)組的氨基酸態(tài)氮含量普遍大于空白組，pH值小于對(duì)照組，可溶性固形物含量略高于空白組。說(shuō)明了生姜蛋白酶可以降解咸坯中的蛋白質(zhì)，產(chǎn)生更多酸性氨基酸和多肽，證實(shí)了生姜蛋白酶的催化功效。且27 ℃更有利于生姜蛋白酶的催化效果。